Hyperspektral billeddannelse som et værktøj til at studere optisk anisotropi i Lanthanide-baserede molekylære enkeltkrystaller

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at opnå selvlysende hyperspektrale billeddannelsesdata og til at analysere optiske anisotropifunktioner i lanthanidebaserede enkeltkrystaller ved hjælp af et Hyperspektral imagingsystem.

Abstract

I dette arbejde beskriver vi en protokol for en ny anvendelse af hyperspektral billeddannelse (HSI) i analysen af selvlysende lanthanid (Ln^{3 +})-baserede molekylære enkeltkrystaller. Som repræsentativt eksempel valgte vi en enkelt krystal af det heterodinukleare ln-baserede kompleks [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm=2,2'-bipyrimidin, tfaa^– =1,1,1-trifluoractylacetonate), der udviser lys synlig emission under UV-excitation. HSI er en ny teknik, der kombinerer 2-dimensionel rumlig billeddannelse af en selvlysende struktur med spektrale oplysninger fra hver pixel i det opnåede billede. Konkret gav HSI på enkelte krystaller af [Tb-Eu]-komplekset lokale spektrale oplysninger, der afslørede variationen i luminescensintensiteten på forskellige steder langs de undersøgte krystaller. Disse ændringer blev tilskrevet den optiske anisotropi til stede i krystallen, som skyldes de forskellige molekylære pakning af Ln^{3 +} ioner i hver af retningerne af krystalstruktur. Den beskrevne HSI-teknik er et eksempel på egnetheden af en sådan teknik til spektro-rumlige undersøgelser af molekylære materialer. Men det er vigtigt, at denne protokol let kan udvides til andre typer selvlysende materialer (såsom mikron-størrelse molekylære krystaller, uorganiske mikropartikler, nanopartikler i biologiskvæv, eller mærkede celler, blandt andre), hvilket åbner mange muligheder for en dybere undersøgelse af struktur-ejendom relationer. I sidste ende vil sådanne undersøgelser give viden, der skal udnyttes til at udarbejde avancerede materialer til en bred vifte af applikationer fra bioimaging til teknologiske applikationer, såsom waveguides eller optoelektroniskudstyr.

Introduction

Hyperspectral Imaging (HSI) er en teknik, der genererer et rumligt kort, hvor hver x-y koordinat indeholder en spektral information, der kunne være baseret på enhver form for spektroskopi, nemlig fotoluminescens, absorption og spredning spektroskopier^1,2,3. Som følge heraf opnås et 3-dimensionelt datasæt (også kaldet "hyperspektralkube"), hvor x-y-koordinaterne er de rumlige akser, og z-koordinatet er de spektrale oplysninger fra den analyserede prøve. z Derfor indeholder den hyperspektrale terning både rumlige og spektrale oplysninger, hvilket giver en mere detaljeret spektroskopisk undersøgelse af prøven end traditionel spektroskopi. Mens HSI har været kendt i årevis inden for telemåling(f.eks. geologi, fødevareindustri^4),viste det sig for nylig som en innovativ teknik til karakterisering af nanomaterialer^2,5 eller sonder til biomedicinske anvendelser^3,6,7,8. Generelt er det ikke begrænset til UV / synlig / nær-infrarød (NIR) domæne, men kan også udvides ved hjælp af andre strålingskilder, såsom røntgenstråler - for eksempel for at karakterisere elementær fordeling i forskellige materialer⁹ - eller Terahertz stråling, hvor HSI blev brugt til at udføre termisk sensing i biologiske væv⁸. Desuden er fotoluminescens kortlægning blevet kombineret med Raman kortlægning at sonde de optiske egenskaber monolayer MoS₂¹⁰. Men blandt de rapporterede anvendelser af optisk HSI er der stadig kun nogle få eksempler på HSI af lanthanidebaserede materialer^{11,12,13,14,15,16,17}. For eksempel kan vi nævne: påvisning af kræft i væv^6,analyse af lysindtrængningsdybden i biologisk væv⁷, multiplexeret biologisk billeddannelse³, analyse af multikomponentenergioverførsel i hybridsystemer¹¹og undersøgelse af aggregeringsinducerede ændringer i spektroskopiske egenskaber af konverterende nanopartikler¹². Det er klart, at HSI's tiltrækningskraft skyldes dets egnethed til at skabe viden om miljøspecifik luminescens, hvilket giver samtidige rumlige og spektrale oplysninger om sonden.

Drage fordel af denne kraftfulde teknik, vi heri beskrive en protokol til at undersøge den optiske anisotropi af den heterodinukleare Tb^{3 +}-Eu^{3 +} enkelt krystal [TbEu(bpm) (tfaa)₆] (Figur 1a)¹³. Den optiske anisotropi observeret skyldes de forskellige molekylære pakning af Ln^{3 +} ioner i de forskellige krystallografiske retninger (Figur 1b), hvilket resulterer i nogle krystal ansigter viser lysere, andre viser lysdæmper fotoluminescens. Det blev foreslået, at den øgede luminescensintensitet ved specifikke flader af krystallen var korreleret med mere effektiv energioverførsel langs de krystallografiske retninger, hvor Ln³⁺··· Ln^{3 +} ion afstande var den korteste¹³.

Motiveret af disse resultater, foreslår vi etablering af en detaljeret metode til at analysere optisk anisotropi gennem HSI, der åbner vejen for en bedre forståelse af ion-ion energioverførselsprocesser og afstemmelige selvlysende egenskaber stammer fra specifikke molekylære arrangement^18,19. Disse struktur-egenskaber relationer er blevet anerkendt som vigtige aspekter for innovative optiske materialer design, herunder, men ikke begrænset til waveguide systemer og opto-magnetiske lagringsenheder på nano og mikroskala - løse efterspørgslen efter mere effektive og miniaturiserede optiske systemer²⁰.

Protocol

FORSIGTIG: Det anbefales at bruge sikkerhedsbriller, der er specifikke for den excitationsbølgelængde, der anvendes på alle tidspunkter, når du betjener imageren.

1. Konfiguration af hyperspektrale mikroskop

BEMÆRK: En oversigt over hyperspektrale billeddannelsessystem findes i figur 2a, hvor hovedkomponenterne i imageren beskrives. Billedsystemet kan bruges til at detektere den synlige eller næsten infrarøde (NIR) emission fra en prøve. Afhængigt af hvilken detektion der ønskes (synlig eller NIR), går lyset gennem to forskellige lysveje (Figur 2e). En kombination af forskellige bomdrejningskuber og dichroiske filterkuber (optiske kuber) skal placeres på bestemte positioner i instrumentet for at vælge den pågældende kurve.

1. Tænd for den computer, der er tilsluttet billedsystemet. Tænd computerens skærm.
2. Indstil den relevante optiske kubekonfiguration (Figur 2b,c).
   BEMÆRK: Her er imager konfiguration (optisk terning konfiguration) for HSI kortlægning ved hjælp af UV excitation og synlig emission detektion er beskrevet. Det er dog også muligt at ændre det til NIR excitation og synlig eller NIR-emissionsdetektering, afhængigt af den analyserede prøve. Se afsnittet Repræsentant Resultater for et eksempel.
   1. Fra mikroskopstadiet (1 i figur 2a) og efter emissionsstrålevejen mod detektorerne (3 i figur 2a) skal den første position for en optisk terning (4 i figur 2b) være ledig og placere den konfokale mikroskopoptiske terning (DFM1-P01) i den position, der er angivet som 5 i figur 2b, således at emissionen fra prøven ledes gennem den synlige lysbane.
   2. Når man ser langs den optiske vej mod detektoren, skal den synlige optiske kube (CM1-P01), som indeholder dichroic-spejlet og filtrene, placeres for at dirigere den synlige emission til detektionsvejene i den position, der er angivet som 6 i figur 2b.
   3. Fortsætter stien mod detektoren, og den konfokale pinhole optiske terning (DFM1-P01) placeres i den position, der er angivet som 7 i figur 2b, for at lede lyset gennem den synlige lysdetektionsbane. Derefter skal den optiske kuske konfokale spektrometer (DFM1-P01) efter stien placeres i position 8 i figur 2c, så det udsendte lys når detektoren.
   4. Ved HSI-kortlægningen skal detektorspalterne åbnes manuelt (9 i figur 2c)manuelt for at matche med størrelsen af de anvendte pinholes (ca. 50 mm er optimal).
   5. I PHySpec-softwaren skal du vælge blændet af pinhole (5 i figur 3).
      BEMÆRK: Jo mindre pinhole blænde, jo bedre er HSI opløsning, på bekostning af signalintensiteten.
3. Tænd for bredbåndslampen (Figur 2d, indsat) ved at placere kontakten (10 i figur 2d) i ON-positionen. For at styre intensiteten af excitationslyset drejes knappen angivet med 11 (Figur 2d) til højere (32 – laveste intensitet) eller lavere værdier (1 – højeste intensitet). Hold bredbåndslampens lukker (12 i figur 2d) lukket under opsætningen.
   BEMÆRK: De højere værdier svarer til højere dæmpning af den effekttæthed, der udsendes af lampen, mens lavere værdier svarer til lavere dæmpning.
4. Tænd for følgende hardware i den rækkefølge, der er angivet nedenfor, ved at indstille deres parametre til ON-positionen:
   1. Tænd for ThorLabs bevægelsescontroller.
   2. Tænd for Nikons strømkilde.
   3. Tænd for ASI-controlleren.
   4. Tænd galvocontrolleren.
   5. Tænd for ProEm-detektoren.
   6. Tænd for Bayspec-detektoren.
5. Ved computeren skal du åbne PHySpec-softwaren ved at dobbeltklikke på dens ikon.
   1. Tryk på F8-tasten på tastaturet for at initialisere IMA Upconversion-systemet, og klik på knappen OK i vinduet Opret forbindelse til system.
      BEMÆRK: Trin 1.5.1. kan også udføres ved at klikke på fanen System og derefter klikke på Opret forbindelse for at komme til vinduet Opret forbindelse til system. Derefter kan der klikkes på OK-knappen for at forbinde billedsystemet til softwaren.
   2. Sørg for, at alle menuer vises på grænsefladen (Farvekamera, ProEm og Bayspec) samt instrumentets kontrolpanel i venstre side af skærmen, som vist i figur 3.

2. Hyperspektral billeddannelse af en [TbEu(bpm)(tfaa)₆] enkelt krystal

1. For at forberede prøven, placere krystal på en mikroskopi glas dias. Hvis det er nødvendigt at bruge højere forstørrelse, dække krystal med et tyndt dækglas og fastgør den med tape, så prøven kan placeres med det tynde dækglas vender mod objektivet.
2. Anbring glasglasset, hvorprøven er fremstillet på mikroskopstadiet, og fastgør den ved hjælp af metalarmene (figur 4a,b).
3. Prøven flyttes ved hjælp af joysticket (figur 4c) i ASI-controlleren for at placere prøven over de mål, der er i brug.
4. Placer den højre filterkube manuelt i hjulet under målene (3 i figur 5) for at vælge lampens UV-excitation og for at lade den synlige emission passere mod detektoren.
   BEMÆRK: Yderligere filterterninger er tilgængelige til at bruge enten grøn eller blå lys excitation, således at have den rigtige filter terning på plads er vigtigt for den relevante excitation bølgelængde.
5. Placer 20X-målet manuelt (angivet med 5 i figur 5) under prøven, og tryk på den hvide knap (6 i figur 5) på venstre side af mikroskopet for at tænde for det hvide lys.
   1. Juster lysstyrken ved at dreje knappen under den hvide lysknap (7 i figur 5).
6. I PHySpec-softwaren skal du trykke på knappen Afspil (video) på farvekameravinduet, hvilket vil medføre erhvervelse af en livescanning.
   1. Hvis farvekameravinduet viser et sort billede, skal du øge eksponeringstiden (2 i figur 3) og/eller gevinstværdien (3 i figur 3),der findes i instrumentets kontrolpanel under fanen Farvekamera. Hvis det viste billede er for lyst, skal eksponeringstiden og/eller gevinstværdien reduceres.
   2. Sørg for, at den forreste knap på højre side af mikroskopet (2 i figur 5) er indstillet til R for at sende 20 % af signalet til kameraet/kikkerten og 80 % af signalet til detektoren.
7. Fokuser på stikprøven ved at justere afstanden mellem mål og trin (figur 4b). Dette gøres ved at dreje knapperne i figur 4d på højre side af mikroskopet.
   BEMÆRK: Den større knap bruges til grove justeringer, mens den mindre knap er til mere sarte og små fokusændringer.
8. Sørg for, at den manuelt valgte målsætning også vælges på softwaren. Klik først på knappen Vis på den øverste menulinje, og klik derefter på en vis/skjul skalalinje for at få vist skalalinjen på billedet (1 i Figur 3). Gå derefter til fanen Galvanometer i instruktionskontrolpanelet, og vælg det anvendte mål (4 i figur 3). Sørg for, at den viste skalalinje er korrekt ved at vælge den korrekte målsætning i softwaren.
9. I softwaren skal du vælge den relevante detektor ved at gå til fanen Diverter (ProEM – 6 i figur 3) og riste ved at gå til tabulatorfilteret (1200 gr/mm i tilfælde af ProEM – 7 i figur 3) under fanen SpectraPro SP-2300 .
10. Åbn bredbåndslampens lukker (12 i figur 2) for at tillade, at prøvens UV-excitation kan finde sted. Drej intensitetsknappen (11 i figur 2d)til den ønskede position (f.eks. 8 – mellemintensitet) for at styre intensiteten af bredbåndslampens (UV) excitation.
    1. Hvis du vil vælge mellem bredfeltbelysning (åben blændeåbning) eller en mindre spotbelysning (mere lukket blænde), skal du styre størrelsen af UV-lampeåbningen ved hjælp af pinden og knapperne i 4 i figur 5.
11. Vælg en bølgelængde under fanen SpectraPro SP-2300 for at observere prøveemissionen.
12. Hvis prøvens emissionsbølgelængder er ukendte, anskaffes der et emissionsspektrum.
    1. I sequenceren skal du klikke på tegnet + for at tilføje en ny sekvens ("node") til erhvervelse af et emissionsspektrum.
       1. Klik på Spektrometer og derefter Spectrum Acquisition (med spektralscanning).
       2. Indtast en minimumbølgelængde (dvs. 400 nm) og en maksimal bølgelængde (dvs. 700 nm), og klik på OK for at indstille det spektrale område, hvor spektret skal registreres.
       3. Vælg den passende eksponeringstid i softwarens venstre sidemenu. Vælg kortere tid (f.eks. 0,1 s) for meget lyse prøver og længere tider (f.eks. 2 s) for dim-udledere.
       4. Reguler excitationseffekten i tilfælde af bredbåndslampens (UV) excitation (se trin 1.3 ovenfor).
          BEMÆRK: I tilfælde af NIR diode excitation, kan det justeres fra neutral tæthed drop-down menuen i venstre side af PHySpec software.
    2. På sequenceren skal du klikke på dobbeltafspilningsknappen for at køre hele sekvensen. Når frekvenserne er vist, skal du notere sig de regioner, der er interessante for påvisning af stikprøveemissionen (f.eks. 580-640 nm for Tb³⁺- og EU^3+-baseredeprøver).
    3. Efter behov skal du optimere signalregistreringen ved enten at ændre stikprøvens fokus eller ved at justere eksponeringstiden i PHySpec-softwaren. Opnå yderligere optimering af signaldetektion en forøgelse af prøveemissionsintensiteten ved at ændre effekten af excitationskilden (bredbåndslampen), som beskrevet ovenfor.
13. Juster eksponeringstiden (f.eks. 0,5 s – 2 i figur 3) og forstærkning (3 i figur 3)i farvekameraet i overensstemmelse hermed for at opnå et billede af god kvalitet. Hvis det er nødvendigt, skal du føje skalalinjen til billedet ved at klikke på knappen Vis/skjul skalalinjen i anden række i menuen øverst i PHySpec-softwarevinduet.
14. Anbefaling: Før den hyperspektrale terning anskaffes, skal der optages et klart feltoptisk mikroskopibillede af krystallen under hvidt lys (figur 6a) og/eller UV-fuld (figur 6b) eller begrænset (figur 6c) belysning (UV-belysning, der styres af lukkeråbningen, vist som 4 i figur 5). For at gøre dette, med prøven i fokus, skal du klikke på play-knappen på farvekameraet.
15. Klik på Filer, og eksporter derefter vinduesvisning, vælg det ønskede format for at eksportere det angivne billede, og gem filen med den ønskede filtypenavn (.h5, . JPEG).
16. Før du erhverver det hyperspektrale billede, skal du slukke for den hvide lysbelysning samt lyset i rummet.
17. For at opnå den hyperspektrale terning, skrive en ny sekvens. Derfor skal du i sequenceren klikke på tegnet + for at tilføje en ny node.
    1. Klik på Confocal Imager.
       1. Klik på Multi-Spectrum Acquisition. Her defineres det ønskede synsfelt af det antal punkter, der skal hentes i x- og y-retningen og trinstørrelsen. Brug for eksempel 100 punkter i x og 100 punkter i y med en 5 μm trinstørrelse for at opnå et billede på 500 x 500 μm.
          Bemærk: Det samlede antal anskaffelsespoint og integrationstiden på hvert punkt vil direkte påvirke den samlede anskaffelsestid for den hyperspektrale kube.
          1. Indtast den ønskede X-position (f.eks. 100) og Y-position (f.eks. 100) samt den ønskede trinstørrelse (f.eks. 5 μm). Vælg indstillingen Hardware for kamerasynkronisering for synlig emissionskortlægning (og indstillingen Software i tilfælde af registrering af fejl). Klik på OK.
18. I sequenceren skal du klikke på den nyligt tilføjede multi-spectrum acquisition linje for at fremhæve noden.
19. Klik på knappen Afspil for at køre den markerede node.
    BEMÆRK: Den resterende tid, som købet vil tage, vises ved siden af noden (i minutter, f.eks. 28 min).
20. Når købet er fuldført, skal du gemme den hyperspektrale kube i det relevante filformat (.h5).

3. Hyperspektral dataanalyse

1. Lige efter købet, hvis den gemte hyperspektrale terning ikke åbner automatisk i softwaren, gendanne hyperspektral terning, som blev gemt som .h5 fil, ved at klikke på Fil i den øverste menulinje og derefter svæve markøren og klik på Open File .... Når vinduet med titlen Vælg data (r) for at åbne popper op, skal du vælge den mappe, hvor .h5-filen er gemt, og dobbeltklik på filen for at åbne den.
2. Når den hyperspektrale kubefil er importeret, skal du ændre det viste hyperspektrale kubebillede for at vise intensiteten af en bestemt spektral bølgelængde ved at flytte bjælken øverst på kubebilledet til venstre (lavere bølgelængde, f.eks. 580 nm) eller højre (højere bølgelængde, f.eks. 638 nm).
   BEMÆRK: Den valgte bølgelængde vises i venstre side af denne øverste bjælke (1 i figur 7).
3. Efter valg af den bølgelængde, der er af interesse for analysen (f.eks.den maksimale intensitet, som for [TbEu(bpm)(tfaa)₆] er 613,26 nm), fremstilles en (eller alle) af de tre mulige typer spektralanalyse: (A) spektralefordelingen i form af et billede (2 i figur 7); B) en emissionsintensitetsprofil på tværs af en interesseregion (3 i figur 7) C) udvinding af et spektrum på et bestemt punkt eller område af interesse (4 i figur 7).
   1. I tilfælde af spektralfordelingen fra et billede skal du bruge funktionen Beskær og placering til at øge signal-støj-forholdet i billedet. For at gøre dette, skal du klikke i den øverste menu Processing derefter vælge Data og derefter indstillingen Beskæring og bin.
   2. For en emissionsintensitetsprofil skal du højreklikke på kubebilledet højreklikke og vælge profilen Opret mål eller Opret X eller Opret Y-profil, afhængigt af om der kun skal analyseres ét punkt (Mål - 5 og 6 i figur 7) eller en linje (Profil - 7 og 8 i figur 7). Marker analyseområdet ved at trække i målet, den vandrette eller den lodrette linjeprofil med markøren, og flytte den hen over kuben.
      1. Når profilen er valgt korrekt, skal du højreklikke på området og vælge Føj mål til graf. Valgte muligheden for at oprette en nyy graf for at vise emissionsintensiteten ( y-aksen) som en funktion af målets fysiske position (x-akse). Spektret vil fremgå af den nye graf, der blev indsat (6 og 7 i figur 7).
         BEMÆRK: Der kan oprettes flere mål, og disse vises som forskellige farvede emissionsprofiler (5 og 6 i figur 7).
   3. Alternativt kan du opnå et emissionsspektrum af et bestemt område af prøven (9 i figur 7). Til at begynde med skal du holde markøren over kubebilledet og højreklikke. Klik på indstillingerne For markering af rektangel eller Ellipse under den fane, der vises.
      1. Tegn markeringsfiguren (f.eks. et rektangel) over det ønskede område ved at klikke og trække markøren hen over kuben. Når området er markeret korrekt, skal du højreklikke på området og vælge Føj markering til graf.
      2. Vælg Opret et nyt diagram i det viste vindue Føj til graffor at få vist målets emissionsspektre , og klik på OK.
         BEMÆRK: Der vises en ny farvet linje (8 i figur 7) på grafen, hvormålsemissionen vises, med emissionsintensiteten som y-akse og bølgelængde ved x-aksen. Dette spektrum svarer til den gennemsnitlige intensitet af det valgte område for hver bølgelængde.
4. Når spektret er opnået, skal du gemme det, før du vælger en ny region, fordi kun én region kan vælges ad gangen. Det gør du ved at vælge det vindue, hvor grafen skal indeholde skannes. I menuen Filer skal du vælge Gem som og vælge at gemme grafen i den valgte mappe ved hjælp af navnet på det foretrukne navn, enten i .h5-format, som kan åbnes i PHySpec-softwaren, eller i .csv-format, som kan importeres i Excel.

Representative Results

For at illustrere konfigurationen af hyperspektrale mikroskop til dataindsamling på en Ln-baseret, molekylær enkelt krystal (dvs. [TbEu(bpm) (tfaa)₆], Figur 1a), Figur 2 viser en oversigt over systemet samt den rigtige placering af de optiske terninger i opsætningen. Figur 3 viser et skærmbillede af PHySpec-softwaren, der indeholder de menuer, der blev brugt under HSI-erhvervelsen. Figur 4 og figur 5 viser mikroskopstadiet mere detaljeret, herunder placeringen af glasdiaset, der indeholder den prøve, der skal analyseres. Den valgte UV-belysning blev tændt for at vise krystallens synlige røde lysstyrke (figur 4a og 1 i figur 5). Figur 6a viser et lyst feltbillede af krystallen, der er optaget efter justering af prøven i det rette fokus. Krystallens nålelignende morfologi kan tydeligt ses. Figur 6b,c viser billedet af den samme krystal under UV-excitation med enten fuld visning (Figur 6b) eller lokalt begrænset (figur 6c)belysning. Under den brede UV-belysning er forskellene i emissionslysstyrke fra krystallens forskellige ansigter umiddelbart synlige. Den begrænsede belysning kan bruges som en mulighed, primært til at undersøge eventuelle virkninger af energi eller lysoverførsel i krystallen, hvilket kan udløse waveguide-lignende adfærd. I dette tilfælde påvises en stærk emission i et punkt, der ikke er direkte under excitation. Dette tyder på, at effektiv energimigration finder sted gennem krystal¹³ (5 og 6 i figur 7).

Fra den erhvervede hyperspektrale terning er det yderligere muligt at opnå den spektrale fordeling i form af et billede, der repræsenterer en bestemt bølgelængde, intensitetsprofilen for en bestemt emissionsbølgelængde samt emissionsspektrene ved enhver pixel eller et hvilket som helst område af den erhvervede hyperspektraleterning. F.eks. viser emissionsspektrene i figur 7 (panel 4) de mest karakteristiske emissionsbånd i Eu 3+-ionen: Det bånd, der observeres ved 590 nm, tildeles den magnetiske dipol (MD) ⁵D₀→⁷F_1-overgangen af Eu³⁺, mens emissionstoppene i regionen fra 610 til 630 nm stammer fra den overfølsomme tvungne elektriske dipol (ED) ⁵D₀→ →^{7 F}2 F³⁺ ₂ Eu³⁺ overgang. Forholdet mellem den integrerede intensitet af disse to overgange er velkendt for at være en fremragende sonde af det kemiske miljø omkring Ln^{3 +} ion i strukturen af den enkelte krystal²¹: jo lavere symmetri omkring Ln^{3 +} ion, jo større er ED / MD forholdet. Dette gør det muligt at drage konklusioner om symmetri karakter af det kemiske miljø i Ln^{3 +} ion. Desuden stark opdeling af ⁵D₀→⁷F₂ overgang kan også korreleret med symmetriomkring Ln^{3 +} i sin krystallografiske miljø - jo lavere symmetri, jo højere er antallet af Stark sub-niveauer. I tilfælde af nålelignende polymorf krystalliseret i det lave symmetriske triclinic krystalsystem, opdeles ^{overgangen 5}D₀→⁷F₂ i fire subtoppe (spektre vist i figur 7, panel 4). En sådan analyse er særligt tiltalende, når man sammenligner de optiske egenskaber af flere polymorfer af en selvlysende krystal. Vi har tidligere påvist, at oplysningerne om det kemiske miljø, der udledes af den optiske analyse, korreleret godt med den molekylære krystalstruktur, der opnås ved enkelt krystalrøntgenanalyse^13. Desuden kan spektralprofilen langs de forskellige krystalflader, der er vist i figur 7 (panel 3), og som angiver en lysere emission ved spids- og sidefladerne, også korreleres med Ln³⁺··· Ln^{3 +} ion afstande i de tre rumlige retninger ( Figur1b):den tættere Ln^{3 +} pakning langs akserne vinkelret på spidsen og sideflader, henholdsvis fordel ion-ion energioverførsel. Derfor er emission ekstraudstyr observeret på de respektive ansigter, således, optisk anisotropi.

Samlet set udgør de forskellige muligheder for dataanalyse, der er vist i figur 7 og figur 8,de vigtigste elementer i den kombinerede spektroskopiske og rumlige information, som det er muligt at undersøge ved HSI-analyse af selvlysende prøver.

Figur 1: Molekylær struktur og krystallografisk arrangement. a_{61 2} ^{3+ 3+} Uordnede grupper og brintatomer udelades for klarhedens skyld. Farvekode: Eu: mørk cyan; C: grå; O: rød; N: blå; F: limegrøn. bb) Repræsentation af den molekylære emballage i krystallen: i) topvisning og ii) spidsvisning af den nålelignende enkeltkrystalstruktur med udvalgt intermolekylær og intramolekylær ln··· I afstande (tfaa-underenheder og brintatomer udelades for klarhedens skyld). iii) Krystalpakning af [TbEu(bmp)(tfaa)₆] dimers (brintatomer udelades for klarhedens skyld). (iv) Diagram over dimerens krystalvækstflader, der afslører den korteste ln··· I afstande i (0 1 0) og (2 -1 1) krystallografiske retninger. Tallet er blevet ændret fra reference 13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Oversigt over Hyperspectral Imaging System. Vist er den konfiguration, der kræves for luminescens kortlægning på det synlige spektrale område ved hjælp af UV excitation. (a) Generel visning af systemet, hvor 1 er mikroskopfasen, 2 er den sektion, der indeholder den optiske konfiguration, og 3 er spektrometeret med synlige OG NIR-detektorer. b)Åbent udsyn til den optiske opstilling tæt på mikroskopstadiet (højre side af a), der viser eksperimentets optiske konfiguration: optisk terningposition 4 forbliver tom, og den konfokale mikroskopkube er placeret på position 5 for at føre lyset gennem den synlige terningsvej, den synlige terning placeres i position 6 for at dirigere det synlige lys til detektionsstien, og den konfokale pinhole-kube er placeret på position 7 for at føre lys til den synlige detektionsvej. cc) Åbn visning af det optiske opstillingssted tættere på detektorerne (venstre side af a), der viser position 8, hvor konfokal spektrometerkube cube er placeret for at reflektere lys til spektrometeret og synligt kamera. Indsat 9 viser skruen for at justere åbningsbredden af spektrometeretspalten. dd) Visning af mikroskopstadiet, computer- og bredbåndslampe (anvendes til UV-excitation) controller. I starten vises bredbåndslampens controller med flere detaljer: 10 er tænd/sluk-knappen, 11 er knappen til at styre lampens intensitet, og 12 er udløserknappen. ee) Skema, der viser den synlige/NIR optiske bane fra mikroskopstadiet til detektorerne, herunder de optiske terningpositioner fra 4 til 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Skærmbillede af PHySpec-softwaren, der viser menuen med de parametre, der skal justeres for HSI. 1, gør det muligt at indsætte skalalinjen i farvekamerabilledet; 2 og 3 gør det muligt at kontrollere eksponeringstiden og få værdien af farvekameraet; den korrekte objektive lygteskal vælges i 4; 5 gør det muligt at vælge blænde af pinhole ; 6 (Diverter) og 7 (Filter) gør det muligt at vælge henholdsvis detektor en og risten; eksponeringstiden for den synlige detektor er indstillet i 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Generel visning af mikroskopstadiet. aa) Placering af glasprøveglasset, der indeholder prøven, på stadiet, hvor UV-belysningen ER TÆNDT, der viser prøvens røde lysstyrke (lille rød prik i midten af glasslidsen). bb) Visning af mikroskopfasen med den hvide lysbelysningskondensator ovenpå. cc) Stage controller, der viser det joystick, der styrer trinnets bevægelse i de retninger, der er angivet med orange og gule pile (også vist i litra a). dd) Detaljeret visning af fokusknappen, som flytter scenen i de retninger, der er angivet med den røde pil (også vist i (b)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Komponenterne i mikroskopfasen. 1 mikroskopfase med prøven på glasprøveglasset placeret på prøvetrinet oven på mållinserne 2 hjul til at justere fokus (stort hjul) og til at dirigere den optagne emission (lille hjul) enten kun til detektoren (L), delvist til detektoren og delvist til kameraet (R), eller udelukkende til kikkertlinser (øje); 3 excitation / emission filtre hjul bruges til at vælge excitation bølgelængde område. Detaljerne til højre viser den filterkube, der holder det UV-filter og det langpasfilter, der bruges i dette eksperiment. 4 i toppen / bunden viser knapperne til at flytte excitation stråle gennem prøven, mens der i mellem, den cirkulære felt blænde kontrol; 5 objektive linser; 6 TÆND/FRA-knap på den hvide lysbelysning; 7 knop til at justere lysstyrken på den hvide lyslampe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Optisk mikroskopi billeder af den analyserede enkelt krystal. Disse billeder blev opnået under (a) hvidt lys belysning, (b) full-view UV belysning, ved hjælp af excitation cirkulær blænde helt åben, og (c) lokalt begrænset UV-belysning (markeret med den hvide cirkel), ved hjælp af en tættere excitation cirkulær blænde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Skærmbillede af PHySpec-softwaren, der viser hyperspektrale kubedataanalysesprocessen. Forskellige spektrale analysemetoder kan anvendes på den erhvervede hyperspektrale terning: 1 viser bølgelængden, som blev valgt til den spektrale billedfordeling vist i punkt 2; 3 viser de 613,26 nm vandrette (7) og lodrette (8) intensitetsprofiler; 4 viser emissionsspektrene fra mål 5 og 6 samt fra det område, der er fremhævet i 9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Alternativ anvendelse af HSI, der undersøger synergien mellem konverterende nanopartikler og lanthanidkomplekser. Dette eksempel viser den hyperspektrale analyse af et hybridsystem bestående af molekylære krystaller ([Tb₂(bpm)(tfaa)₆]) kombineret med konverterende nanopartikler (NaGdF₄:Tm³⁺,Yb³⁺). aa) Fotomikrografer under hvidt lys og UV-lysbelysning samt det interesseområde (ROI), der anvendes til hyperspektral billeddannelse under 980 nm lysbestråling. bb) Tm³⁺ og indirekte Tb³⁺ emissioner , der overvåges over et areal på 20 x 20 μm². cc) Variationen af emissionsbåndenes absolutte intensitet svingede i hele hybridsystemet, hvilket tyder på en vis variation i den samlede mængde materiale, der var fordelt over overfladen. dd) Forholdet mellem kompleksets integrerede emission vs. Tm³⁺: ¹G₄→³H₆ (kvadrater) og Tm³⁺: ¹G₄→³F₄ (cirkler) bekræftede den samtidige tilstedeværelse af de to moieties i hele hybridsystemet og det homogene samspil mellem dem. Skalastænger er 20 μm i fotomikrograferne og 5 μm i ROI'er og spektralkort. Fotomikrografer præsenteres i rigtige farver. Figuren er blevet ændret fra reference 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den hyperspektrale billedbehandlingsprotokol, der er beskrevet her, giver en enkel tilgang, der gør det muligt at indhente spektroskopiske oplysninger på præcise steder af prøven. Ved hjælp af den beskrevne opsætning kan den rumlige opløsning(x og y-tilknytning) nå ned til 0,5 μm, mens spektralopløsningen kan være på 0,2 nm for kortlægningen ved det synlige område og 0,6 nm for NIR-området.

For at udføre hyperspektral kortlægning på en enkelt krystal, prøve forberedelse følger en nem procedure: krystal kan simpelthen placeres på et glas mikroskopi dias, dækket af et dækglas efter behov. Fokusering prøven ved hjælp af den rette mål linser og det lyse felt billede på Color Camera set-up i softwaren er et meget vigtigt skridt i løbet af pre-analyse fase for at opnå bedst løst hyperspektrale billeder. Typisk opnås højere emissionsintensiteter, når prøven er godt fokuseret. Når dette er gjort, vil valget af parametrene for analysen, såsom x og y tæller og trinstørrelsen diktere synsfeltet og rumlig prøveudtagning, henholdsvis af den opnåede hyperspektrale terning. Men målets numeriske blænde åbning og excitation / emission bølgelængder diktere den reelle volumen af prøven, der er undersøgt på hvert erhvervelsepunkt. For eksempel, for det mål, der anvendes i denne undersøgelse, med numerisk blænde (NA) på 0,4, og ved hjælp af excitation i UV-spektralområdet (390 nm), den fokuserede laser stedet har en størrelse på ca 0,6 x 0,6 μm i x og y retning. Størrelsen af laserstedet blev beregnet ved hjælp af hjemmesiden (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, tilgås den 26. september 2019). Hvis den valgte trinstørrelse er større end den rumlige prøveudtagning, kan man faktisk udtage prøver af et område, der er mindre end det, der er angivet ved trinstørrelsen. Hvis prøven er homogen, er underprøveudtagning muligvis ikke et problem. Men hvis rumlige variationer i prøven er vigtige at opdage, opnås optimal prøveudtagning med en trinstørrelse, der er sat til halvdelen af laserstrålens størrelse på prøven. Den valgte eksponeringstid og intensiteten af den valgte UV-belysning vil kontrollere intensiteten af de opnåede spektre. Sådanne parametre varierer fra prøve til prøve, afhængigt af emissionsintensiteten og følsomheden over for UV-excitation.

På dette tidspunkt kan de kritiske trin i protokollen er opført som: tilpasningen af det optiske system, korrekt placering af de optiske terninger, regulering af den cirkulære blænde af excitation og detektor slids åbninger, valg af pinhole, fokus på prøven i farvekameraet ved hjælp af den rette objektive linser, intensiteten af bredbånd lampe og korrekt valg af den lange pass filter terning (tillader UV excitation) samt valg af den korrekte trinstørrelse og eksponeringstid som nævnt ovenfor. Endelig skal rummet lys være slukket i hele tiden af hyperspektral terning erhvervelse.

I tilfælde af dårlig signaldetektering enten med farvekameraet eller spektrometeret bør fejlfindingen af teknikken omfatte omhyggelig kontrol af hvert enkelt af de kritiske trin, der er angivet ovenfor, før du starter den hyperspektrale kubeerhvervelse. Konfigurationen af udgangssignalet på mikroskopstadiet er også vigtig. De tre mulige konfigurationer er: øje (100 % af udgangssignalet sendes til mikroskopkikkertholderen), L (100 % af udgangssignalet sendes til detektorerne) og R (80 % af udgangssignalet sendes til detektorerne og 20 % til mikroskopkikkertholderen). Under erhvervelsen af hyperspektrale kuber skal R- eller L-konfigurationen anvendes. Hvis alle ovennævnte parametre er korrekt valgt, kan der indhentes rumlige og spektrale oplysninger i høj opløsning af stikprøven.

Nogle mulige ændringer af den beskrevne teknik kan eksemplificeres ved hyperspektral billeddannelse af andre systemer, såsom selvlysende mikropartikler¹⁴ eller optiske hybridsystemer, der består af molekylære krystaller kombineret med konverterende nanopartikler (figur 8)¹¹. I disse eksempler blev NIR-laserdioden (980 nm) brugt som excitationskilde og erstattede UV-excitation, samtidig med at den genererede synlige emission opdages. I sidstnævnte eksempel på hybridsystemet afslørede HSI homogeniteten af hybridfilm, der kombinerer konverterende nanopartikler (NaGdF_4:Tm³⁺, Yb³⁺) og [Tb₂(bpm)(tfaa)₆] krystaller til et multiwavelength-responsive isotropisk system, der udviser energioverførsel mellem materialer og molekyler ( Figur8)¹¹. Ved hjælp af Systemets InGaAs-detektor bliver det desuden muligt at påvise emissioner i NIR-spektralregionen (1000-1700 nm). Dette er af særlig interesse, når der søges undersøgelse af NIR-baserede optiske sonder til biomedicinske anvendelser³. I dette tilfælde skal systemets konfiguration af optiske kuber (Figur 2e) indstilles til NIR-stien. I tilfælde af NIR excitation-NIR-emission bliver en af begrænsningerne ved den her beskrevne hyperspektrale teknik tydelig: Som bølgelængdeafhængig er spektralopløsningen i NIR-regionen lavere end for synlig detektion, dvs. vs. For sub-1 μm-funktioner, f.eks.

Endelig kan datamanipulation (uanset den valgte HSI-konfiguration og bølgelængdeordning) foretages enten med instrumentets software eller, som vist for spektralprofilerne, eksporteres til analyse i andre softwarepakker som Origin® eller Microsoft Excel. I vores eksempel blev krystallens optiske anisotropi også straks afsløret ved farvekamerabilledet, nemlig af den stærke intensitetvariation langs de forskellige krystalflader. Desuden opnås der under den brede UV-excitation forskellige emissionsintensiteter afhængigt af, hvilket ansigt der analyseres (figur 7). Muligheden for at opnå emissionsintensitetsprofilen i forskellige interessepunkter ved krystallen (mål i figur 7)gør det endvidere muligt at undersøge variationen i emissionsintensiteten og, hvis den er til stede, også i spektralform. Den bloklignende polymorf af [TbEu(bpm)(tfaa)₆] er et eksempel, hvor to krystalflader udviste lige så høje emissionsintensiteter og en lavere emissionsintensitet for den tredje¹³. Expending på dette, i tilfælde af et system uden anisotropi, ville emissionsintensiteten være den samme for alle krystal ansigter.

Komplementære metoder til sonde optisk anisotropi er for eksempel relateret til tilstedeværelsen af polariseret emission fra en prøve. Disse omfatter polarisering hukommelse eller spektroskopisk ellipsomi. Den første består i sammenhængen mellem polariseringtilstand af det lys, der udsendes af materialet med polarisering tilstand af hændelsen excitation lys,^22,23, mens sidstnævnte måler ændringen i polarisering tilstand af lyset efter at være blevet afspejlet skråt af en tynd prøve film²⁴. Men en fordel ved at bruge hyperspektral billeddannelse som et redskab til sondering optisk anisotropi, som vist her, kommer med det faktum, at tilstedeværelsen af polarisering ikke er et krav til prøveanalyse. Desuden kræver prøveforberedelsen ikke fremstilling af tynde film, hverken en meget omhyggelig orientering af krystallen med hensyn til hændelsen og indsamlet lys. Disse aspekter gør HSI's teknik potentielt mere udbredt. Desuden er de anisotropiske funktioner straks visualiseret ved billederhvervelse, og dataanalyse er ligetil (som eksemplificeret ovenfor).

I betragtning af et bredere anvendelsesområde kan betydningen af HSI-teknikken tilskrives dens unikke egenskab ved at forbinde det optiske signal med miljøafhængige funktioner. ^3,15,16 En sådan forbindelse er^10,11,12,13f.eks. Som sådan, fremtidige potentielle anvendelser af den heri beskrevne teknik kan betegnes som, men ikke begrænset til: analyse af biologiske prøver in vitro, ex vivo og in vivo udfører kortlægning af molekyler af biologisk interesse^4,,6, tilpasning af mikroskopstadiet for at studere miljøspecifikke opto-elektroniske egenskaber (f.eks. prøver indlejret i elektriske kredsløb), optisk temperaturmåling^8,15 (ved at tilføje en temperaturregulator til mikroskopstadiet) eller gasregistrering (ved at tilpasse et gaskammer til stadiemikroskopet). HSI er endvidere blevet påvist som egnet til fluorescensekscitationsteknikker i stedet for fluorescensemission²⁵. Et godt eksempel på brugen af denne særlige hyperspektrale teknik tilpasning er påvisning af kræftceller i biologiske væv⁶. Derfor har den beskrevne protokol potentiale til i vid udstrækning at blive udvidet til at omfatte studiet af spektroskopiske træk ved mange forskellige typer af selvlysende strukturer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number