Summary
ここでは、超スペクトルイメージングシステムを用いて、発光ハイパースペクトルイメージングデータを取得し、ランタニド系単結晶の光学異方性の特徴を解析するプロトコルを紹介する。
Abstract
本研究では、発光ランタニド(Ln3+)ベースの分子単結晶の解析におけるハイパースペクトルイメージング(HSI)の新規応用プロトコルについて説明する。代表的な例として、我々は、UV励起の下で明るい可視放出を示すヘテロダイコンニルベース複合体[TbEu(bpm)(tfaa)6](bpm=2,2'-ビピリミジン、tfaa-=1,1,1-トリフルオロアセチルアセトネート)の単結晶を選んだ。6–HSIは、得られた画像の各画素からのスペクトル情報と発光構造の2次元空間イメージングを組み合わせた新たな技術である。具体的には、[Tb-Eu]複合体の単結晶上のHSIは、研究された結晶に沿って異なる点で発光強度の変動を明らかにする局所スペクトル情報を提供した。これらの変化は、結晶中に存在する光学異方性に起因し、これは結晶構造の各方向におけるLn3+イオンの異なる分子パッキングから生じる。本明細書に記載するHSIは、分子材料の分光空間的調査に対するこのような技術の適合性の一例である。しかし重要なことに、このプロトコルは、他の種類の発光材料(ミクロンサイズの分子結晶、無機微粒子、生体組織のナノ粒子、標識された細胞など)に容易に拡張することができ、構造特性関係のより深い調査のための多くの可能性を開くことができます。最終的には、バイオイメージングから、波導管や光電子デバイスなどの技術アプリケーションまで、幅広い用途に向けた先端材料のエンジニアリングに活用される知識を提供します。
Introduction
ハイパースペクトルイメージング(HSI)は、各x-y座標があらゆる種類の分光法、すなわち光発光、吸収および散乱分光1、2、32,3に基づくスペクトル情報を含む空間マップを生成する技術である。1その結果、3次元データの集合(「ハイパースペクトルキューブ」とも呼ばれる)が得られ、x-y座標は空間軸、z座標は分析されたサンプルからのスペクトル情報である。したがって、ハイパースペクトルキューブには空間情報とスペクトル情報の両方が含まれているため、従来の分光法よりも詳細な分光分析を行う。HSIはリモートセンシングの分野(例えば、地質学、食品産業4)で長年知られてきましたが,6,7,、最近ではナノ材料22、5、5または生体医学用アプリケーション用プローブの特性評価のための革新的な技術として登場しました。一般的に言うと、UV/可視/近赤外(NIR)ドメインに限定されるものではなく、例えば異なる材料の元素分布を特徴付けるためにX線などの他の放射線源を使用して拡張することもできます。 8また、光発光マッピングは、単層MoS210の光学特性をプローブするラマンマッピングと組み合わされている。しかし、報告された光学,HSIの用途の中で、ランタニド系材料,11、12、13、14、15、16、17のHSIに関する例はまだごくわずかです。11,12,13,14,151617例えば、組織6における癌の検出、生体組織における光貫通深度の解析7、多重化生物学的イメージング3、ハイブリッド系11における多成分エネルギー移動の解析、およびナノ粒子12の分光特性における凝集誘導変化の調査を挙げられる。明らかに、HSIの魅力は、環境特異的な発光に関する知識を生成し、プローブに関する空間情報とスペクトル情報を同時に提供する適合性から生じます。
この強力な技術を利用して、我々はヘテロ二次核結核3+ -Eu3+単結晶の光学異方性を3+調査するためのプロトコルを記述する [TbEu(bpm)(tfaa)6] (図 1a)13.観察された光学異方性は、異なる結晶学的方向(図1b)におけるLn3+イオンの異なる分子パッキングから生じ、結晶面が明るい状態を示すものもあれば、光発光が薄暗くなるものもある。結晶の特定の面での発光強度の増加は、Ln3+···Ln3+イオン距離は最短の 13 .
これらの結果に動機づけられて、我々はHSIを通じた光学異方性を分析するための詳細な方法論の確立を提案し、特定の分子配置18,19,19に起因するイオンイオンエネルギー伝達プロセスおよび調整可能な発光特性をよりよく理解するための道を開く。これらの構造特性関係は、ナノおよびマイクロスケールでの導波システムおよび光磁気記憶装置を含むが、これに限定されない革新的な光学材料設計のための重要な側面として認識されてきた- より効率的で小型化された光学系20の需要に対処する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意: イメージャーを操作するときに常に使用されている励起波長に固有の安全ゴーグルを使用することをお勧めします。
1. ハイパースペクトル顕微鏡の構成
注: ハイパースペクトルイメージングシステムの概要を図 2aに示し、イメージャーの主要コンポーネントについて説明します。イメージングシステムは、サンプルからの可視または近赤外(NIR)発光の検出に使用できます。どの検出が必要か(可視またはNIR)に応じて、ライトは2つの異なる光の経路を通過します(図2e)。異なるビーム旋回立方体と二色性フィルタキューブ(光学キューブ)の組み合わせは、それぞれのパスを選択するために、機器内の特定の位置に配置する必要があります。
- イメージングシステムに接続されているコンピュータの電源を入れます。コンピュータのモニタの電源を入れます。
- 適切な光キューブ構成を設定します (図 2b,c)。
注: ここでは、UV励起および可視放出検出を用いたHSIマッピング用のイメージャー構成(光キューブ構成)について説明する。ただし、分析したサンプルに応じて、NIR励起や可視またはNIR発光検出のために変更することも可能です。例については、「代表的な結果」を参照してください。- 顕微鏡ステージ(図2aの1)から、検出器に向かう発光ビーム経路(図2aの3)に続いて、光学キューブの最初の位置(図2bの4)を空けて、共焦点顕微鏡の光学立方体(DFM1-P01)を図2bの5と示す位置に置き、サンプルからの放出が可視光路を通って向けられるようにする。
- 検出器に向かって光路に沿って見て、可視光ミラーとフィルタを含む可視光立方体(CM1-P01)を配置して、可視放出を検出経路に向け、図2bの6と示す位置に配置する。
- 検出器に向かって経路を続け、共焦点ピンホール光キューブ(DFM1-P01)を図2bの7と示す位置に配置し、可視光検出経路を通して光を導く。次に、経路をたどって、放射光が検出器に到達するように図2cの位置8に共焦点分光計(DFM1-P01)を配置する。
- HSIマッピングの場合、使用されるピンホールのサイズに合わせて検出器スリット開口部(図2cの9)を手動で制御します(50mm程度が最適)。
- PHySpecソフトウェアで、ピンホールの絞りを選択します(図 3の 5)。
注: ピンホールの開口部が小さいほど、信号強度を犠牲にして HSI 解像度が優れています。
- スイッチ(図2dの10)をONの位置に置いて、広帯域ランプ(図2d、差し込み)をオンにします。励起光の強度を制御するには、11(図2d)で示されるノブを、より高い(32 -最低強度)または低い値(1 - 最高強度)に回します。セットアップ中は、広帯域ランプシャッター(図2dの12)を閉じておきます。
注: 値が高いほど、ランプが発する電力密度の減衰が高くなり、低い値は減衰の低い減衰に対応します。 - スイッチをONの位置に設定して、以下の順序で次のハードウェアをオンにします。
- ThorLabs モーションコントローラの電源を入れます。
- ニコン電源をオンにします。
- ASI コントローラの電源を入れます。
- Galvo コントローラの電源を入れます。
- ProEm検出器をオンにします。
- ベイスペック検出器をオンにします。
- コンピュータで、アイコンをダブルクリックしてPHySpecソフトウェアを開きます。
- IMA Upconversionシステムを初期化するためにキーボードのF8キーを押して、システムへの接続ウィンドウのOKボタンをクリックします。
注: ステップ 1.5.1.[システム] タブをクリックし、[接続] をクリックして[システムに接続] ウィンドウに移動することもできます。次に、OKボタンをクリックして、イメージングシステムをソフトウェアに接続することができます。 - 図 3に示すように、すべてのメニューが、画面の左側にあるインターフェイス (カラー カメラ、ProEm、および Bayspec)と計器コントロールパネルに表示されていることを確認します。
- IMA Upconversionシステムを初期化するためにキーボードのF8キーを押して、システムへの接続ウィンドウのOKボタンをクリックします。
2. [TbEu(bpm)(tfaa)6] 単結晶のハイパースペクトルイメージング
- サンプルを調製するために、結晶を顕微鏡ガラススライドに置きます。より高い倍率を使用する必要がある場合は、薄いカバーガラスで結晶を覆い、テープで固定し、試料を薄いカバーガラスを対物レンズに向けて置くことができます。
- サンプルを調製したガラススライドを顕微鏡ステージに置き、金属アームを使用して固定します(図4a,b)。
- ASIコントローラのジョイスティック(図4c)を使用してサンプルを移動し、使用中の目的にサンプルを配置します。
- 目的の下のホイールに右フィルターキューブを手動で配置し(図5の3)、ランプのUV励起を選択し、可視放出を検出器に向けて通過させます。
注: 追加のフィルター キューブは、緑または青色光の励起を使用するために利用可能です、したがって、適切な励起波長の適切なフィルター キューブを配置することが重要です。 - サンプルの下に 20X の目的 (図 5の 5 で示す) を手動で配置し、顕微鏡の左側にある白いボタン (図5の 6) を押して白色光を点灯させます。
- 白色のライトの電源ボタンの下にノブを回して明るさを調整します(図5の7)。
- PHySpecソフトウェアで、ライブ スキャンの取得を引き起こすカラー カメラ ウィンドウの再生(ビデオ) ボタンを押します。
- カラーカメラウィンドウに黒い画像が表示されている場合は、インストゥルメントコントロールパネルの「カラーカメラ」タブの「露出時間(図3の2)」または「ゲイン値」(図3の3)を大きくします。表示された画像が明るすぎる場合は、露出時間を短くしたり、ゲインの値を得たりします。
- カメラ/双眼鏡に信号の20%と検出器に信号の80%を送信するために、顕微鏡の右側の前方ノブ(図5の2)がRに設定されていることを確認します。
- 目的とステージの距離を調整してサンプルに焦点を当てます (図 4b)。これは、顕微鏡の右側にある図4dに示すノブを回すことによって行われます。
メモ:大きなノブは粗い調整に使用され、小さいノブはより繊細で小さな焦点の変更のためにある。 - ソフトウェアで手動で選択した目的も選択されていることを確認します。まず、上部のメニュー バーの[表示] ボタンをクリックし、次に 1 つの[表示/非表示] スケール バーをクリックして、イメージ上に縮尺記号を表示します (図 3の 1)。次に、指示コントロール パネルの[ガルバノメーター ] タブに移動し、[使用する目的] を選択します (図 3の 4)。ソフトウェアで適切な目的を選択して、表示されているスケールバーが正しいことを確認します。
- ソフトウェアでは、タブダイバータ(ProEM –図 3の 6 ) に移動し、SpectraPro SP-2300タブの下にあるタブフィルター (ProEMの場合は 1200 gr/mm -図 3の場合は 7) に移動して、適切な検出器を選択します。
- 広帯域ランプシャッター(図2の12)を開いて、サンプルのUV励起を行えるようにします。強度ノブ(図2dの11)を希望の位置(例えば、8 – 中間強度)に回して、広帯域ランプ(UV)励起の強度を制御します。
- 広視野照明(開いた開口)またはより小さいスポット照明(より閉じた絞り)から選択するには、図5の4に示すスティックとノブを使用してUVランプフィールド絞りのサイズを制御します。
- SpectraPro SP-2300タブで、サンプルの放出を観察する波長を選択します。
- 試料の発光波長が不明な場合は、発光スペクトルを取得する。
- シーケンサーで+記号をクリックして、放出スペクトルを取得するための新しいシーケンス(「ノード」)を追加します。
- スペクトロメーターをクリックし、次にスペクトル取得(スペクトルスキャン付き)をクリックします。
- 最小波長(すなわち、400 nm)と最大波長(すなわち、700 nm)を入力し、OKをクリックしてスペクトルが記録されるスペクトル範囲を設定する。
- ソフトウェアの左側のメニューで適切な露出時間を選択します。非常に明るいサンプルの場合は短い時間(例えば0.1 s)、薄暗いエミッタの場合は長い時間(例えば2 s)を選択します。
- 広帯域ランプ(UV)励起の場合には励起力を調整します(上記のステップ1.3を参照)。
メモ:NIRダイオード励起の場合、PHySpecソフトウェアの左側にある[ニュートラル密度]ドロップダウンメニューから調整できます。
- シーケンサーで、ダブル再生ボタンをクリックしてシーケンス全体を実行します。スペクトルが表示されたら、サンプル放出の検出に関心のある領域(例えば、Tb3+およびEu3+ベースのサンプルの場合は580〜640 nm)に注意してください。
- 必要に応じて、サンプルの焦点を変更するか、PHySpecソフトウェアで露光時間を調整して、信号検出を最適化します。上記のように励起源(広帯域ランプ)の電力を変化させることにより、サンプル発光強度の増加を通じて信号検出のさらなる最適化を達成する。
- シーケンサーで+記号をクリックして、放出スペクトルを取得するための新しいシーケンス(「ノード」)を追加します。
- カラーカメラの露光時間(例えば、0.5 s – 2(図3)とゲイン(図3)を適宜調整して、良質の画像を得ます。必要に応じて、PHySpecソフトウェア ウィンドウの上部にあるメニューの 2 行目にある [スケール バーの表示/非表示] ボタンをクリックして、イメージにスケール バーを追加します。
- 推奨: ハイパースペクトルキューブを取得する前に、白色光(図6a)および/またはUVフル(図6b)または閉じ込められた(図6c)照明(図5の4)で、光光の光顕微鏡画像を記録してください。これを行うには、サンプルをフォーカスして、カラーカメラの再生ボタンをクリックします。
- [ファイル]をクリックし、[ウィンドウビューをエクスポート]をクリックし、取得した画像をエクスポートする形式を選択し、目的の拡張子(.h5,)を付けてファイルを保存します。JPEG)。
- ハイパースペクトル画像を取得する前に、部屋の照明と同様に白色光照明をオフにします。
- ハイパースペクトル キューブを取得するには、新しいシーケンスを作成します。したがって、シーケンサーで+ 記号をクリックして新しいノードを追加します。
- [共焦点イメージャー]をクリックします。
- マルチスペクトル取得をクリックします。ここで、望ましい視野は、xおよびy方向およびステップサイズで獲得する点数によって定義される。例えば、xの100ポイント、5μmのステップサイズのyの100ポイントを使用して、500 x 500 μmの画像を得る。
注: 各ポイントの取得ポイントの合計数と統合時間は、ハイパースペクトル キューブの合計取得時間に直接影響します。- 希望のX位置(例えば、100)とY位置(例えば、100)を入力すると、希望するステップサイズ(例えば、5μm)と同様にカウントされます。可視放出マッピングの場合はカメラ同期のハードウェアオプションを選択します(NIR検出の場合はソフトウェアオプション)。[OK] をクリックします。
- マルチスペクトル取得をクリックします。ここで、望ましい視野は、xおよびy方向およびステップサイズで獲得する点数によって定義される。例えば、xの100ポイント、5μmのステップサイズのyの100ポイントを使用して、500 x 500 μmの画像を得る。
- [共焦点イメージャー]をクリックします。
- シーケンサーで、新しく追加されたマルチスペクトル集録線をクリックしてノードをハイライト表示します。
- [再生] ボタンをクリックして、選択したノードを実行します。
注: 取得にかかる残り時間はノードの横に表示されます(分単位、28分など)。 - 取得が完了したら、ハイパースペクトル キューブを適切なファイル形式 (.h5) で保存します。
3. ハイパースペクトルデータ解析
- 取得直後に、保存されたハイパースペクトル キューブがソフトウェアで自動的に開かない場合は、上部のメニュー バーの[ファイル] をクリックし、カーソルを置いて[Open File.. ] ウィンドウが開く ] ウィンドウが表示されたら、.h5 ファイルが保存されているフォルダーを選択し、ファイルをダブルクリックして開きます。
- ハイパースペクトルキューブファイルをインポートしたら、表示されたハイパースペクトルキューブ画像を変更して、立方体画像の上部にあるバーを左(低波長、例えば580nm)または右(例えば、638nm)に移動して、特定のスペクトル波長の強度を示します。 e.g.,
メモ:選択した波長は、この上のバーの左側に表示されます(図7の1)。 - 解析に関する対象波長を選択した後(例えば、[TbEu(bpm)(tfaa)6]の場合は613.26nmの6最大強度を、3種類のスペクトル分析の1つ(またはすべて)を行います:(A)画像の形でスペクトル分布を(図7の2)。(B) 対象領域全体の発光強度プロファイル (図 7の 3)。(C)特定の点または対象領域におけるスペクトルの抽出(図7の4)。
- 画像からのスペクトル分布の場合は、トリミングとビン関数を使用して、画像の信号対雑音比を大きくします。そのためには、上部メニューの[処理]をクリックし、[データ]を選択し、次にオプションの[トリミングとビン]をクリックします。
- 放出強度プロファイルの場合、キューブ イメージ上で右クリックして[ターゲットの作成]または[X プロファイルを作成]または[Yプロファイルを作成]を 1 つのポイント([ターゲット - 5]および[図 7 の 6]) またはライン (図 7の[プロファイル - 7] および [8]) のみに応じて選択します。ターゲット、水平線または垂直線のプロファイルをカーソルでドラッグして分析領域を選択し、キューブを横切って移動します。
- プロファイルが正しく選択されたら、領域を右クリックして[グラフにターゲットを追加]を選択します。目標(x軸)の物理的位置の関数として発光強度(y軸)を表示する新しいグラフを作成するオプションを選択しました。スペクトルは、挿入された新しいグラフに表示されます (図 7の 6 と 7)。
注: 複数のターゲットを作成することができ、これらは異なる色付きの放出プロファイルとして表示されます(図7の5と6)。
- プロファイルが正しく選択されたら、領域を右クリックして[グラフにターゲットを追加]を選択します。目標(x軸)の物理的位置の関数として発光強度(y軸)を表示する新しいグラフを作成するオプションを選択しました。スペクトルは、挿入された新しいグラフに表示されます (図 7の 6 と 7)。
- あるいは、試料の特定の領域の発光スペクトルを得る(図7の9)。まず、キューブイメージの上にカーソルを置き、右クリックします。ポップアップ表示されるタブの[矩形選択] または [楕円選択]オプションをクリックします。
- 選択図形 (長方形など) を、目的の領域に描画するには、カーソルをクリックして、キューブを横切ってドラッグします。領域が適切に選択されたら、領域を右クリックし、グラフに選択を追加を選択します。
- 表示されるウィンドウで、[新しいグラフを作成]を選択してターゲットの放出スペクトルを表示し、[OK]をクリックします。
注: 新しい色の線(図 7の 8)が、ターゲットエミッションが表示されているグラフに表示され、放射強度は y 軸、波長は x 軸で表示されます。このスペクトルは、各波長の選択された領域の平均強度に対応しています。
- スペクトルが取得されたら、新しいリージョンを選択する前に保存します。これを行うには、グラフが含まれているウィンドウを選択します。[ファイル]メニューの [名前を付けて保存] を選択し、選択した名前を使用して、選択したフォルダーにグラフを保存します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lnベースの分子単結晶(すなわち、TbEu(bpm)(tfaa)6]、図1a)におけるデータ取得用ハイパースペクトル顕微鏡の構成を例示すると、図2は、システムの概観とセットアップにおける光学キューブの正しい配置を示す。6図 3は、HSI 取得時に使用したメニューを含む PHySpec ソフトウェアのスクリーン ショットを示しています。図4および図5は、分析対象の試料を含むガラススライドの配置を含む、顕微鏡ステージをより詳細に示す。選択したUV照明をオンにして、結晶の可視赤色発光を示す(図4aおよび図5の1)。図6aは、試料を適切な焦点で調整した後に記録した結晶の明視野画像を示す。結晶の針状の形態ははっきりと見える。図6b,cは、UV励起下の同じ結晶の画像を全面(図6b)または局所的に閉じ込められた(図6c)のイルミネーションで示した。広いUV照明の下で、結晶の異なる面からの発光輝度の違いがすぐに見える。閉じ込められた照明は、主に導波のような挙動を引き起こす可能性のある結晶内のエネルギーまたは光の伝達の影響を調査するために、オプションとして使用することができます。この場合、励起の直下でない点で強い放出が検出される。これは、効率的なエネルギー移動が結晶13(図7の5と6)を介して行われることを示唆している。
取得したハイパースペクトルキューブから、特定の波長を表す画像の形でスペクトル分布を取得することがさらに可能であり、特定の発光波長の強度プロファイル、ならびに取得したハイパースペクトルキューブの任意の画素または領域における発光スペクトルを得ることができる。一例として、図7(パネル4)に示す発光スペクトルは、EU3+イオンの最も特徴的な発光帯域を示している:590nmで観測されたバンドは、EU3+の磁気双極子(MD)5 5D0→7F1遷移に割り当てられ、一方、610から630 nmの領域の放出ピークは、過敏7電電極(ED)から75D0+F+F3+02 3+これら2つの遷移の積分強度間の比は、単結晶21の構造におけるLn3+イオン周囲の化学環境の優れたプローブであることがよく知られている:Ln3+イオンの周りの対称性が低3+いほど、ED/MD比が大きくなる。これにより、Ln3+イオンの化学環境の対称性特性に関する結論を導き出すことができます。さらに、5D0→7F2遷移のスターク分割は、結晶構造環境におけるLn3+の周りの対称性と相関することも可能で、対称性が低いほど、スタークのサブレベルの数が多くなります。低対称トリカリン結晶系で結晶化した針状多形の場合、5D0→7F2移行7は42つのサブピークに分割される(図7、パネル4に示すスペクトル)。 50このような分析は、発光結晶の複数の多形の光学特性を比較する場合に特に魅力的である。我々は先に、光学的分析から推定された化学環境に関する情報が、単結晶X線解析13によって得られた分子結晶構造とよく相関していることを実証した。さらに、図7(パネル3)に示す異なる結晶面に沿ったスペクトルプロファイルは、先端および側面の明るい発光を示し、Ln3+····3つの空間方向のLn3+イオン距離(図1b):先端面と側面に垂直な軸に沿って密集したLn3+パッキングは、それぞれイオンイオンエネルギー伝達を優先する。したがって、発光増強は、それぞれの面で観察され、したがって、光学異方性である。
全体として、データ分析の様々なオプションは、図7および図8に示す、組み合わされた分光および空間情報の最も重要な特徴であり、発光サンプルのHSI分析によって探求することができる。
図1:分子構造と結晶学的配置( a) ヘテロダイル核Lnベース複合体の構造 [TbEu(bpm)(tfaa)6] , Ln1とLn2はTb3+およびEu3+イオンである。無秩序基および水素原子は、明確にするために省略される。カラーコード: Eu: ダークシアン;C: グレー;O: 赤;N: 青;F:ライムグリーン。(b)結晶中の分子パッキングの表現:(i)上面図と(ii)分子間および分子内Ln·・・・・・・・・・の選択された針状単結晶構造の先端図Ln距離(tfaaサブユニットと水素原子は、明確にするために省略されます)。(iii) [TbEu(bmp)(tfaa)6] ダイ6マーの結晶包装配置(水素原子は明瞭にするため省略)。(iv) 最短のLn···(0 1 0)および(2-1 1)結晶学的方向のLn距離。図は参照13から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ハイパースペクトルイメージングシステムの概要図示は、UV励起を使用した可視スペクトル領域での発光マッピングに必要な構成である。(a)システムの一般的なビューは、1が顕微鏡ステージ、2が光学構成を含むセクション、3は可視およびNIR検出器を備えた分光計である。(b)光学的構成に近い光学的セットアップのオープンビュー(a)は、実験のための光学的構成を示す:光学立方体位置4は空のままで、共焦点顕微鏡キューブは可視経路を通って光を経路に導くために位置5に配置され、可視立方体は可視光を検出経路に向けるために位置6に配置され、コン焦点ピンホールキューブは可視経路に向けて位置7に配置される。(c)検出器(aの左側)に近い光学セットアップのオープンビューは、位置8を示し、そこで、分光計および可視カメラに光を反射するために共焦点分光計立方体が配置される。差し込み9は、分光計スリットの開口幅を調整するネジを示す。(d) 顕微鏡ステージ、コンピュータ、広帯域ランプ(UV励起用)コントローラの表示。インセットでは、広帯域ランプコントローラは、オン/オフボタン、11はランプの強度を制御する11ノブ、12はシャッターボタンです。(e) 顕微鏡ステージから検出器までの可視/NIR光路を示すスキーム(光学キューブ位置を含む) 4から8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HSIのために調整されるパラメータを持つメニューを示すPHySpecソフトウェアのスクリーンショット1は、カラーカメラの画像にスケールバーを挿入することができます。2と3は、それぞれ、カラーカメラの露出時間とゲイン値を制御することができます。適切な対物レンズは4で選択する必要があります。5は、ピンホールの絞りの選択を可能にします。6(ダイバータ)と7(フィルタ)は、検出器とグレーチングをそれぞれ選択することができます。可視検出器の露光時間は8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:顕微鏡ステージの一般的なビュー。(a) サンプルを含むガラススライドの配置をステージで、UV照明ONでサンプルの赤い発光(ガラススライドの中央に小さな赤い点)を示す。(b)上に白色光照明コンデンサーを載せ顕微鏡ステージの眺め。(c)ステージコントローラは、オレンジと黄色の矢印で示される方向にステージの動きを制御するジョイスティックを示す(a)。(d) フォーカスボタンの詳細ビューで、赤い矢印で示される方向にステージを移動する(b)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:顕微鏡ステージの成分。ガラススライド上のサンプルを持つ1顕微鏡ステージは、対物レンズの上にサンプルステージに置かれます。2つの車輪は、フォーカス(大きな車輪)を調整し、撮影された放出(小さな車輪)を検出器(L)にのみ向け、部分的に検出器に、部分的にカメラ(R)に向けるか、双眼鏡レンズ(目)だけに向ける。励起波長範囲を選択するために使用される3つの励起/放出フィルターの車輪。右側の詳細は、この実験で使用される UV フィルタとロングパス フィルタを保持するフィルタ キューブを示しています。上/底部の4は、サンプルを通して励起ビームを移動するためのノブを示していますが、その間に円形のフィールド絞りコントロールが表示されます。5対物レンズ;6 白色光照明のオン/オフボタン。7ノブは、白色光灯の明るさを調整します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:分析した単結晶の光学顕微鏡画像。これらの画像は、(a)白色光照明、(b)全景UV照明の下で、励起円形開口を完全に開き、(c)局所的に閉じ込められたUV照明(白い円でマーク)を使用して、より近い励起円形開口を用いて得られた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ハイパースペクトルキューブデータ分析プロセスを示すPHySpecソフトウェアのスクリーンショット。多様なスペクトル解析方法は、取得したハイパースペクトルキューブに適用することができます:1は、2に示すスペクトル画像分布のために選択された波長を示しています。3は、613.26 nm 水平 (7) と垂直 (8) 強度プロファイルを示します。図4は、目標5と6から抽出された発光スペクトルと、9で強調表示された領域から抽出された発光スペクトルを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:アップコンバートナノ粒子とランタニド複合体との相乗効果を調べるHSIの代替応用。この例は、分子結晶([Tb 2(bpm)(tfaa)6])とアップコンバートナノ粒子(NaGdF4:Tm3+、Yb3+)で構成されるハイブリッド系のハイパースペクトル解析を示しています。26(a) 980 nm光照射下のハイパースペクトルイメージングに使用される対象領域(ROI)と共に、白色およびUV光照射下の顕微鏡写真。(b) Tm3+および間接Tb3+排出量を20 x 20 μm2の領域で監視する。(c)ハイブリッド系全体で変動するエミッションバンドの絶対強度の変動は、表面に分布する材料の総量に多少の変動を示す。(d)複合体の統合放出とTm3+:1G4→3H6(正方形)と3Tm3+:1 1G4→3 1F4(円3)の間の比率の恒常性は、ハイブリッド系全体の2つの部分とそれらの間の均一な相互作用の同時存在を確認した。スケールバーは、マイクロ顕微鏡写真では20μm、ROIおよびスペクトルマップでは5μmです。顕微鏡写真は実際の色で提示されます。図は参照11から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明するハイパースペクトルイメージングプロトコルは、サンプルの正確な位置で分光情報を得ることができる簡単なアプローチを提供します。上記の設定を使用すると、空間解像度(xおよびyマッピング)は0.5μmまでまで達し、スペクトル解像度は可視範囲でのマッピングでは0.2 nm、NIR範囲では0.6nmに達することができます。
単一の結晶でハイパースペクトルマッピングを行うために、サンプル調製は簡単な手順に従います:クリスタルは、必要に応じてカバーガラスで覆われたガラス顕微鏡スライドに単に置くことができます。ソフトウェアのカラーカメラ設定で適切な対物レンズと明視野画像を使用してサンプルを焦点を合わせるのは、最適な解決されたハイパースペクトル画像を得るための事前分析段階で非常に重要なステップです。典型的には、サンプルが十分に焦点を合わせるとき、より高い発光強度が得られる。これが完了すると、xとyの数やステップ サイズなどの解析のパラメーターの選択は、取得したハイパースペクトル キューブのビューフィールドと空間サンプリングをそれぞれ決定します。しかし、目的の数値開口と励起/発光波長は、各取得点でプローブされるサンプルの実際の体積を決定します。例えば、この研究で用いる目的については、0.4の開口(NA)を有し、かつUVスペクトル範囲(390nm)での励起を用いて、焦点を当てたレーザースポットは、x方向およびy方向に約0.6 x 0.6μmの大きさを有する。レーザースポットのサイズは、ウェブサイトを使用して計算されました(https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna、2019年9月26日にアクセス)。選択したステップ サイズが空間サンプリングよりも大きい場合、実際には、ステップ サイズで指定された領域よりも小さい領域をサンプリングしている可能性があります。サンプルが均一である場合は、アンダーサンプリングが問題ではない可能性があります。しかし、サンプルの空間的変動が検出に重要な場合、サンプル上のレーザー光の半分のサイズに設定されたステップサイズで最適なサンプリングが得られます。選択した露光時間とUV選択照明の強度は、得られたスペクトルの強度を制御します。このようなパラメータは、発光強度とUV励起に対する感度によって、サンプルごとに異なります。
この時点で、プロトコル内の重要なステップは、光学系のアライメント、光学キューブの正しい配置、励起および検出器スリット開口部の円形開口の調節、ピンホールの選択、適切な対物レンズを使用したカラーカメラのサンプルの焦点、広帯域ランプの強度、長いパスフィルタキューブの適切な選択(UVエクスペーションを可能にする)としてリストすることができます。上記のように適切なステップサイズと露光時間の選択と同様に。最後に、ハイパースペクトルキューブの取得のすべての時間中に部屋のライトがオフにする必要があります。
カラーカメラまたは分光計で信号検出が不十分な場合、この技術のトラブルシューティングには、ハイパースペクトルキューブの取得を開始する前に、上記の重要なステップのそれぞれを注意深くチェックする必要があります。顕微鏡の段階での出力信号の構成も重要である。考えられる構成は、眼(出力信号の100%が顕微鏡双眼鏡マウントに送られる)、L(出力信号の100%が検出器に送られる)、R(出力信号の80%が検出器に送られ、20%が顕微鏡双眼鏡台に送られる)である。ハイパースペクトル キューブの取得中に、R または L 構成を使用する必要があります。上記のパラメータをすべて適切に選択すれば、サンプルの高解像度空間情報とスペクトル情報を取得できます。
本明細書に記載する技術のいくつかの可能な修飾は、発光性微粒子14または高変換ナノ粒子と組み合わせた分子結晶からなる光学ハイブリッド系などの他のシステムのハイパースペクトルイメージングによって例示することができる(図8)11。これらの例では、NIRレーザーダイオード(980nm)を励起源として使用し、UV励起を置き換え、生成された可視放出を検出した。ハイブリッド系の後者の例では、HSIは、多波長応答性等方性システムに対して、ナノ粒子(NaGdF4:Tm3+、Yb3+)と[Tb2(bpm)(tfaa)6]結晶を組み合わせたハイブリッド膜の均質性を明らかにし、材料と分子間のエネルギー伝達を示す(26図8)11。11さらに、システムのInGaAs検出器を用いることで、NIRスペクトル領域(1000〜1700nm)における排出量の検出が可能となる。これは、生物医学用アプリケーション3に対するNIRベースの光学プローブの調査を求める際に特に興味深いものです。この場合、システムのオプティカルキューブ構成(図2e)をNIRパスに設定する必要があります。NIR励起-NIR発光の場合、ここで説明するハイパースペクトル技術の限界の1つが明らかになり、波長依存であるため、NIR領域のスペクトル分解能は可視検出のスペクトル解像度よりも低く、すなわち約0.6nm(対0.2nm)である。さらに、サブ1μmの特徴、例えば小さな分子結晶、ナノ粒子またはハイブリッド系では、システム構成(使用目標および励起/発光波長)によって決定される空間分解能は、別の潜在的な制限になります。
最後に、(選択されたHSI構成と波長のレジームに関係なく)データ操作は、機器のソフトウェアで行うか、スペクトルプロファイルの場合に示すように、Origin®またはMicrosoft Excelなどの他のソフトウェアパッケージで分析するためにエクスポートすることができます。この例では、光異方性の光は、カラーカメラの画像、すなわち異なる結晶面に沿った強い強度の変化によって、速やかに明らかにされました。また、広い紫外線励起の下では、どの面が分析されているかによって異なる発光強度が得られる(図7)。結晶で異なる対象点で発光強度プロファイルを得る可能性(図7のターゲット)は、さらに発光強度の変動を研究することを可能にし、存在する場合は、スペクトル形状においても検討することができます。[TbEu(bpm)(tfaa)6] のブロック状の多6形は、2つの結晶面が等しく高い発光強度を示し、3番目の11の放射強度が低い例を構成する。これに関しては、異方性のないシステムの場合、発光強度はすべての結晶面で同じになります。
光学異方性を探査する相補的方法は、例えば試料からの偏光放出の存在に関連する。これらには、偏光メモリまたは分光楕円体法が含まれる。第1は、物質が放射する光の偏光状態と入射励起光の偏光状態との相関で,構成され、後者は薄いサンプルフィルム24によって斜めに反射された後の光の偏光状態の変化を測定する。しかし、光異方性を探査するためのツールとしてハイパースペクトルイメージングを用いる利点は、ここで示すように、偏光の存在がサンプル分析の要件ではないという事実を伴う。また、試料調製物は、薄膜の作製を必要とせず、入射や集められた光に対して結晶の配向も非常に慎重ではない。これらの側面により、HSIの技術は潜在的により広く適用可能になります。さらに、異方性の特徴は画像取得時に速やかに可視化され、データ分析は簡単です(上記の例を参照)。
より広い範囲を考慮すると、HSI技術の重要性は、環境に依存する特徴を持つ光信号をコアレートするそのユニークな特性に起因することができます。例えば、ナノ医薬の成長分野におけるナノバイオ相互作用3、15、16,16の理解を深めるには、あるいは3材料科学10、11、12、13における構造特性関係を理解するためにも、11,12,13このような接続が不可欠である。,したがって、本明細書に記載された技術の将来の潜在的な用途は、次のように命名することができる、 しかし、限定されない:生体内の生体試料の分析は、生体関心4、6、6環境特異的な光電子4特性(例えば電気回路に埋め込まれたサンプル)を研究するための顕微鏡段階の適応、光学温度感知8,8、15(温度コントローラを顕微鏡ステージに加えて)またはガスセンシング(ガスをステージマイクロスコープに適応させることによる)またはガスセンシング(ステージマイクロスコープに温度コントローラを加える)を行う。HSIは蛍光発光25の代わりに蛍光励起技術に適したものとしてさらに実証されている。この特定のハイパースペクトル技術の適応の使用の良い例は、生物学的組織における癌細胞の検出6である。その結果、ここで説明するプロトコルは、多くの異なる種類の発光構造の分光的特徴の研究に大きく拡張される可能性を有する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。著者は競合する財政的利益を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、オタワ大学化学生命分子科学科のディラン・エラーラット氏とムラリー・ムルゲス教授に対し、単結晶の提供に対して感謝している。E.M.R.、N.R.、E.H.は、オタワ大学、カナダイノベーション財団(CFI)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)が提供する財政支援を感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope glass slides | FisherBrand | 12-550-15 | Glass slides used for sample preparation |
| Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager | PhotonETC | Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number |
References
- ElMasry, G., Sun, D. W. Principles of Hyperspectral Imaging Technology. Hyperspectral Imaging for Food Quality Analysis and Control. , 3-43 (2010).
- Dong, X., Jakobi, M., Wang, S., Köhler, M. H., Zhang, X., Koch, A. W. A review of hyperspectral imaging for nanoscale materials research. Applied Spectroscopy Reviews. 54 (4), 285-305 (2019).
- Yakovliev, A., et al. Hyperspectral Multiplexed Biological Imaging of Nanoprobes Emitting in the Short-Wave Infrared Region. Nanoscale Research Letters. 14 (243), 1-11 (2019).
- Cheng, W., Sun, D. W., Pu, H., Wei, Q. Heterospectral two-dimensional correlation analysis with near-infrared hyperspectral imaging for monitoring oxidative damage of pork myofibrils during frozen storage. Food Chemistry. 248, 119-127 (2018).
- Liu, Y., Liu, L., He, Y., Zhu, L., Ma, H. Decoding of quantum dots encoded microbeads using a hyperspectral fluorescence imaging method. Analytical Chemistry. 87 (10), 5286-5293 (2015).
- Leavesley, S. J., et al. Colorectal cancer detection by hyperspectral imaging using fluorescence excitation scanning. Optical Biopsy XVI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. 10489, (2018).
- Zhang, H., Salo, D., Kim, D. M., Komarov, S., Tai, Y. -C., Berezin, M. Y. Penetration depth of photons in biological tissues from hyperspectral imaging in shortwave infrared in transmission and reflection geometries. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126006 (2016).
- Naccache, R., et al. Terahertz Thermometry: Combining Hyperspectral Imaging and Temperature Mapping at Terahertz Frequencies. Laser and Photonics Reviews. 11 (5), 1-9 (2017).
- Jacques, S. D. M., Egan, C. K., Wilson, M. D., Veale, M. C., Seller, P., Cernik, R. J. A laboratory system for element specific hyperspectral X-ray imaging. Analyst. 138 (3), 755-759 (2013).
- Birmingham, B., et al. Probing the Effect of Chemical Dopant Phase on Photoluminescence of Monolayer MoS2 Using in Situ Raman Microspectroscopy. Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15738-15743 (2019).
- Marin, R., et al. Harnessing the Synergy between Upconverting Nanoparticles and Lanthanide Complexes in a Multiwavelength-Responsive Hybrid System. ACS Photonics. 6 (2), 436-445 (2019).
- Gonell, F., et al. Aggregation-induced heterogeneities in the emission of upconverting nanoparticles at the submicron scale unfolded by hyperspectral microscopy. Nanoscale Advances. 1, 2537-2545 (2019).
- Errulat, D., Gabidullin, B., Murugesu, M., Hemmer, E. Probing Optical Anisotropy and Polymorph-Dependent Photoluminescence in [Ln2] Complexes by Hyperspectral Imaging on Single Crystals. Chemistry - A European Journal. 24 (40), 10146-10155 (2018).
- Panov, N., Marin, R., Hemmer, E. Microwave-Assisted Solvothermal Synthesis of Upconverting and Downshifting Rare-Earth-Doped LiYF4 Microparticles. Inorganic Chemistry. 57 (23), 14920-14929 (2018).
- Debasu, M. L., Brites, C. D. S., Balabhadra, S., Oliveira, H., Rocha, J., Carlos, L. D. Nanoplatforms for Plasmon-Induced Heating and Thermometry. ChemNanoMat. 2 (6), 520-527 (2016).
- Nadort, A., et al. Quantitative Imaging of Single Upconversion Nanoparticles in Biological Tissue. PLoS ONE. 8 (5), 1-13 (2013).
- Sava Gallis, D. F., et al. Tunable Metal-Organic Framework Materials Platform for Bioimaging Applications. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (27), 22268-22277 (2017).
- Varghese, S., Das, S. Role of molecular packing in determining solid-state optical properties of π-conjugated materials. Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (8), 863-873 (2011).
- Yan, D., Evans, D. G. Molecular crystalline materials with tunable luminescent properties: From polymorphs to multi-component solids. Materials Horizons. 1 (1), 46-57 (2014).
- Mu, S., Oniwa, K., Jin, T., Asao, N., Yamashita, M., Takaishi, S. A highly emissive distyrylthieno[3,2-b]thiophene based red luminescent organic single crystal: Aggregation induced emission, optical waveguide edge emission, and balanced ambipolar carrier transport. Organic Electronics: Physics, Materials, Applications. 34, 23-27 (2016).
- Binnemans, K. Interpretation of europium(III) spectra. Coordination Chemistry Reviews. 295, 1-45 (2015).
- Koyama, H., Fauchet, P. M. Anisotropic polarization memory in thermally oxidized porous silicon. Applied Physics Letters. 77 (15), 2316-2318 (2000).
- Kushida, T., Takushi, E., Oka, Y. Memories of photon energy, polarization and phase in luminescence of rare earth ions under resonant light excitation. Journal of Luminescence. 12-13, 723-727 (1976).
- Onuma, T., et al. Spectroscopic ellipsometry studies on β-Ga2O3 films and single crystal. Japanese Journal of Applied Physics. 55 (12), (2016).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010 (2014).
