Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de imagem hiperespectrais luminescentes e analisar características de anisotropia óptica de cristais únicos baseados em lantanoide usando um Sistema de Imagem Hiperespectral.

Abstract

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para uma nova aplicação de imagens hiperespectrais (HSI) na análise de cristais únicos moleculares luminescentes^{(Ln 3+}). Como exemplo representativo, escolhemos um único cristal do complexo heterodinuclear baseado em Ln [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm=2,2'-bipirimidina, tfaa^– =1,1,1-trifluoroaaceylacetonato) exibindo emissão visível brilhante sob excitação UV. O HSI é uma técnica emergente que combina imagens espaciais bidimensionais de uma estrutura luminescente com informações espectrais de cada pixel da imagem obtida. Especificamente, o HSI sobre cristais únicos do complexo [Tb-Eu] forneceu informações espectrais locais revelando a variação da intensidade da luminescência em diferentes pontos ao longo dos cristais estudados. Essas mudanças foram atribuídas à anisotropia óptica presente no cristal, que resulta da embalagem molecular diferente de^{Íons Ln 3+} em cada uma das direções da estrutura cristalina. O HSI aqui descrito é um exemplo da adequação dessa técnica para investigações espectro-espaciais de materiais moleculares. No entanto, é importante que este protocolo possa ser facilmente estendido para outros tipos de materiais luminescentes (como cristais moleculares de tamanho micron, micropartículas inorgânicas, nanopartículas em tecidos biológicos, ou células rotuladas, entre outros), abrindo muitas possibilidades para uma investigação mais profunda das relações estruturais-propriedade. Em última análise, tais investigações fornecerão conhecimento a ser aproveitado na engenharia de materiais avançados para uma ampla gama de aplicações, desde bioimagem até aplicações tecnológicas, como guias de onda ou dispositivos optoeletrônicos.

Introduction

Imagem Hiperespectral (HSI) é uma técnica que gera um mapa espacial onde cada coordenada x-y contém uma informação espectral que poderia ser baseada em qualquer tipo de espectroscopia, ou seja, fotoluminescência, absorção e espectroscopia de dispersão^1,2,3. Como resultado, um conjunto tridimensional de dados (também chamado de "cubo hiperespectral") é obtido, onde as coordenadas x-y são os eixos espaciais e a coordenada z é a informação espectral da amostra analisada. Portanto, o cubo hiperespectral contém informações espaciais e espectrais, proporcionando uma investigação espectroscópica mais detalhada da amostra do que a espectroscopia tradicional. Embora o HSI seja conhecido há anos no campo do sensoriamento remoto (porexemplo, geologia, indústrias alimentícias^4),recentemente emergiu como uma técnica inovadora para a caracterização de nanomateriais^2,,5 ou sondas para aplicações biomédicas^3,,6,7,8. De um modo geral, não se limita ao domínio UV/visível/infravermelho próximo (NIR), mas também pode ser estendido usando outras fontes de radiação, como raios-X – por exemplo, a fim de caracterizar a distribuição elementar em diferentes materiais⁹ – ou a radiação Terahertz, onde o HSI foi usado para realizar sensoriamento térmico em tecidos biológicos⁸. Além disso, o mapeamento da fotoluminescência foi combinado com o mapeamento de Raman para sondar as propriedades ópticas da monocamada MoS₂¹⁰. No entanto, entre as aplicações relatadas de HSI óptico, ainda existem apenas alguns exemplos de HSI de materiais à base de lantthanidas^{11,,12,,13,,14,,15,,16,17}. Por exemplo, podemos citar: detecção de câncer nos tecidos⁶, análise da profundidade de penetração da luz em tecidos biológicos⁷, imagem biológica multiplexada^3,análise de transferência de energia multicomponente em sistemas híbridos¹¹, e investigação de alterações induzidas por agregação nas propriedades espectroscópicas de nanopartículas de upconverter¹². Claramente, a atratividade do HSI decorre de sua adequação à geração de conhecimento sobre luminescência específica do ambiente, fornecendo informações espaciais e espectrais simultâneas sobre a sonda.

Aproveitando essa poderosa técnica, descrevemos um protocolo para investigar a anisotropia óptica da tb heterodinuclear Tb³⁺-Eu³⁺ cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆](Figura 1a)¹³. A anisotropia óptica observada resultou da embalagem molecular diferente dos íons^{Ln 3+} nas diferentes direções cristalográficas(Figura 1b),resultando em alguns rostos de cristal mostrando mais brilhante, outros mostrando fotoluminescência dimmer. Foi sugerido que o aumento da intensidade de luminescência em faces específicas do cristal estava correlacionado com uma transferência de energia mais eficiente ao longo dessas direções cristalográficas onde o Ln³⁺··· Em³⁺ distâncias de íons foram as mais curtas¹³.

Motivados por esses resultados, propomos o estabelecimento de uma metodologia detalhada para analisar a anisotropia óptica por meio do HSI, abrindo caminho para melhor compreensão dos processos de transferência de energia íon-íon e propriedades luminescentes ajustáveis decorrentes de arranjo molecular específico^18,19. Essas relações estrutura-propriedades têm sido reconhecidas como aspectos importantes para o design inovador de materiais ópticos, incluindo, mas não se limitando a sistemas de guias de ondas e dispositivos de armazenamento optomagnético em nano e microescala – atendendo à demanda por sistemas ópticos mais eficientes e miniaturizados²⁰.

Protocol

ATENÇÃO: Recomenda-se usar óculos de segurança específicos para o comprimento de onda de excitação que seja usado em todos os momentos durante a operação do imager.

1. Configuração do microscópio hiperespectral

NOTA: Uma visão geral do sistema de imagem hiperespectral é dada na Figura 2a,com os principais componentes do imager sendo descritos. O sistema de imagem pode ser usado para a detecção da emissão visível ou infravermelha próxima (NIR) de uma amostra. Dependendo de qual detecção é desejada (visível ou NIR), a luz passa por dois caminhos de luz diferentes (Figura 2e). Uma combinação de diferentes cubos giradores de feixe e cubos de filtro dicoicos (cubos ópticos) deve ser posicionada em posições específicas no instrumento para selecionar o respectivo caminho.

1. Energia no computador que está conectado ao sistema de imagem. Ligue o monitor do computador.
2. Defina a configuração óptica adequada do cubo(Figura 2b,c).
   NOTA: Aqui, a configuração do imager(configuração do cubo óptico)para mapeamento de HSI usando excitação UV e detecção de emissões visíveis é descrita. No entanto, também é possível alterá-lo para excitação nir e detecção visível ou de emissão de NIR, dependendo da amostra analisada. Consulte a seção Resultados representativos, por exemplo.
   1. A partir do estágio do microscópio (1 na Figura 2a) e seguindo o caminho do feixe de emissão em direção aos detectores (3 na Figura 2a),deixe a primeira posição para um cubo óptico (4 na Figura 2b) vago e coloque o cubo óptico de microscópio confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 5 na Figura 2b,de modo que a emissão da amostra seja direcionada através do caminho de luz visível.
   2. Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível (CM1-P01), que contém o espelho dicórico e os filtros para direcionar a emissão visível para os caminhos de detecção, na posição indicada como 6 na Figura 2b.
   3. Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico de pinhole confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 7 na Figura 2b para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível. Em seguida, seguindo o caminho, coloque o cubo óptico espectrômetro confocal (DFM1-P01) na posição 8 na Figura 2c para que a luz emitida atinja o detector.
   4. Para o mapeamento do HSI, controle manualmente a abertura da fenda do detector (9 na Figura 2c)para combinar com o tamanho dos orifícios utilizados (cerca de 50 mm é ótimo).
   5. No software PHySpec, escolha a abertura do orifício (5 na Figura 3).
      NOTA: Quanto menor a abertura do orifício, melhor é a resolução do HSI, ao custo da intensidade do sinal.
3. Ligue a lâmpada de banda larga(Figura 2d,inset) posicionando o interruptor (10 na Figura 2d)na posição ON. Para controlar a intensidade da luz de excitação, gire o botão indicado por 11 (Figura 2d) para valores mais altos (32 – menor intensidade) ou menores (1 – maior intensidade). Mantenha o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2d) fechado durante a configuração.
   NOTA: Os valores mais elevados correspondem à maior atenuação da densidade de potência emitida pela lâmpada, enquanto valores mais baixos correspondem à menor atenuação.
4. Ligue o seguinte hardware na ordem dada abaixo, definindo seus switches na posição ON:
   1. Ligue o controlador de movimento ThorLabs.
   2. Ligue a fonte de energia Nikon.
   3. Ligue o controlador ASI.
   4. Ligue o controlador Galvo.
   5. Ligue o detector ProEm.
   6. Ligue o detector Bayspec.
5. No computador, abra o software PHySpec clicando duas vezes em seu ícone.
   1. Pressione a tecla F8 no teclado para inicializar o sistema de conversão IMA Upconversion e clique no botão OK na janela Conectar ao sistema.
      NOTA: Passo 1.5.1. também pode ser realizado clicando na guia Sistema e, em seguida, clicando em Conectar para chegar à janela Conectar ao sistema. Em seguida, o botão OK pode ser clicado para conectar o sistema de imagem ao software.
   2. Certifique-se de que todos os menus aparecem na interface(Câmera colorida, ProEm e Bayspec),bem como no painel de controle de instrumentos, no lado esquerdo da tela, conforme mostrado na Figura 3.

2. Imagem hiperespectral de um cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆]

1. Para preparar a amostra, coloque o cristal em uma lâmina de vidro de microscopia. Caso seja necessário usar uma ampliação mais elevada, cubra o cristal com um vidro de cobertura fina e fixe-o com fita adesiva, para que a amostra possa ser colocada com o vidro de cobertura fina voltado para a lente objetiva.
2. Coloque o slide de vidro no qual a amostra foi preparada no estágio do microscópio e fixe-a usando os braços metálicos(Figura 4a,b).
3. Mova a amostra usando o joystick(Figura 4c)do controlador ASI para posicionar a amostra sobre os objetivos em uso.
4. Posicione manualmente o cubo do filtro direito na roda sob os objetivos (3 na Figura 5) para selecionar a excitação UV da lâmpada e deixar passar a emissão visível em direção ao detector.
   NOTA: Cubos de filtro adicionais estão disponíveis para usar excitação de luz verde ou azul, portanto, ter o cubo de filtro certo no lugar é importante para o comprimento de onda de excitação apropriado.
5. Posicione manualmente o objetivo 20X (indicado por 5 na Figura 5) sob a amostra e pressione o botão branco (6 na Figura 5) no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca.
   1. Ajuste o brilho girando o botão sob o botão de energia da luz branca (7 na Figura 5).
6. No software PHySpec, pressione o botão Play (vídeo) na janela da câmera colorida, o que causará a aquisição de uma varredura ao vivo.
   1. Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem preta, aumente o Tempo de Exposição (2 na Figura 3) e/ou o Valor de Ganho (3 na Figura 3) encontrado no painel de controle do instrumento, sob a guia Câmera Colorida. Se a imagem visualizada for muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor.
   2. Certifique-se de que o botão dianteiro no lado direito do microscópio (2 na Figura 5) está configurado como R, a fim de enviar 20% do sinal para a câmera/binóculos e 80% do sinal para o detector.
7. Concentre-se na amostra ajustando a distância entre o objetivo e o estágio(Figura 4b). Isso é feito girando os botões mostrados na Figura 4d no lado direito do microscópio.
   NOTA: O botão maior é usado para ajustes grosseiros, enquanto o botão menor é para mudanças mais delicadas e pequenas de foco.
8. Certifique-se de que o objetivo escolhido manualmente também seja selecionado no software. Primeiro, clique no botão Exibir na barra superior do menu e, em seguida, clique em uma barra de escala Show/hide para exibir a barra de escala na imagem (1 na Figura 3). Em seguida, vá para a guia Galvanometer no painel de controle de instruções e selecione o Objetivo utilizado (4 na Figura 3). Certifique-se de que a barra de escala exibida está correta selecionando o objetivo adequado no software.
9. No software, selecione o detector apropriado indo para a guia Desvior (ProEM – 6 na Figura 3) e grades indo para a aba Filtro (1200 gr/mm no caso do ProEM – 7 na Figura 3) sob a guia SpectraPro SP-2300 .
10. Abra o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2) para permitir que ocorra a excitação UV da amostra. Gire o botão de intensidade (11 na Figura 2d) para a posição desejada (por exemplo, 8 – intensidade intermediária) para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga (UV).
    1. Para escolher entre iluminação de campo largo (abertura aberta) ou uma iluminação de ponto menor (abertura mais fechada), controle o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV usando a vara e os botões mostrados em 4 na Figura 5.
11. Na guia SpectraPro SP-2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra.
12. Se os comprimentos de onda de emissão da amostra forem desconhecidos, adquira um espectro de emissões.
    1. No sequenciador, clique no sinal + para adicionar uma nova seqüência ("nó") para a aquisição de um espectro de emissões.
       1. Clique no Espectrômetro e, em seguida, aquisição de espectro (com varredura espectral).
       2. Insira um comprimento de onda mínimo (ou seja, 400 nm) e um comprimento de onda máximo (ou seja, 700 nm) e clique em OK para definir a faixa espectral na qual o espectro será gravado.
       3. Escolha o Tempo de Exposição adequado no menu do lado esquerdo do software. Escolha tempos mais curtos (por exemplo, 0,1 s) para amostras muito brilhantes e tempos mais longos (por exemplo, 2 s) para emissores dim.
       4. Ajuste a potência de excitação em caso de excitação da lâmpada de banda larga (UV) (ver passo 1.3 acima).
          NOTA: No caso de excitação de diodo NIR, pode ser ajustado a partir do menu suspenso de densidade neutra no lado esquerdo do software PHySpec.
    2. No sequenciador, clique no botão de reprodução dupla para executar toda a seqüência. Uma vez mostrado o espectro, observe as regiões de interesse para a detecção da emissão amostral (por exemplo, 580 a 640 nm no caso de amostras baseadas em Tb³⁺- e^{Eu 3+).}
    3. Conforme necessário, otimize a detecção de sinais alterando o foco da amostra ou ajustando o Tempo de Exposição no software PHySpec. Obter uma otimização adicional da detecção de sinal através do aumento da intensidade de emissão da amostra alterando a potência da fonte de excitação (lâmpada de banda larga), conforme descrito acima.
13. Ajuste o Tempo de Exposição ( porexemplo, 0,5 s – 2 na Figura 3) e Ganhe (3 na Figura 3) da Câmera Colorida em conformidade, para obter uma imagem de boa qualidade. Se necessário, adicione a barra de escala à imagem clicando na barra de escala Show/hide no botão Mostrar/ocultar a barra na segunda linha do menu na parte superior da janela do software PHySpec.
14. Recomendação: Antes de adquirir o cubo hiperespectral, grave uma imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal sob luz branca (Figura 6a) e/ou UV full(Figura 6b)ou confinada(Figura 6c) (Figura 6c)iluminação (iluminação UV controlada pela abertura do obturador, mostrada como 4 na Figura 5). Para isso, com a amostra em foco, clique no botão de reprodução da câmera colorida.
15. Clique em 'Arquivo' e, em seguida, Exportar janela de exportação,escolha o formato desejado para exportar a imagem obtida e salve o arquivo com a extensão desejada (.h5, . JPEG).
16. Antes de adquirir a imagem hiperespectral, desligue a iluminação da luz branca, bem como a luz do quarto.
17. Para obter o cubo hiperespectral, escreva uma nova sequência. Portanto, no sequenciador, clique no sinal + para adicionar um novo nó.
    1. Clique em Confocal Imager.
       1. Clique em Aquisição multi-espectro. Aqui, o campo de visão desejado é definido pelo número de pontos a serem adquiridos nas direções x e y e pelo tamanho da etapa. Por exemplo, use 100 pontos em x e 100 pontos em y com um tamanho de passo de 5 μm para obter uma imagem de 500 por 500 μm.
          Nota: O número total de pontos de aquisição e o tempo de integração em cada ponto afetarão diretamente o tempo total de aquisição do cubo hiperespectral.
          1. Insira a posição X desejada (por exemplo, 100) e a posição Y (por exemplo, 100) conta, bem como o tamanho do passo desejado (por exemplo, 5 μm). Selecione a opção Hardware para a sincronização da câmera, para mapeamento de emissões visíveis (e opção de software em caso de detecção de NIR). Clique em OK.
18. No sequenciador, clique na recém-adicionada linha de aquisição multi-espectro para destacar o nó.
19. Clique no botão Reproduzir para executar o nó selecionado.
    NOTA: O tempo restante que a aquisição levará aparecerá ao lado do nó (em minutos, por exemplo, 28 min).
20. Uma vez concluída a aquisição, salve o cubo hiperespectral no formato de arquivo apropriado (.h5).

3. Análise de dados hiperespectrais

1. Logo após a aquisição, se o cubo hiperespectral salvo não abrir automaticamente no software, recuperar o cubo hiperespectral, que foi salvo como arquivo .h5, clicando no Arquivo na barra superior do menu e, em seguida, pairando o cursor e clique em Abrir arquivo.... Quando a janela intitulada Selecionar dados(s) para abrir aparece, escolha a pasta onde o arquivo .h5 é salvo e clique duas vezes no arquivo para abri-lo.
2. Uma vez que o arquivo do cubo hiperespectral seja importado, modifique a imagem do cubo hiperespectral exibido para mostrar a intensidade de um comprimento de onda espectral específico movendo a barra na parte superior da imagem do cubo para a esquerda (comprimento de onda inferior, por exemplo, 580 nm) ou direita (comprimento de onda mais alto, por exemplo, 638 nm).
   NOTA: O comprimento de onda selecionado é exibido no lado esquerdo desta barra superior (1 na Figura 7).
3. Após a escolha do comprimento de onda de interesse para a análise (por exemplo,a intensidade máxima, que no caso de [TbEu(bpm)(tfaa)₆] é de 613,26 nm), faça um (ou todos) dos três tipos possíveis de análise espectral: (A) a distribuição espectral em forma de imagem (2 na Figura 7); (B) um perfil de intensidade de emissões em uma região de interesse (3 na Figura 7); c Extração de espectro em um ponto ou região de interesse específico (4 na Figura 7).
   1. No caso da distribuição espectral de uma imagem, use a função Crop e Bin para aumentar a relação sinal-ruído na imagem. Para fazer isso, clique no menu superior Processamento e escolha Data e, em seguida, a opção Crop e Bin.
   2. Para um perfil de intensidade de emissão, na imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e selecione o perfil Criar destino ou Criar X ou Criar perfil Y, dependendo se apenas um ponto (Alvo - 5 e 6 na Figura 7) ou uma linha (Perfil - 7 e 8 na Figura 7) precisar ser analisado. Selecione a área de análise arrastando o alvo, o perfil de linha horizontal ou vertical com o cursor e mova-o através do cubo.
      1. Uma vez que o perfil tenha sido devidamente selecionado, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar destino a gráfico. Escolheu a opção de criar um novo gráfico para exibir a intensidade de emissão (eixoy) em função da posição física do alvo (eixox). O espectro aparecerá no novo gráfico que foi inserido (6 e 7 na Figura 7).
         NOTA: Vários alvos podem ser criados, e estes aparecerão como diferentes perfis de emissões coloridas (5 e 6 na Figura 7).
   3. Alternativamente, obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra (9 na Figura 7). Para começar, gire o cursor sobre a imagem do cubo e clique com o botão direito do mouse. Clique nas opções Seleção de Retângulo ou Seleção de Elipse na guia que aparece.
      1. Desenhe a forma de seleção (por exemplo, um retângulo) sobre a região desejada clicando e arrastando o cursor através do cubo. Uma vez que a área tenha sido devidamente selecionada, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar seleção ao gráfico.
      2. Na janela de agregação Adicionar ao gráfico,selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissões do destino e clique em OK.
         NOTA: Uma nova linha colorida (8 na Figura 7) aparecerá no gráfico em que a emissão de destino está sendo mostrada, com a intensidade de emissão como o eixo y e o comprimento de onda no eixo x. Este espectro corresponde à intensidade média da área selecionada para cada comprimento de onda.
4. Uma vez que o espectro é obtido, salve-o antes de selecionar uma nova região porque apenas uma região pode ser selecionada por vez. Para isso, selecione a janela em que contém o gráfico. No menu Arquivo, selecione Salvar como e escolha salvar o gráfico na pasta de escolha, usando o nome de escolha, seja no formato .h5, que pode ser aberto no software PHySpec, ou no formato .csv, que pode ser importado no Excel.

Representative Results

Para ilustrar a configuração do microscópio hiperespectral para a aquisição de dados em um cristal único molecular baseado em Ln (ou seja, [TbEu(bpm)(tfaa)₆], Figura 1a), a Figura 2 mostra uma visão geral do sistema, bem como a colocação correta dos cubos ópticos na configuração. A Figura 3 mostra uma captura de tela do software PHySpec contendo os menus usados durante a aquisição do HSI. A Figura 4 e a Figura 5 mostram o estágio do microscópio com mais detalhes, incluindo a colocação do slide de vidro contendo a amostra a ser analisada. A iluminação UV selecionada foi ligada para mostrar a luminescência vermelha visível do cristal (Figura 4a e 1 na Figura 5). A figura 6a mostra uma imagem de campo brilhante do cristal gravado após ajustar a amostra no foco adequado. A morfologia semelhante à agulha do cristal pode ser claramente vista. A figura 6b,c mostra a imagem do mesmo cristal sob excitação UV com visão completa(Figura 6b) ou iluminação localmente confinada(Figura 6c). Sob a ampla iluminação UV, as diferenças de brilho de emissão das diferentes faces do cristal são imediatamente visíveis. A iluminação confinada pode ser usada como uma opção, principalmente para investigar quaisquer efeitos de energia ou transferência de luz no cristal, o que pode desencadear um comportamento semelhante a um guia de ondas. Neste caso, uma emissão forte é detectada em um ponto não diretamente sob excitação. Isso sugere que a migração eficiente de energia ocorre através do cristal¹³ (5 e 6 na Figura 7).

A partir do cubo hiperespectral adquirido, é possível obter ainda a distribuição espectral na forma de uma imagem representando um comprimento de onda específico, o perfil de intensidade de um comprimento de onda de emissão específica, bem como o espectra de emissão em qualquer pixel ou área do cubo hiperespectral adquirido. Como exemplo, os espectros de emissão dados na Figura 7 (painel 4) mostram as bandas de emissão mais características do íon^{Eu 3+:} a banda observada a 590 nm é atribuída ao dipolo magnético (DM) ⁵D₀→⁷F₁ transição de Eu³⁺, enquanto os picos de emissão na região de 610 a 630 nm decorrem do dipolo elétrico forçado hipersensível (ED) ⁵D₀→⁷F₂ Eu³⁺ transição. A razão entre a intensidade integrada dessas duas transições é bem conhecida por ser uma excelente sonda do ambiente químico ao redor do íon^{Ln 3+} na estrutura do cristal único²¹: quanto menor a simetria em torno do íon^{Ln 3+,} maior é a razão ED/MD. Isso permite tirar conclusões sobre o caráter simetria do ambiente químico do Íon^{In 3+.} Além disso, a divisão Stark da transição ⁵D₀→⁷F₂ também pode ser correlacionada com a simetria em torno do Ln³⁺ em seu ambiente cristalográfico – quanto menor a simetria, maior é o número de subníveis Stark. No caso do polimorfo em forma de agulha cristalizado no sistema de cristal triclínico simétrico baixo, a transição ⁵D₀→⁷F₂ se divide em quatro subpicos (espectros mostrados na Figura 7, painel 4). Tal análise é particularmente atraente quando comparaas as propriedades ópticas de vários polimorfos de um cristal luminescente. Anteriormente, demonstramos que as informações sobre o ambiente químico deduzidas da análise óptica correlacionaram-se bem com a estrutura de cristal molecular obtida pela análise de raios-X de cristal único¹³. Além disso, o perfil espectral ao longo das diferentes faces cristalinas mostradas na Figura 7 (painel 3), indicando emissão mais brilhante na ponta e nas faces laterais, também pode ser correlacionado com o Ln³⁺··· Em³⁺ distâncias de íons nas três direções espaciais (Figura 1b): a embalagem mais densa Em³⁺ ao longo dos eixos perpendiculares à ponta e faces laterais, respectivamente, favorecem a transferência de energia íon-íon. Assim, observa-se o aprimoramento das emissões nas respectivas faces, assim, a anisotropia óptica.

No geral, as diversas opções de análise de dados, mostradas na Figura 7 e na Figura 8,constituem as características mais importantes das informações espectroscópicas e espaciais combinadas, que é possível ser explorada pela análise do HSI de amostras luminescentes.

Figura 1: Estrutura molecular e arranjo cristalográfico. (a) Estrutura do complexo heterodinuclear baseado em Ln [TbEu(bpm)(tfaa)₆], onde Ln₁ e Ln₂ são Tb³⁺ e Eu³⁺ íons. Grupos desordenados e átomos de hidrogênio são omitidos para clareza. Código de cor: Eu: ciano escuro; C: cinza; O: vermelho; N: azul; F: verde limão. (b) Representação da embalagem molecular no cristal: (i) vista superior e (ii) visão de ponta da estrutura de cristal único semelhante à agulha com Ln··· Em distâncias (subunidades tfaa e átomos de hidrogênio são omitidos para clareza). (iii) Arranjo de embalagem cristalina dos dimers [TbEu(bmp)(tfaa)₆] (átomos de hidrogênio são omitidos para clareza). (iv) Diagrama das faces de crescimento cristalino do dimer revelando o menor Ln··· Em distâncias nas direções cristalográficas (0 1 0) e (2 -1 1). A figura foi modificada a partir da referência 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral do Sistema de Imagem Hiperespectral. Mostrada é a configuração necessária para o mapeamento de luminescência na região espectral visível usando excitação UV. (a) Visão geral do sistema, onde 1 é o estágio do microscópio, 2 é a seção que contém a configuração óptica, e 3 é o espectrômetro com os detectores visíveis e NIR. (b) Visão aberta da configuração óptica perto do estágio do microscópio (lado direito de a) mostrando a configuração óptica para o experimento: a posição do cubo óptico 4 permanece vazia e o cubo de microscópio confocal é colocado na posição 5, a fim de direcionar a luz através do caminho visível, o cubo visível é colocado na posição 6, a fim de direcionar a luz visível para o caminho de detecção, e o cubo de pinhole confocal é colocado na posição 7, a fim de direcionar a luz para a detecção do caminho visível. (c) Visão aberta da configuração óptica mais próxima dos detectores (lado esquerdo de a), mostrando a posição 8, onde o cubo espectrômetro confocal é colocado para refletir a luz para o espectrômetro e a câmera visível. A inset 9 mostra o parafuso para ajustar a largura de abertura da fenda do espectrômetro. (d) Vista do estágio do microscópio, do computador e da lâmpada de banda larga (usada para excitação UV). No inset, o controlador da lâmpada de banda larga é mostrado com mais detalhes: 10 é o botão liga/desliga, 11 é o botão para controlar a intensidade da lâmpada, e 12 é o botão do obturador. (e) Esquema que mostra o caminho óptico visível/NIR do estágio do microscópio até os detectores, incluindo as posições do cubo óptico de 4 a 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Captura de tela do software PHySpec mostrando o menu com os parâmetros a serem ajustados para o HSI. 1 permite inserir a barra de escala na imagem da câmera colorida; 2 e 3 permitem controlar o tempo de exposição e ganhar valor da câmera colorida, respectivamente; a lente objetiva adequada deve ser selecionada em 4; 5 permite a seleção da abertura do orifício; 6 (Desviador) e 7 (Filtro) permitem escolher o detector e a grade, respectivamente; o tempo de exposição do detector visível é definido em 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visão geral do estágio do microscópio. (a)Colocação do slide de vidro contendo a amostra no estágio, com a iluminação UV ON mostrando a luminescência vermelha da amostra (pequeno ponto vermelho no centro do escorregador de vidro). (b) Vista do estágio do microscópio com o condensador de iluminação de luz branca na parte superior. (c) Controlador de palco mostrando o joystick que controla o movimento do palco nas direções indicadas por setas laranja e amarela (também mostradas em (a). (d) Visão detalhada do botão de foco, que move o palco nas direções indicadas pela seta vermelha (também mostrada em (b)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Os componentes do estágio do microscópio. 1 estágio de microscópio com a amostra no slide de vidro colocada no estágio amostral em cima das lentes objetivas; 2 rodas para ajustar o foco (roda grande) e para direcionar a emissão capturada (roda pequena) apenas para o detector (L), parcialmente para o detector e parcialmente para a câmera (R), ou apenas para as lentes binóculos (olho); 3 roda de filtros de excitação/emissão usada para escolher a faixa de comprimento de onda de excitação. O detalhe à direita mostra o cubo do filtro segurando o filtro UV e o filtro de passagem longa usado neste experimento; 4 na parte superior/inferior são mostrados os botões para mover o feixe de excitação através da amostra, enquanto no meio, o controle de abertura de campo circular; 5 lentes objetivas; 6 Botão ON/OFF da iluminação de luz branca; 7 botão para ajustar o brilho da lâmpada de luz branca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens de microscopia óptica do cristal único analisado. Estas imagens foram obtidas sob(a)iluminação de luz branca, (b) iluminação UV de visão total, utilizando a abertura circular de excitação completamente aberta, e (c) iluminação UV localmente confinada (marcada pelo círculo branco), usando uma abertura circular de excitação mais próxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Captura de tela do software PHySpec mostrando o processo de análise de dados do cubo hiperespectral. Diversos métodos de análise espectrais podem ser aplicados no cubo hiperespectral adquirido: 1 mostra o comprimento de onda escolhido para a distribuição de imagem espectral mostrada em 2; 3 mostra os perfis de intensidade horizontal (7) e vertical (8) de 613,26 nm; 4 mostra o espectro de emissão extraído dos alvos 5 e 6, bem como da área destacada em 9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Aplicação alternativa do HSI sondando a sinergia entre nanopartículas de upconverter e complexos de lantânio. Este exemplo mostra a análise hiperespectral de um sistema híbrido composto por cristais moleculares ([Tb₂(bpm)(tfaa)₆]) combinados com nanopartículas upconverter (NaGdF₄:Tm³⁺, Yb³⁺). (a) Fotomicrografos sob iluminação de luz branca e UV, juntamente com a região de interesse (ROI) utilizada para imagens hiperespectrais sob irradiação de luz de 980 nm. (b) Emissões de Tm³⁺ e Tb³⁺ indiretas monitoradas em uma área de 20 x 20 μm². ( c) A variação da intensidade absoluta das bandas de emissão oscilou em todo o sistema híbrido, indicando alguma variabilidade na quantidade total de material distribuída sobre a superfície. (d) A constância da razão entre a emissão integrada do complexo vs. Tm³⁺: ¹G₄→³H₆ (quadrados) e Tm³⁺: ¹G₄→³F₄ (círculos) confirmou a presença simultânea das duas moieties em todo o sistema híbrido e a interação homogênea entre eles. As barras de escala são de 20 μm nos fotomicrografos e 5 μm em ROIs e mapas espectrais. Fotomicrografias são apresentadas em cores reais. A Figura foi modificada a partir da referência 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo de imagem hiperespectral descrito fornece uma abordagem simples que permite obter informações espectroscópicas em locais precisos da amostra. Utilizando a configuração descrita, a resolução espacial(mapeamento x e y) pode chegar até 0,5 μm, enquanto a resolução espectral pode ser de 0,2 nm para o mapeamento na faixa visível e 0,6 nm para a faixa NIR.

Para realizar o mapeamento hiperespectral em um único cristal, a preparação da amostra segue um procedimento fácil: o cristal pode simplesmente ser colocado em um escorregador de microscopia de vidro, coberto por um vidro de cobertura, conforme necessário. Focar a amostra usando as lentes objetivas adequadas e a imagem de campo brilhante na configuração da Câmera Colorida no software é um passo muito importante durante a fase de pré-análise para obter imagens hiperespectrais melhor resolvidas. Normalmente, maiores intensidades de emissão são obtidas quando a amostra está bem focada. Uma vez feito isso, a escolha dos parâmetros da análise como as contagens x e y e o tamanho da etapa ditará o campo de visão e amostragem espacial, respectivamente do cubo hiperespectral obtido. No entanto, a abertura numérica do objetivo e os comprimentos de onda de excitação/emissão ditam o volume real da amostra que é sondada em cada ponto de aquisição. Por exemplo, para o objetivo utilizado neste estudo, com abertura numérica (NA) de 0,4, e utilizando a excitação na faixa espectral UV (390 nm), o ponto laser focalizado tem um tamanho de aproximadamente 0,6 x 0,6 μm na direção x e y. O tamanho do ponto laser foi calculado pelo site (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, acessado em 26 de setembro de 2019). Se o tamanho da etapa escolhida for maior do que a amostragem espacial, pode-se realmente estar amostrando uma área menor do que a dada pelo tamanho da etapa. Se a amostra for homogênea, a subamostragem pode não ser um problema. No entanto, se as variações espaciais na amostra são importantes para detectar, a amostragem ideal é obtida com um tamanho de passo definido pela metade do tamanho do raio laser na amostra. O tempo de exposição escolhido e a intensidade da iluminação selecionada pelo UV controlarão a intensidade dos espectros obtidos. Tais parâmetros variam de amostra para amostra, dependendo da intensidade de emissão e da sensibilidade para a excitação UV.

Neste ponto, as etapas críticas dentro do protocolo podem ser listadas como: o alinhamento do sistema óptico, a correta colocação dos cubos ópticos, a regulação da abertura circular das aberturas de excitação e fenda do detector, a escolha do pinhole, o foco da amostra na câmera colorida usando as lentes objetivas adequadas, a intensidade da lâmpada de banda larga e a escolha adequada do cubo de filtro de longa distância (permitindo excitação UV) , bem como a escolha do tamanho da etapa adequada e o tempo de exposição como mencionado acima. Por último, as luzes do quarto devem estar apagadas durante todo o tempo da aquisição do cubo hiperespectral.

Em caso de má detecção de sinal, seja com a câmera colorida ou com o espectrômetro, a solução de problemas da técnica deve incluir verificar cuidadosamente cada um dos passos críticos dados acima, antes de iniciar a aquisição do cubo hiperespectral. A configuração do sinal de saída no estágio do microscópio também é importante. As três configurações possíveis são: olho (100 % do sinal de saída é enviado para o suporte binóculo do microscópio), L (100 % do sinal de saída é enviado para os detectores) e R (80 % do sinal de saída é enviado para os detectores e 20 % para o suporte binóculo do microscópio). Durante a aquisição do cubo hiperespectral, a configuração R ou L deve ser utilizada. Se todos os parâmetros acima listados forem devidamente escolhidos, informações espaciais e espectrais de alta resolução da amostra podem ser obtidas.

Algumas possíveis modificações da técnica aqui descritas podem ser exemplificadas pela imagem hiperespectral de outros sistemas, tais como micropartículas luminescentes¹⁴ ou sistemas híbridos ópticos compostos por cristais moleculares combinados com nanopartículas de upconverter(Figura 8)¹¹. Nestes exemplos, o diodo laser NIR (980 nm) foi usado como fonte de excitação, substituindo a excitação UV, ao mesmo tempo em que detectou a emissão visível gerada. No último exemplo do sistema híbrido, o HSI revelou a homogeneidade das películas híbridas que combinam nanopartículas de upconverter (NaGdF₄:Tm³⁺, Yb³⁺) e [Tb₂(bpm)(tfaa)₆] cristais em um sistema isotrópico multiondulado-responsivo, exibindo transferência de energia entre materiais e moléculas(Figura 8)¹¹. Além disso, utilizando-se o detector InGaAs do sistema, torna-se possível a detecção de emissões na região espectral NIR (1000 a 1700 nm). Isso é de particular interesse ao buscar a investigação de sondas ópticas baseadas em NIR para aplicações biomédicas³. Neste caso, a configuração de cubos ópticos do sistema (Figura 2e) deve ser definida para o caminho NIR. No caso da emissão de excitação NIR-NIR, uma das limitações da técnica hiperespectral aqui descrita torna-se evidente: por ser dependente do comprimento de onda, a resolução espectral na região nIR é menor do que a da detecção visível, ou seja, aproximadamente 0,6 nm(vs. 0,2 nm). Além disso, para características sub-1 μm, por exemplo, cristais moleculares menores, nanopartículas ou sistemas híbridos, a resolução espacial, que é ditada pela configuração do sistema (objetivos usados e comprimentos de onda de excitação/emissão), torna-se outra limitação potencial.

Finalmente, (independentemente da configuração e do regime de comprimento de onda escolhido) a manipulação de dados pode ser feita com o software do instrumento ou, como mostrado para o caso dos perfis espectrais, pode ser exportada para ser analisada em outros pacotes de software, como Origin® ou Microsoft Excel. Em nosso exemplo, a anisotropia óptica do cristal também foi prontamente revelada na imagem da câmera colorida, ou seja, pela forte variação de intensidade ao longo das diferentes faces de cristal. Além disso, sob a ampla excitação UV, diferentes intensidades de emissão são obtidas dependendo de qual face é analisada (Figura 7). A possibilidade de obter o perfil de intensidade de emissão em diferentes pontos de interesse no cristal (metas na Figura 7) permite ainda estudar a variação na intensidade das emissões e, se presente, também em forma espectral. O polimorfo em bloco do [TbEu(bpm)(tfaa)₆] constitui um exemplo onde duas faces de cristal apresentaram intensidades de emissão igualmente altas e uma intensidade de emissão mais baixa para o terceiro¹³. Dependendo disso, no caso de um sistema sem anitropia, a intensidade das emissões seria a mesma para todas as faces cristalinas.

Métodos complementares para sondar anisotropia óptica estão, por exemplo, relacionados com a presença de emissão polarizada a partir de uma amostra. Estes incluem memória de polarização ou elipse espectroscópica. A primeira consiste na correlação entre o estado de polarização da luz emitida pelo material com o estado de polarização da luz de excitação incidente,^22,23 enquanto o segundo mede a mudança no estado de polarização da luz após ser refletido obliquamente por um fino filme amostral²⁴. No entanto, uma vantagem de usar a imagem hiperespectral como ferramenta de sondagem da anisotropia óptica, como mostrado aqui, vem com o fato de que a presença de polarização não é um requisito para análise amostral. Além disso, a preparação da amostra não requer a fabricação de pelídeos finos, nem uma orientação muito cuidadosa do cristal em relação ao incidente e a luz coletada. Esses aspectos tornam a técnica do HSI potencialmente mais aplicável. Além disso, as características anisotrópicas são prontamente visualizadas após a aquisição de imagens, e a análise de dados é simples (como exemplificado acima).

Considerando um escopo mais amplo, a significância da técnica hsi pode ser atribuída à sua característica única para corelacionar o sinal óptico com características dependentes do ambiente. Por exemplo, tal conexão é essencial para melhorar a compreensão das interações nanobiológicas^3,,15,,16 no campo crescente da nanomedicina ou mesmo para entender a relação estrutura-propriedades na ciência dos materiais^{10,,11,,12,13}. Como tal, futuras aplicações potenciais da técnica descrita aqui podem ser nomeadas como, mas não se limitando a: análise de amostras biológicas in vitro, ex vivo e in vivo realizando o mapeamento de moléculas de interesse biológico^4,6, adaptação do estágio do microscópio para estudar propriedades opto-eletrônicas específicas do ambiente(por exemplo, amostras embutidas em circuitos elétricos), sensoriamento óptico de temperatura^8,,15 (adicionando um controlador de temperatura ao estágio do microscópio) ou sensoriamento de gás (adaptando uma câmara de gás ao estágio do microscópio). O HSI foi ainda demonstrado como adequado para técnicas de excitação de fluorescência em vez de emissão de fluorescência²⁵. Um bom exemplo do uso dessa adaptação técnica hiperespectral particular é a detecção de células cancerígenas em tecidos biológicos⁶. Consequentemente, o protocolo aqui descrito tem o potencial de ser amplamente estendido ao estudo de características espectroscópicas de muitos tipos diferentes de estruturas luminescentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number