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Chemistry

L’imagerie hyperspectrale comme outil pour étudier l’anisotropie optique dans les cristaux uniques moléculaires à base de Lanthanide

doi: 10.3791/60826 Published: April 14, 2020

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des données d’imagerie hyperspectrales luminescentes et pour analyser les caractéristiques optiques d’anisotropie des cristaux simples à base de lanthanide à l’aide d’un système d’imagerie hyperspectrale.

Abstract

Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour une nouvelle application de l’imagerie hyperspectrale (HSI) dans l’analyse du lanthanide luminescent (Ln3) --basé cristaux moléculaires simples. À titre d’exemple représentatif, nous avons choisi un seul cristal du complexe à base de l’heterodinuclear Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm-2,2'-bipyrimidine, tfaa- 1,1,1-trifluoroacetylacetonate) présentant des émissions visibles lumineuses sous l’excitation UV. HSI est une technique émergente qui combine l’imagerie spatiale bidimensionnelle d’une structure luminescente avec des informations spectrales à partir de chaque pixel de l’image obtenue. Plus précisément, HSI sur des cristaux simples du complexe [Tb-Eu] a fourni des informations spectrales locales dévoilant la variation de l’intensité de la luminescence à différents points le long des cristaux étudiés. Ces changements ont été attribués à l’anisotropie optique présente dans le cristal, qui résulte de l’emballage moléculaire différent des ions Ln3 dans chacune des directions de la structure cristalline. Le HSI décrit ici est un exemple de la pertinence d’une telle technique pour les investigations spectro-spatiales des matériaux moléculaires. Pourtant, il est important de noter que ce protocole peut être facilement étendu à d’autres types de matériaux luminescents (tels que des cristaux moléculaires de taille micron, des microparticules inorganiques, des nanoparticules dans les tissus biologiques ou des cellules étiquetées, entre autres), ouvrant de nombreuses possibilités pour une recherche plus approfondie des relations structure-propriété. En fin de compte, ces recherches fourniront des connaissances à tirer parti de l’ingénierie de matériaux de pointe pour un large éventail d’applications allant du bioimagerie aux applications technologiques, comme les guides d’ondes ou les dispositifs optoélectroniques.

Introduction

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L’imagerie hyperspectrale (HSI) est une technique qui génère une carte spatiale où chaque coordonnées x-y contient une information spectrale qui pourrait être basée sur n’importe quel type de spectroscopie, à savoir la photoluminescence, l’absorption et la dispersion des spectroscopies1,2,3. En conséquence, un ensemble tridimensionnel de données (également appelé «cube hyperspectral») est obtenu, où les coordonnées x-y sont les axes spatiaux et la coordonnées z est l’information spectrale de l’échantillon analysé. Par conséquent, le cube hyperspectral contient des informations spatiales et spectrales, fournissant une étude spectroscopique plus détaillée de l’échantillon que la spectroscopie traditionnelle. Alors que HSI a été connu pendant des années dans le domaine de la télédétection (parexemple, la géologie, les industries alimentaires4), il a récemment émergé comme une technique innovante pour la caractérisation des nanomatériaux2,5 ou des sondes pour les applications biomédicales3,6,7,8. D’une manière générale, il ne se limite pas au domaine UV/visible/proche infrarouge (NIR), mais peut également être étendu à l’aide d’autres sources de rayonnement, telles que les rayons X - par exemple pour caractériser la distribution élémentaire dans différents matériaux9 - ou le rayonnement Terahertz, où HSI a été utilisé pour effectuer la détection thermique dans les tissus biologiques8. En outre, la cartographie de photoluminescence a été combinée avec la cartographie de Raman pour sonder les propriétés optiques du moS210. Pourtant, parmi les applications rapportées de HSI optique, il n’y a encore que quelques exemples sur HSI de matériaux à base de lanthanide11,12,13,14,15,16,17. Par exemple, nous pouvons citer: détection du cancer dans les tissus6, analyse de la profondeur de pénétration de la lumière dans les tissus biologiques7, imagerie biologique multiplexed3, analyse du transfert d’énergie multicomponent dans les systèmes hybrides11, et l’étude des changements induits par l’agrégation dans les propriétés spectroscopiques des nanoparticules upconverting12. De toute évidence, l’attrait de HSI découle de son aptitude à générer des connaissances sur la luminescence spécifique à l’environnement, fournissant des informations spatiales et spectrales simultanées sur la sonde.

Profitant de cette technique puissante, nous décrivons ici un protocole pour étudier l’anisotropie optique de l’heterodinuclear Tb3 '-Eu3 'cristal unique [TbEu(bpm)(tfaa)6] (Figure 1a)13. L’anisotropie optique observée a résulté de l’emballage moléculaire différent des ions Ln3MD dans les différentes directions cristallographiques(figure 1b), résultant en certains visages de cristal montrant plus lumineux, d’autres montrant la photoluminescence gradurée. Il a été suggéré que l’intensité accrue de la luminescence à des faces spécifiques du cristal a été corrélée avec un transfert d’énergie plus efficace le long de ces directions cristallographiques où le Ln3 Les distances d’ion Ln3md étaient les13les plus courtes.

Motivés par ces résultats, nous proposons la mise en place d’une méthodologie détaillée pour analyser l’anisotropie optique à travers HSI, ouvrant la voie à une meilleure compréhension des processus de transfert d’énergie ion-ion et des propriétés luminescentes tunables découlant de l’arrangement moléculaire spécifique18,19. Ces relations structure-propriétés ont été reconnues comme des aspects importants pour la conception innovante des matériaux optiques, y compris, mais sans s’y limiter aux systèmes de guidage d’ondes et aux dispositifs de stockage opto-magnétiques à l’échelle nanométrique et micrométrique, répondant à la demande de systèmes optiques plus efficaces et miniaturisés20.

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Protocol

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CAUTION: Il est recommandé d’utiliser des lunettes de sécurité spécifiques pour la longueur d’onde d’excitation utilisée en tout temps lors de l’utilisation de l’imageur.

1. Configuration du microscope hyperspectral

REMARQUE : Une vue d’ensemble du système d’imagerie hyperspectrale est donnée dans la figure 2a, les principaux composants de l’imageur étant décrits. Le système d’imagerie peut être utilisé pour la détection de l’émission visible ou proche infrarouge (NIR) d’un échantillon. Selon la détection souhaitée (visible ou NIR), la lumière passe par deux chemins de lumière différents(figure 2e). Une combinaison de différents cubes de rotation de faisceau et de cubes de filtre dichroiques (cubes optiques) doit être positionnée à des positions spécifiques dans l’instrument pour sélectionner le chemin respectif.

  1. Puissance sur l’ordinateur qui est connecté au système d’imagerie. Allumez le moniteur de l’ordinateur.
  2. Définissez la configuration appropriée du cube optique(figure 2b,c).
    REMARQUE : Ici, la configuration de l’imageur(configuration de cube optique) pour la cartographie de HSI utilisant l’excitation UV et la détection visible d’émissions est décrite. Cependant, il est également possible de le modifier pour l’excitation NIR et la détection visible ou nIR des émissions, selon l’échantillon analysé. Consultez l’article Résultats des représentants pour un exemple.
    1. À partir de l’étape du microscope (1 dans la figure 2a) et en suivant la voie du faisceau d’émission vers les détecteurs (3 dans la figure 2a), laissez la première position pour un cube optique (4 dans la figure 2b) vacant et placez le cube optique de microscope confocé (DFM1-P01) dans la position indiquée comme 5 dans la figure 2b, de sorte que l’émission de l’échantillon est dirigée par le chemin de lumière visible.
    2. En regardant le long du chemin optique vers le détecteur, placez le cube optique visible (CM1-P01), qui contient le miroir dichroique et les filtres pour diriger l’émission visible vers les voies de détection, dans la position indiquée comme 6 dans la figure 2b.
    3. Poursuivant le chemin vers le détecteur, placez le cube optique de trou d’épingle confocal (DFM1-P01) dans la position indiquée comme 7 dans la figure 2b pour diriger la lumière à travers le chemin de détection visible de la lumière. Ensuite, en suivant le chemin, placez le cube optique de spectromètre confocal (DFM1-P01) en position 8 dans la figure 2c de sorte que la lumière émise atteint le détecteur.
    4. Pour la cartographie HSI, contrôler manuellement l’ouverture de fente du détecteur (9 dans la figure 2c) afin de correspondre à la taille des trous d’épingle qui sont utilisés (environ 50 mm est optimal).
    5. Dans le logiciel PHySpec, choisissez l’ouverture du trou d’épingle (5 dans la figure 3).
      REMARQUE : Plus l’ouverture du trou d’épingle est petite, meilleure est la résolution HSI, au prix de l’intensité du signal.
  3. Activez la lampe à large bande(figure 2d,encart) en plaçant l’interrupteur (10 dans la figure 2d) en position ON. Pour contrôler l’intensité de la lumière d’excitation, tournez le bouton indiqué par 11(figure 2d) à plus haut (32 - intensité la plus basse) ou des valeurs inférieures (1 - intensité la plus élevée). Gardez l’obturateur à large bande (12 dans la figure 2d) fermé pendant la configuration.
    REMARQUE : Les valeurs plus élevées correspondent à une atténuation plus élevée de la densité de puissance émise par la lampe, tandis que les valeurs inférieures correspondent à une atténuation plus faible.
  4. Activez le matériel suivant dans l’ordre donné ci-dessous en définissant leurs commutateurs dans la position ON :
    1. Allumez le contrôleur de mouvement ThorLabs.
    2. Allumez la source d’énergie Nikon.
    3. Allumez le contrôleur ASI.
    4. Allumez le contrôleur Galvo.
    5. Allumez le détecteur ProEm.
    6. Allumez le détecteur Bayspec.
  5. À l’ordinateur, ouvrez le logiciel PHySpec en cliquant doublement sur son icône.
    1. Appuyez sur la touche F8 sur le clavier afin d’initialiser le système IMA Upconversion et cliquez sur le bouton OK sur la fenêtre Connect to System.
      REMARQUE : Étape 1.5.1. peut également être effectué en cliquant sur l’onglet Système, puis en cliquant sur Connect to arrivez à la fenêtre Connect to System. Ensuite, le bouton OK peut être cliqué pour connecter le système d’imagerie au logiciel.
    2. Assurez-vous que tous les menus apparaissent sur l’interface (caméra couleur, ProEm et Bayspec) ainsi que le panneau de commande de instruments, sur le côté gauche de l’écran, comme indiqué dans la figure 3.

2. Imagerie hyperspectrale d’un [TbEu(bpm)(tfaa)6] cristal unique

  1. Afin de préparer l’échantillon, placez le cristal sur une glissière en verre de microscopie. Dans le cas où il est nécessaire d’utiliser un grossissement plus élevé, couvrir le cristal avec un verre à couverture mince et le fixer avec du ruban adhésif, de sorte que l’échantillon peut être placé avec le verre de couverture mince face à l’objectif.
  2. Placez la glissière en verre sur laquelle l’échantillon a été préparé sur la scène du microscope et fixez-la à l’aide des bras métalliques(figure 4a,b).
  3. Déplacez l’échantillon à l’aide du joystick(figure 4c) du contrôleur ASI afin de placer l’échantillon sur les objectifs utilisés.
  4. Placez manuellement le cube de filtre droit dans la roue sous les objectifs (3 dans la figure 5) pour sélectionner l’excitation UV de la lampe et pour laisser passer l’émission visible vers le détecteur.
    REMARQUE : Des cubes de filtre supplémentaires sont disponibles pour utiliser l’excitation verte ou bleue de lumière, ainsi, ayant le cube de filtre droit en place est important pour la longueur d’onde appropriée d’excitation.
  5. Placez manuellement l’objectif 20X (indiqué par 5 dans la figure 5) sous l’échantillon et appuyez sur le bouton blanc (6 dans la figure 5) sur le côté gauche du microscope pour allumer la lumière blanche.
    1. Ajustez la luminosité en tournant le bouton sous le bouton d’alimentation de la lumière blanche (7 dans la figure 5).
  6. Dans le logiciel PHySpec, appuyez sur le bouton Play (vidéo) sur la fenêtre de la caméra couleur, ce qui entraînera l’acquisition d’un scan en direct.
    1. Si la fenêtre de la caméra couleur affiche une image noire, augmentez le temps d’exposition (2 dans la figure 3) et/ou la valeur de gain (3 dans la figure 3) trouvée dans le tableau de contrôle des instruments, sous l’onglet Caméra couleur. Si l’image vue est trop lumineuse, diminuez le temps d’exposition et/ou gagnez de la valeur.
    2. Assurez-vous que le bouton avant sur le côté droit du microscope (2 dans la figure 5) est réglé en R afin d’envoyer 20% du signal à la caméra/ jumelles et 80% du signal au détecteur.
  7. Concentrez-vous sur l’échantillon en ajustant la distance entre l’objectif et l’étape(figure 4b). Ceci est fait en tournant les boutons montrés dans la figure 4d sur le côté droit du microscope.
    REMARQUE : Le bouton plus grand est utilisé pour les réglages grossiers, tandis que le bouton plus petit est pour des changements de mise au point plus délicats et plus petits.
  8. Assurez-vous que l’objectif choisi manuellement est également sélectionné dans le logiciel. Tout d’abord, cliquez sur le bouton Afficher dans la barre du menu supérieur, puis cliquez sur une barre d’échelle Afficher/cacher pour afficher la barre d’échelle sur l’image(1 dans la figure 3 ). Ensuite, rendez-vous à l’onglet Galvanomètre dans le panneau de contrôle d’instruction et sélectionnez l’objectif utilisé (4 dans la figure 3). Assurez-vous que la barre d’échelle affichée est correcte en sélectionnant l’objectif approprié dans le logiciel.
  9. Dans le logiciel, sélectionnez le détecteur approprié en allant à l’onglet Diverter (ProEM - 6 dans la figure 3) et les grilles en allant à l’onglet Filtre (1200 gr/mm en cas de ProEM - 7 dans la figure 3) sous l’onglet SpectraPro SP-2300 .
  10. Ouvrez l’obturateur à large bande (12 dans la figure 2) pour permettre l’excitation UV de l’échantillon à prendre place. Tournez le bouton d’intensité (11 dans la figure 2d) à la position désirée (p. ex., 8 - intensité intermédiaire) pour contrôler l’intensité de l’excitation de la lampe à large bande (UV).
    1. Pour choisir entre un éclairage de champ large (ouverture ouverte) ou un éclairage spot plus petit (ouverture plus fermée), contrôler la taille de l’ouverture du champ de lampe UV à l’aide du bâton et des boutons indiqués dans 4 dans la figure 5.
  11. Sous l’onglet SpectraPro SP-2300, sélectionnez une longueur d’onde pour observer l’émission de l’échantillon.
  12. Si les longueurs d’onde d’émission de l’échantillon sont inconnues, acquérez un spectre d’émissions.
    1. Dans le séquenceur, cliquez sur le signe ' pour ajouter une nouvelle séquence ("nœud") pour l’acquisition d’un spectre d’émission.
      1. Cliquez sur Spectrometer, puis Spectrum Acquisition (avec balayage spectral).
      2. Entrez une longueur d’onde minimale (c.-à-d. 400 nm) et une longueur d’onde maximale (c.-à-d. 700 nm) et cliquez sur OK pour définir la plage spectrale dans laquelle le spectre sera enregistré.
      3. Choisissez le temps d’exposition adéquat dans le menu latéral gauche du logiciel. Choisissez des temps plus courts (p. ex., 0,1 s) pour des échantillons très brillants et des temps plus longs (p. ex., 2 s) pour les dim émetteurs.
      4. Ajuster la puissance d’excitation en cas d’excitation de la lampe à large bande (UV) (voir étape 1.3 ci-dessus).
        REMARQUE : En cas d’excitation de diodes NIR, il peut être ajusté à partir du menu de chute de densité neutre sur le côté gauche du logiciel PHySpec.
    2. Sur le séquenceur, cliquez sur le bouton double jeu pour exécuter toute la séquence. Une fois le spectre montré, notez les régions d’intérêt pour la détection de l’émission de l’échantillon(p. ex. 580 à 640 nm dans le cas de Tb3md- etd’échantillonsbasés sur Eu 3MD).
    3. Au besoin, optimisez la détection du signal en modifiant l’orientation de l’échantillon ou en ajustant le temps d’exposition dans le logiciel PHySpec. Améliorer davantage la détection du signal grâce à l’augmentation de l’intensité des émissions de l’échantillon en modifiant la puissance de la source d’excitation (lampe à large bande), telle que décrite ci-dessus.
  13. Ajuster le temps d’exposition (p. ex., 0,5 s à 2 dans la figure 3) et le gain (3 dans la figure 3) de la caméra couleur en conséquence, afin d’obtenir une image de bonne qualité. Si nécessaire, ajoutez la barre d’échelle à l’image en cliquant sur le bouton Afficher/ masquer la barre d’échelle à la deuxième rangée du menu en haut de la fenêtre logicielle PHySpec.
  14. Recommandation : Avant d’acquérir le cube hyperspectral, enregistrez une image de microscopie optique de champ lumineux du cristal sous la lumière blanche(figure 6a) et/ou UV pleine (figure 6b) ou l’éclairage confiné(figure 6c) (illumination UV contrôlée par l’ouverture d’obturation, indiqué comme 4 dans la figure 5). Pour ce faire, avec l’échantillon au point, cliquez sur le bouton de lecture de la caméra couleur.
  15. Cliquez sur Fichier, puis Export Window View, choisissez le format désiré pour exporter l’image obtenue, et enregistrer le fichier avec l’extension désirée (.h5, . JPEG).
  16. Avant d’acquérir l’image hyperspectrale, éteignez l’éclairage de la lumière blanche ainsi que la lumière de la pièce.
  17. Pour obtenir le cube hyperspectral, écrivez une nouvelle séquence. Par conséquent, dans le séquenceur, cliquez sur le signe ' pour ajouter un nouveau nœud.
    1. Cliquez sur Confocal Imager.
      1. Cliquez sur Multi-Spectrum Acquisition. Ici, le champ de vision souhaité est défini par le nombre de points à acquérir dans les directions x et y et la taille de l’étape. Par exemple, utilisez 100 points en x et 100 points en y avec une taille d’étape de 5 m pour obtenir une image de 500 par 500 m.
        Remarque : Le nombre total de points d’acquisition et le temps d’intégration à chaque point auront une incidence directe sur le temps total d’acquisition du cube hyperspectral.
        1. Entrez la position X souhaitée (p. ex., 100) et la position Y (p. ex., 100) compte ainsi que la taille d’étape souhaitée (p. ex., 5 m). Sélectionnez l’option Matériel pour la synchronisation de la caméra, pour la cartographie des émissions visibles (et l’option Logiciel en cas de détection NIR). Cliquez sur OK.
  18. Dans le séquenceur, cliquez sur la nouvelle ligne d’acquisition multi-spectres pour mettre en évidence le nœud.
  19. Cliquez sur le bouton Lire le bouton Lire le rôle de nœud sélectionné.
    REMARQUE : Le temps restant que prendra l’acquisition apparaîtra à côté du nœud (en quelques minutes, p. ex., 28 min).
  20. Une fois l’acquisition terminée, enregistrez le cube hyperspectral dans le format de fichier approprié (.h5).

3. Analyse des données hyperspectrales

  1. Juste après l’acquisition, si le cube hyperspectral enregistré ne s’ouvre pas automatiquement dans le logiciel, récupérer le cube hyperspectral, qui a été enregistré comme fichier .h5, en cliquant sur Fichier dans la barre du menu haut, puis planer le curseur et cliquez sur Open File .... Lorsque la fenêtre intitulée Données Select(s) pour ouvrir apparaît, choisissez le dossier où le fichier .h5 est enregistré et double clic sur le fichier pour l’ouvrir.
  2. Une fois que le fichier cube hyperspectral est importé, modifiez l’image hyperspectrale affichée du cube pour montrer l’intensité d’une longueur d’onde spectrale spécifique en déplaçant la barre sur le dessus de l’image cube vers la gauche (longueur d’onde inférieure, par exemple, 580 nm) ou à droite (longueur d’onde plus élevée, par exemple, 638 nm).
    REMARQUE : La longueur d’onde sélectionnée est affichée sur le côté gauche de cette barre supérieure (1 dans la figure 7).
  3. Après avoir choisi la longueur d’onde de l’intérêt pour l’analyse(par exemple, l’intensité maximale, qui dans le cas de [TbEu(bpm)(tfaa)6] est de 613,26 nm), faire un (ou la totalité) des trois types possibles d’analyse spectrale: (A) la distribution spectrale sous la forme d’une image (2 dans la figure 7); (B) un profil d’intensité des émissions dans une région d’intérêt (3 à la figure 7); (C) extraction d’un spectre à un point ou une région d’intérêt spécifique (4 dans la figure 7).
    1. Dans le cas de la distribution spectrale d’une image, utilisez la fonction Culture et Bac pour augmenter le rapport signal-bruit dans l’image. Pour ce faire, cliquez sur le traitement du menu en haut, puis choisissez les données, puis l’option Crop and Bin.
    2. Pour un profil d’intensité d’émission, sur l’imagecube, cliquez à droite et sélectionnez le profil Créer la cible ou créer X ou créer un profil Y selon si un seul point (cible - 5 et 6 dans la figure 7 ) ou une ligne (Profil - 7 et 8 dans la figure 7) doit être analysée. Sélectionnez la zone d’analyse en faisant glisser la cible, le profil horizontal ou le profil de la ligne verticale avec le curseur et déplacez-la à travers le cube.
      1. Une fois que le profil a été correctement sélectionné, cliquez à droite sur la région et sélectionnez la cible Add to Graph. Choisissez l’option de créer un nouveau graphique pour afficher l’intensitéd’émission (y axe) en fonction de la position physique de la cible(axe x). Le spectre apparaîtra sur le nouveau graphique qui a été inséré (6 et 7 dans la figure 7).
        REMARQUE : Plusieurs cibles peuvent être créées, et celles-ci apparaîtront sous forme de profils d’émissions de couleur différente (5 et 6 dans la figure 7).
    3. Par ailleurs, obtenir un spectre d’émissions d’une zone spécifique de l’échantillon (9 dans la figure 7). Pour commencer, planez le curseur sur l’image du cube et cliquez à droite. Cliquez sur les options Rectangle Selection ou Ellipse Selection sur l’onglet qui apparaît.
      1. Dessinez la forme de sélection (p. ex., un rectangle) sur la région désirée en cliquant et en faisant glisser le curseur sur le cube. Une fois que la zone a été correctement sélectionnée, cliquez à droite sur la région et sélectionnez la sélection Add Selection to Graph.
      2. À la fenêtre apparaissant Ajouter au graphique, sélectionnez Créer un nouveau graphique pour afficher les spectres d’émission de la cible et cliquez sur OK.
        REMARQUE : Une nouvelle ligne colorée (8 dans la figure 7) apparaîtra sur le graphique dans lequel l’émission cible est affichée, avec l’intensité d’émission comme l’axe y et la longueur d’onde à l’axe x. Ce spectre correspond à l’intensité moyenne de la zone sélectionnée pour chaque longueur d’onde.
  4. Une fois le spectre obtenu, enregistrez-le avant de choisir une nouvelle région parce qu’une seule région peut être sélectionnée à la fois. Pour ce faire, sélectionnez la fenêtre dans laquelle contient le graphique. Dans le menu Fichier, sélectionnez Enregistrer comme et choisir d’enregistrer le graphique dans le dossier de choix, en utilisant le nom de choix, soit en format .h5, qui peut être ouvert dans le logiciel PHySpec, ou en format .csv, qui peut être importé dans Excel.

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Representative Results

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Pour illustrer la configuration du microscope hyperspectral pour l’acquisition de données sur un cristal unique moléculaire à base de Ln (c.-à-d., [TbEu(bpm)(tfaa)6], Figure 1a), figure 2 montre une vue d’ensemble du système ainsi que le bon placement des cubes optiques dans la configuration. La figure 3 montre une capture d’écran du logiciel PHySpec contenant les menus utilisés lors de l’acquisition de HSI. La figure 4 et la figure 5 montrent plus en détail l’étape du microscope, y compris le placement de la glissière en verre contenant l’échantillon à analyser. L’éclairage UV sélectionné a été allumé pour montrer la luminescence rouge visible du cristal(figure 4a et 1 dans la figure 5). La figure 6a montre une image de champ lumineux du cristal enregistrée après ajustement de l’échantillon dans la mise au point appropriée. La morphologie aiguille-comme du cristal peut être clairement vu. La figure 6b,c montre l’image du même cristal sous l’excitation UV avec la vue complète (figure 6b) ou localement confinée ( figure6c) illumination. Sous l’éclairage UV large, les différences de luminosité d’émission des différents visages du cristal sont immédiatement visibles. L’éclairage confiné peut être utilisé comme une option, principalement pour étudier tous les effets de l’énergie ou le transfert de lumière dans le cristal, ce qui peut déclencher un comportement deguide d’onde. Dans ce cas, une forte émission est détectée dans un point qui n’est pas directement sous l’excitation. Cela donne à penser qu’une migration énergétique efficace se fait à travers le cristal13 (5 et 6 dans la figure 7).

Du cube hyperspectral acquis, il est également possible d’obtenir la distribution spectrale sous forme d’une image représentant une longueur d’onde spécifique, le profil d’intensité d’une longueur d’onde d’émission spécifique, ainsi que les spectres d’émission à n’importe quel pixel ou zone du cube hyperspectral acquis. À titre d’exemple, les spectres d’émission donnés dans la figure 7 (panneau 4) montrent les bandes d’émission les plus caractéristiques de l’Eu3 ion : la bande observée à 590 nm est attribuée au dipole magnétique (MD) 5D0et7F1 transition de l’Eu3 ,tandis que les pics d’émission dans la région de 610 à 630 nm proviennent de la dipole électrique forcée hypersensible (ED) 5D0'7F2 Eu3 'transition. Le rapport entre l’intensité intégrée de ces deux transitions est bien connu pour être une excellente sonde de l’environnement chimique autour de l’ion Ln3 dans la structure du cristal unique21: plus la symétrie autour de la Ln3 est grande, plus le rapport ED/MD est important. Cela permet de tirer des conclusions sur le caractère symétrique de l’environnement chimique de l’ion Ln3. En outre, la scission Stark de la transition 5D0et7F2 peut également être corrélée avec la symétrie autour du Ln3 dans son environnement cristallographique - plus la symétrie est faible, plus le nombre de sous-niveaux Stark est élevé. Dans le cas du polymorphe en forme d’aiguille cristallisé dans le système de cristal triclinique symétrique faible, la transition de 5D0à7F2 se divise en quatre sous-pics (spectres indiqués dans la figure 7, panneau 4). Une telle analyse est particulièrement attrayante en comparant les propriétés optiques de plusieurs polymorphes d’un cristal luminescent. Nous avons déjà démontré que l’information sur l’environnement chimique déduit de l’analyse optique s’est bien corrélée avec la structure de cristal moléculaire obtenue par l’analyse de rayonS X cristal13. De plus, le profil spectral le long des différentes faces cristallines indiquées dans la figure 7 (panneau 3), indiquant une émission plus brillante à l’extrémité et aux faces latérales, peut également être corrélé avec le Ln3 Ln3 degrés ions distances dans les trois directions spatiales(figure 1b): le plus dense Ln3 'emballage le long des axes perpendiculaires à la pointe et les faces latérales, respectivement, favorisent le transfert d’énergie ion-ion. Par conséquent, l’amélioration des émissions est observée aux faces respectives, donc, l’anisotropie optique.

Dans l’ensemble, les diverses options d’analyse des données, présentées à la figure 7 et à la figure 8,constituent les caractéristiques les plus importantes de l’information spectroscopique et spatiale combinée, qui est possible d’être explorée par l’analyse HSI des échantillons luminescents.

Figure 1
Figure 1 : Structure moléculaire et arrangement cristallgraphique. (a) Structure du complexe à base de l’heterodinuclear Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6], où Ln1 et Ln2 sont Tb3 et Eu3 ions. Les groupes désordonnés et les atomes d’hydrogène sont omis pour plus de clarté. Code couleur: Eu: cyan foncé; C: gris; O: rouge; N: bleu; F: vert lime. b) Représentation de l’emballage moléculaire dans le cristal : (i) vue supérieure et (ii) vue de pointe de la structure de cristal unique en forme d’aiguille avec certains Lnsulaires intermoléculaires et intramoléculaires Les distances de Ln (sous-unités de tfaa et atomes d’hydrogène sont omises pour plus de clarté). (iii) L’arrangement d’emballage de cristal du [TbEu(bmp)(tfaa)6] dimers (atomes d’hydrogène sont omis pour plus de clarté). (iv) Diagramme des visages de croissance de cristal du dimer révélant le plus court Ln Ln distances dans les (0 1 0) et (2 -1 1) directions cristallographiques. Le chiffre a été modifié à partir de la référence 13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu du système d’imagerie hyperspectrale. La configuration requise pour la cartographie de la luminescence dans la région spectrale visible à l’aide de l’excitation UV est illustrée. aa) Vue générale du système, où 1 est l’étape du microscope, 2 est la section contenant la configuration optique, et 3 est le spectromètre avec les détecteurs visibles et NIR. b) Vue ouverte de l’arrangement optique près du stade du microscope (côté droit de l’a) montrant la configuration optique de l’expérience : la position optique du cube 4 reste vide et le cube de microscope confocal est placé en position 5 afin d’acheminer la lumière à travers le chemin visible, le cube visible est placé en position 6 afin de diriger la lumière visible vers le chemin de détection, et le cube de trou d’épingle confocal est placé en position 7 afin d’orienter la lumière vers le chemin de détection visible. cc) Vue ouverte de l’arrangement optique plus proche des détecteurs (côté gauche d’a), montrant la position 8, où le cube de spectromètre confocal est placé pour refléter la lumière au spectromètre et à la caméra visible. L’encart 9 montre la vis pour ajuster la largeur d’ouverture de la fente du spectromètre. d) Vue du stade du microscope, de l’ordinateur et de la lampe à large bande (utilisée pour l’excitation UV) contrôleur. Dans l’encart, le contrôleur de lampe à large bande est montré avec plus de détails: 10 est le bouton on/off, 11 est le bouton pour contrôler l’intensité de la lampe, et 12 est le bouton d’obturation. ee) Schéma montrant le chemin optique visible/NIR de l’étape du microscope aux détecteurs, y compris les positions de cube optique de 4 à 8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Capture d’écran du logiciel PHySpec montrant le menu avec les paramètres à ajuster pour le HSI. 1 permet d’insérer la barre d’échelle dans l’image de la caméra couleur ; 2 et 3 permettent de contrôler le temps d’exposition et de gagner de la valeur de la caméra couleur, respectivement; l’objectif approprié doit être sélectionné en 4; 5 permet la sélection de l’ouverture du trou d’épingle; 6 (Diverter) et 7 (Filter) permettent de choisir le détecteur et la grille, respectivement; le temps d’exposition pour le détecteur visible est fixé en 8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Vue générale de l’étape du microscope. aa) Placement de la glissière en verre contenant l’échantillon à l’étape, avec l’éclairage UV ON montrant la luminescence rouge de l’échantillon (petit point rouge au centre de la glissière en verre). b) Vue de l’étape du microscope avec le condenseur d’éclairage de lumière blanche sur le dessus. cc) Contrôleur de scène montrant le joystick qui contrôle le mouvement de l’étape dans les directions indiquées par des flèches orange et jaune (également indiquées dans (a). d) Vue détaillée du bouton de mise au point, qui déplace l’étape dans les directions indiquées par la flèche rouge (également indiquée dans (b)). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Les composantes de l’étape du microscope. 1 étape de microscope avec l’échantillon sur la glissière en verre placée sur la scène de l’échantillon sur les lentilles objectives; 2 roues pour ajuster la mise au point (grande roue) et pour diriger l’émission capturée (petite roue) soit uniquement au détecteur (L), en partie au détecteur et partiellement à la caméra (R), ou uniquement aux lentilles binoculaires (oeil); 3 roues de filtres d’excitation/émission utilisées pour choisir la plage de longueur d’onde d’excitation. Le détail à droite montre le cube de filtre tenant le filtre UV et le filtre à long passage utilisé dans cette expérience; 4 dans le haut /bas sont montrer les boutons pour déplacer le faisceau d’excitation à travers l’échantillon, tandis que dans les deux, le contrôle circulaire d’ouverture de champ; 5 lentilles objectives; 6 bouton ON/OFF de l’éclairage de la lumière blanche; 7 bouton pour ajuster la luminosité de la lampe blanche. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Images de microscopie optique du cristal unique analysé. Ces images ont été obtenues sous (un) éclairage de lumière blanche,b) pleine vue d’éclairage UV, en utilisant l’ouverture circulaire d’excitation complètement ouverte, etc) localement confinée l’éclairage UV (marqué par le cercle blanc), en utilisant une ouverture circulaire plus proche excitation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Capture d’écran du logiciel PHySpec montrant le processus d’analyse de données hyperspectrale de cube. Diverses méthodes d’analyse spectrale peuvent être appliquées sur le cube hyperspectral acquis : 1 montre la longueur d’onde qui a été choisie pour la distribution d’image spectrale montrée dans 2; 3 montre les profils d’intensité horizontale de 613,26 nm (7) et verticaux (8); 4 montre les spectres d’émission extraits des cibles 5 et 6 ainsi que de la zone mise en évidence dans 9. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Application alternative de HSI sondant la synergie entre les nanoparticules upconverting et les complexes de lanthanide. Cet exemple montre l’analyse hyperspectrale d’un système hybride composé de cristaux moléculaires ([Tb2(bpm)(tfaa)6]) combinés à des nanoparticules upconverting (NaGdF4:Tm3,Yb3). aa) Photomicrographes sous l’éclairage de lumière blanche et UV avec la région d’intérêt (ROI) utilisée pour l’imagerie hyperspectrale sous 980 nm irradiation lumineuse. b) Tm3 et émissions indirectes tb3MD surveillées sur une superficie de 20 x 20 m2. c) Variation de l’intensité absolue des bandes d’émissions fluctuée dans tout le système hybride indiquant une certaine variabilité de la quantité totale de matériau distribué sur la surface. dd) La constance du rapport entre l’émission intégrée du complexe par rapport au complexede 3 euros: 1G4à3H6 (carrés) et Tm3 : 1G4et3F4 (cercles) a confirmé la présence simultanée des deux moieties tout au long du système hybride et l’interaction homogène entre eux. Les barres d’échelle sont de 20 m dans les photomicrographes et de 5 m dans les ROI et les cartes spectrales. Les photomicographes sont présentés en couleurs réelles. Le chiffre a été modifié à partir de la référence 11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Le protocole d’imagerie hyperspectral décrit ici fournit une approche simple qui permet d’obtenir des informations spectroscopiques à des endroits précis de l’échantillon. À l’aide de la configuration décrite, la résolution spatiale(x et y mapping) peut atteindre 0,5 m tandis que la résolution spectrale peut être de 0,2 nm pour la cartographie à la portée visible et de 0,6 nm pour la plage NIR.

Afin d’effectuer une cartographie hyperspectrale sur un seul cristal, la préparation de l’échantillon suit une procédure facile : le cristal peut simplement être placé sur une glissière de microscopie en verre, recouverte d’un verre de couverture au besoin. Concentrer l’échantillon à l’aide des lentilles objectives appropriées et l’image de champ lumineux à la caméra de couleur mis en place dans le logiciel est une étape très importante au cours de l’étape de pré-analyse pour obtenir les meilleures images hyperspectrales résolues. En règle générale, des intensités d’émission plus élevées sont obtenues lorsque l’échantillon est bien ciblé. Une fois cela fait, le choix des paramètres de l’analyse tels que les comptes x et y et la taille de l’étape dictera le champ de vision et l’échantillonnage spatial, respectivement du cube hyperspectral obtenu. Cependant, l’ouverture numérique de l’objectif et les longueurs d’onde d’excitation/émission dictent le volume réel de l’échantillon qui est sondé à chaque point d’acquisition. Par exemple, pour l’objectif utilisé dans cette étude, avec une ouverture numérique (NA) de 0,4 et en utilisant l’excitation dans la gamme spectrale UV (390 nm), le point laser focalisé a une taille d’environ 0,6 x 0,6 m dans la direction x et y. La taille du point laser a été calculée à l’aide du site Web (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, consulté le 26 septembre 2019). Si la taille de l’étape choisie est plus grande que l’échantillonnage spatial, on peut en fait échantillonner une zone plus petite que celle donnée par la taille de l’étape. Si l’échantillon est homogène, le sous-échantillon peut ne pas être un problème. Pourtant, si les variations spatiales de l’échantillon sont importantes à détecter, un échantillonnage optimal est obtenu avec une taille d’étape fixée à la moitié de la taille du faisceau laser de l’échantillon. Le temps d’exposition choisi et l’intensité de l’éclairage sélectionné par LES UV contrôleront l’intensité des spectres obtenus. Ces paramètres varient d’un échantillon à l’autre, selon l’intensité des émissions et la sensibilité à l’excitation UV.

À ce stade, les étapes critiques dans le protocole peuvent être énumérées comme: l’alignement du système optique, le placement correct des cubes optiques, la régulation de l’ouverture circulaire de l’excitation et des ouvertures de fente de détecteur, le choix du trou d’épingle, la mise au point de l’échantillon dans la caméra de couleur à l’aide des lentilles objectives appropriées, l’intensité de la lampe à large bande et le bon choix du long cube de filtre de passage (permettant l’excitation UV) , ainsi que le choix de la taille de l’étape appropriée et le temps d’exposition comme mentionné ci-dessus. Enfin, les lumières de la pièce doivent être éteintes pendant tout le temps de l’acquisition de cube hyperspectral.

En cas de mauvaise détection du signal, soit avec la caméra couleur ou le spectromètre, le dépannage de la technique devrait inclure la vérification minutieuse de chacune des étapes critiques indiquées ci-dessus, avant de commencer l’acquisition du cube hyperspectral. La configuration du signal de sortie au stade du microscope est également importante. Les trois configurations possibles sont : l’œil (100 % du signal de sortie est envoyé à la monture binoculaire au microscope), L (100 % du signal de sortie est envoyé aux détecteurs) et R (80 % du signal de sortie est envoyé aux détecteurs et 20 % à la monture binoculaire au microscope). Lors de l’acquisition du cube hyperspectral, la configuration R ou L doit être utilisée. Si tous les paramètres énumérés ci-dessus sont correctement choisis, des informations spatiales et spectrales à haute résolution de l’échantillon peuvent être obtenues.

Certaines modifications possibles de la technique décrite ici peuvent être illustrées par l’imagerie hyperspectrale d’autres systèmes, tels que les microparticules luminescentes14 ou les systèmes hybrides optiques composés de cristaux moléculaires combinés à des nanoparticules upconverting(figure 8)11. Dans ces exemples, la diode laser NIR (980 nm) a été utilisée comme source d’excitation, remplaçant l’excitation UV, tout en détectant l’émission visible générée. Dans ce dernier exemple du système hybride, HSI a révélé l’homogénéité des films hybrides qui combinent des nanoparticules upconverting (NaGdF4:Tm3 ,Yb3 )et [Tb2(bpm)(tfaa)6] cristaux dans un système isotropic multi-ondes réactive, présentant le transfert d’énergie entre les matériaux et les molécules (Figure 8)11. En outre, en utilisant le détecteur InGaAs du système, la détection des émissions dans la région spectrale NIR (1000 à 1700 nm) devient possible. Ceci est d’un intérêt particulier lorsque vous cherchez à l’enquête sur les sondes optiques basées sur NIR pour les applications biomédicales3. Dans ce cas, la configuration des cubes optiques du système(figure 2e) doit être définie pour le chemin NIR. En cas d’émission NIR excitation-NIR, l’une des limites de la technique hyperspectrale décrite ici devient évidente : comme étant dépendante de la longueur d’onde, la résolution spectrale dans la région NIR est inférieure à celle de la détection visible, soit environ 0,6 nm(contre 0,2 nm). De plus, pour les caractéristiques de moins de 1 m, par exemple, les cristaux moléculaires plus petits, les nanoparticules ou les systèmes hybrides, la résolution spatiale, qui est dictée par la configuration du système (objectifs utilisés et longueurs d’onde d’excitation/émission), devient une autre limitation potentielle.

Enfin, (indépendamment de la configuration HSI choisie et du régime de longueur d’onde), la manipulation des données peut être effectuée soit avec le logiciel de l’instrument, soit, comme le montre le cas des profils spectrals, peut être exportée pour être analysée dans d’autres logiciels tels que Origin® ou Microsoft Excel. Dans notre exemple, l’anisotropie optique du cristal a également été rapidement révélé à l’image de la caméra de couleur, à savoir par la forte variation d’intensité le long des différents visages de cristal. De plus, sous l’excitation UV large, différentes intensités d’émission sont obtenues en fonction de la face analysée(figure 7). La possibilité d’obtenir le profil d’intensité des émissions dans différents points d’intérêt du cristal (cibles de la figure 7) permet également d’étudier la variation de l’intensité des émissions et, si elle est présente, également en forme spectrale. Le polymorphe en bloc du [TbEu(bpm)(tfaa)6] constitue un exemple où deux faces cristallines présentaient des intensités d’émissions tout aussi élevées et une intensité d’émission plus faible pour le troisième13. Dépenser à ce sujet, en cas de système sans aucune anisotropie, l’intensité des émissions serait la même pour tous les visages de cristal.

Les méthodes complémentaires pour sonder l’anisotropie optique sont par exemple liées à la présence d’émissions polarisées provenant d’un échantillon. Il s’agit notamment de la mémoire de polarisation ou de l’élipsometry spectroscopique. La première consiste en la corrélation entre l’état de polarisation de la lumière émise par le matériau avec l’état de polarisation de la lumière d’excitation incidente,22,23 tandis que ce dernier mesure le changement dans l’état de polarisation de la lumière après avoir été réfléchi obliquement par un mince échantillon de film24. Cependant, un avantage d’utiliser l’imagerie hyperspectrale comme outil pour sonder l’anisotropie optique, comme indiqué ici, vient avec le fait que la présence de polarisation n’est pas une exigence pour l’analyse d’échantillon. De plus, la préparation de l’échantillon ne nécessite pas la fabrication de couches minces, ni une orientation très attentive du cristal par rapport à l’incident et la lumière recueillie. Ces aspects rendent la technique de HSI potentiellement plus largement applicable. En outre, les caractéristiques anisotropiques sont rapidement visualisées lors de l’acquisition d’images, et l’analyse des données est simple (comme illustré ci-dessus).

Considérant une portée plus large, l’importance de la technique HSI peut être attribuée à sa caractéristique unique de noyauer le signal optique avec des caractéristiques dépendantes de l’environnement. Par exemple, une telle connexion est essentielle pour améliorer la compréhension des interactions nanobiotiques3,15,16 dans le domaine croissant de la nanomédecine ou même pour comprendre la relation structure-propriété dans la science des matériaux10,11,12,13. En tant que tel, les futures applications potentielles de la technique décrite ci-contre peuvent être nommées comme, mais ne se limitant pas à: l’analyse des échantillons biologiques in vitro, ex vivo et in vivo effectuer la cartographie des molécules d’intérêt biologique4,6, l’adaptation de l’étape du microscope pour étudier l’environnement spécifiques propriétés opto-électroniques(par exemple les échantillons intégrés dans les circuits électriques), la température optique de détection8,15 (en ajoutant un contrôleur de température à l’étape du microscope) ou la détection de gaz (en adaptant une chambre à gaz au microscope stade). HSI a en outre été démontré comme approprié pour les techniques d’excitation de fluorescence au lieu de l’émission de fluorescence25. Un bon exemple de l’utilisation de cette adaptation technique hyperspectrale particulière est la détection des cellules cancéreuses dans les tissus biologiques6. Par conséquent, le protocole décrit ici a le potentiel d’être largement étendu à l’étude des caractéristiques spectroscopiques de nombreux types différents de structures luminescentes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs remercient M. Dylan Errulat et le professeur Muralee Murugesu du Département de chimie et de sciences biomoléculaires de l’Université d’Ottawa pour la fourniture de cristaux simples [TbEu(bpm) (tfaa)6]. E.M.R,N.R., et E.H. reconnaissent avec gratitude le soutien financier fourni par l’Université d’Ottawa, la Fondation canadienne pour l’innovation (FCI) et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CSNG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope glass slides FisherBrand 12-550-15 Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager PhotonETC Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

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References

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L’imagerie hyperspectrale comme outil pour étudier l’anisotropie optique dans les cristaux uniques moléculaires à base de Lanthanide
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Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).More

Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).

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