Summary
Qui presentiamo un protocollo per ottenere dati di imaging iperspettrale luminescente e per analizzare le caratteristiche di anisotropia ottica dei singoli cristalli a base di lanthanide utilizzando un sistema di imaging iperspettrale.
Abstract
In questo lavoro, descriviamo un protocollo per una nuova applicazione dell'imaging iperspettrale (HSI) nell'analisi dei cristalli singoli molecolari basati su lantanodi di lunescente (Ln3). Come esempio rappresentativo, abbiamo scelto un singolo cristallo del complesso eterodinucleare a base di Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm-2,2'-bipyrimidine, tfaa– 1,1,1-trifluoroacetylacetonate) che esibiono un'emissione visibile brillante sotto l'eccitazione UV. HSI è una tecnica emergente che combina l'imaging spaziale bidimensionale di una struttura luminescente con informazioni spettrali da ogni pixel dell'immagine ottenuta. In particolare, HSI su singoli cristalli del complesso [Tb-Eu] ha fornito informazioni spettrali locali svelando la variazione dell'intensità della luminescenza in diversi punti lungo i cristalli studiati. Questi cambiamenti sono stati attribuiti all'anisotropia ottica presente nel cristallo, che deriva dal diverso imballaggio molecolare degli ioni Ln3 in ciascuna delle direzioni della struttura cristallina. L'HSI qui descritto è un esempio dell'idoneità di tale tecnica per le indagini spettrospaziali di materiali molecolari. Tuttavia, cosa importante, questo protocollo può essere facilmente esteso per altri tipi di materiali luminescenti (come cristalli molecolari di dimensioni micron, microparticelle inorganiche, nanoparticelle nei tessuti biologici o cellule etichettate, tra gli altri), aprendo molte possibilità per un'indagine più approfondita delle relazioni struttura-proprietà. In definitiva, tali indagini forniranno conoscenze da sfruttare nell'ingegneria di materiali avanzati per un'ampia gamma di applicazioni, dalla bioimaging alle applicazioni tecnologiche, come guide d'onda o dispositivi optoelettronici.
Introduction
L'imaging iperspettrale (HSI) è una tecnica che genera una mappa spaziale in cui ogni coordinata x-y contiene informazioni spettrali che potrebbero essere basate su qualsiasi tipo di spettroscopia, vale a dire fotoluminescenza, assorbimento e spettroscopia a dispersione1,2,3. Di conseguenza, viene ottenuto un set di dati tridimensionali (chiamato anche "cubo iperspettrale"), in cui le coordinate x-y sono gli assi spaziali e la coordinata z è l'informazione spettrale del campione analizzato. Pertanto, il cubo iperspettrale contiene informazioni spaziali e spettrali, fornendo un'indagine spettroscopica più dettagliata del campione rispetto alla spettroscopia tradizionale. Mentre HSI è conosciuta da anni nel campo del telerilevamento (adesempio, geologia, industrie alimentari4), è recentemente emerso come una tecnica innovativa per la caratterizzazione dei nanomateriali2,5 o sonde per applicazioni biomediche3,6,7,8. In generale, non è limitato al dominio UV/visible/near-infrared (NIR), ma può anche essere esteso utilizzando altre sorgenti di radiazione, come i raggi X – per esempio al fine di caratterizzare la distribuzione elementare in diversi materiali9 – o radiazioni Terahertz, dove HSI è stato utilizzato per eseguire il rilevamento termico nei tessuti biologici8. Inoltre, la mappatura della fotoluminescenza è stata combinata con la mappatura Raman per sondare le proprietà ottiche del monostrato MoS210. Eppure, tra le applicazioni riportate di HSI ottico, ci sono ancora solo alcuni esempi su HSI di materiali a base di lanthanide11,12,13,14,15,16,17. Ad esempio, possiamo citare: rilevamento del cancro nei tessuti6, analisi della profondità di penetrazione della luce nei tessuti biologici7, imaging biologico moltiplicato3,analisi del trasferimento di energia multicomponente nei sistemi ibridi11e indagine dei cambiamenti indotti dall'aggregazione nelle proprietà spettroscopiche delle nanoparticelle di upconverting12. Chiaramente, l'attrattiva di HSI deriva dalla sua idoneità a generare conoscenze sulla luminescenza specifica dell'ambiente, fornendo informazioni spaziali e spettrali simultanee sulla sonda.
Approfittando di questa potente tecnica, qui viene descritto un protocollo per studiare l'anisotropia ottica dell'eterodinucleare Tb3,-Eu3, cristallo singolo [TbEu(bpm)(tfaa)6] (Figura 1a)13. L'anisotropia ottica osservata derivava dal diverso imballaggio molecolare degli ioni Ln3 nelle diverse direzioni cristallografiche (Figura 1b), con il risultato che alcune facce di cristallo mostravano una luminosità più luminosa, altre mostravano la fotoluminescenza dimmer. È stato suggerito che l'accresciuta intensità della luminescenza in facce specifiche del cristallo fosse correlata con un trasferimento di energia più efficiente lungo quelle direzioni cristallografiche in cui l'Ln3 Ledistanze di Ln 3 o più ioni erano le13più brevi.
Motivati da questi risultati, proponiamo l'istituzione di una metodologia dettagliata per analizzare l'anisotropia ottica attraverso HSI, aprendo il percorso per una migliore comprensione dei processi di trasferimento di energia agli ioni e delle proprietà luminescenti regolabili derivanti da una specifica disposizione molecolare18,19. Queste relazioni struttura-proprietà sono state riconosciute come aspetti importanti per la progettazione di materiali ottici innovativi, tra cui, ma non solo, i sistemi di guida d'onda e i dispositivi di archiviazione opto-magnetici su nano e microscala , affrontando la domanda di sistemi ottici più efficienti e miniaturizzati20.
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Protocol
AVVISO: Si consiglia di utilizzare occhiali di sicurezza specifici per la lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata in ogni momento durante il funzionamento dell'imager.
1. Configurazione del microscopio iperspettrale
NOTA: una panoramica del sistema di imaging iperspettrale è fornita nella Figura 2a, con i componenti principali dell'imager descritto. Il sistema di imaging può essere utilizzato per il rilevamento dell'emissione visibile o vicina infrarossa (NIR) da un campione. A seconda del rilevamento desiderato (visibile o NIR), la luce passa attraverso due percorsi luminosi diversi (Figura 2e). Una combinazione di diversi cubi di tornitura del fascio e cubi di filtro dicromatici (cubi ottici) deve essere posizionata in posizioni specifiche nello strumento per selezionare il rispettivo percorso.
- Accendere il computer collegato al sistema di imaging. Accendere il monitor del computer.
- Impostare la configurazione del cubo ottico appropriata (Figura 2b,c).
NOTA: In questo caso, viene descritta la configurazione dell'imager(configurazione del cubo ottico) per il mapping HSI mediante l'eccitazione UV e il rilevamento delle emissioni visibili. Tuttavia, è anche possibile cambiarlo per l'eccitazione NIR e il rilevamento visibile o delle emissioni NIR, a seconda del campione analizzato. Per un esempio, fare riferimento alla sezione Risultati rappresentativi.- A partire dalla fase del microscopio (1 nella figura 2a) e seguendo il percorso del fascio di emissione verso i rilevatori (3 nella figura 2a), lasciare la prima posizione per un cubo ottico (4 nella figura 2b) vacante e posizionare il cubo ottico al microscopio (DFM1-P01) nella posizione indicata come 5 nella Figura 2b, in modo che l'emissione dal campione sia diretta attraverso il percorso luminoso visibile.
- Guardando lungo il percorso ottico verso il rivelatore, posizionare il cubo ottico visibile (CM1-P01), che contiene lo specchio dicrotrico e i filtri per dirigere l'emissione visibile ai percorsi di rilevamento, nella posizione indicata come 6 nella figura 2b.
- Continuando il percorso verso il rivelatore, posizionare il cubo ottico pinhole confocale (DFM1-P01) nella posizione indicata come 7 nella figura 2b per dirigere la luce attraverso il percorso di rilevamento della luce visibile. Quindi, seguendo il percorso, posizionare il cubo ottico dello spettrometro confocale (DFM1-P01) nella posizione 8 nella figura 2c in modo che la luce emessa raggiunga il rilevatore.
- Per il mapping HSI, controllare manualmente l'apertura della crepa del rilevatore (9 nella figura 2c) in modo che corrisponda alle dimensioni dei fori utilizzati (circa 50 mm è ottimale).
- Nel software PHySpec, scegliere l'apertura del foro stenopeico (5 nella Figura 3).
NOTA: più piccola è l'apertura del foro stenopeico, migliore è la risoluzione HSI, al costo dell'intensità del segnale.
- Accendere la lampada a banda larga (Figura 2d, inset) posizionando l'interruttore (10 nella Figura 2d) nella posizione ON. Per controllare l'intensità della luce di eccitazione, ruotare la manopola indicata da 11 (Figura 2d) su valori più alti (32 – intensità più bassa) o valori più bassi (1 – intensità più alta). Mantenere l'otturatore della lampada a banda larga (12 nella Figura 2d) chiuso durante la configurazione.
NOTA: I valori più alti corrispondono a una maggiore attenuazione della densità di potenza emessa dalla lampada, mentre i valori più bassi corrispondono all'attenuazione più bassa. - Attivare il seguente hardware nell'ordine indicato di seguito impostando i relativi interruttori nella posizione ON:
- Accendere il controller di movimento ThorLabs.
- Accendere la fonte di alimentazione Nikon.
- Accendere il controller ASI.
- Accendere il controller Galvo.
- Accendere il rilevatore ProEm.
- Accendere il rilevatore Bayspec.
- Sul computer, aprire il software PHySpec facendo doppio clic sulla relativa icona.
- Premere il tasto F8 sulla tastiera per inizializzare il sistema IMA Upconversion e fare clic sul pulsante OK nella finestra Connetti al sistema.
NOTA: passaggio 1.5.1. può essere eseguita anche facendo clic sulla scheda Sistema e quindi su Connetti per arrivare alla finestra Connetti al sistema. Quindi, è possibile fare clic sul pulsante OK per collegare il sistema di imaging al software. - Assicurarsi che tutti i menu vengano visualizzati sull'interfaccia (Fotocamera acolori , ProEm e Bayspec) e sul pannello di controllo dello strumento, sul lato sinistro dello schermo, come illustrato nella Figura 3.
- Premere il tasto F8 sulla tastiera per inizializzare il sistema IMA Upconversion e fare clic sul pulsante OK nella finestra Connetti al sistema.
2. Imaging iperspettrale di un [TbEu(bpm)(tfaa)6] singolo cristallo
- Per preparare il campione, posizionare il cristallo su un vetrino di vetro di microscopia. Nel caso in cui sia necessario utilizzare un ingrandimento più elevato, coprire il cristallo con un vetro di copertura sottile e fissarlo con nastro adesivo, in modo che il campione possa essere posizionato con il vetro di copertura sottile rivolto verso l'obiettivo.
- Posizionare il vetrino su cui il campione è stato preparato sullo stadio del microscopio e fissarlo con i braccimetallici( Figura 4a,b).
- Spostare l'esempio utilizzando il joystick (Figura 4c) del controller ASI per posizionare l'esempio sugli obiettivi in uso.
- Posizionare manualmente il cubo del filtro diritto nella ruota sotto gli obiettivi (3 nella Figura 5) per selezionare l'eccitazione UV della lampada e per far passare l'emissione visibile verso il rilevatore.
NOTA: sono disponibili cubi di filtro aggiuntivi per l'uso dell'eccitazione della luce verde o blu, quindi avere il cubo del filtro giusto in posizione è importante per la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata. - Posizionare manualmente l'obiettivo 20X (indicato da 5 nella Figura 5) sotto il campione e premere il pulsante bianco (6 nella figura 5) sul lato sinistro del microscopio per accendere la luce bianca.
- Regolare la luminosità ruotando la manopola sotto il pulsante di accensione della luce bianca (7 nella Figura 5).
- Nel software PHySpec, premere il pulsante Riproduci (video) nella finestra della fotocamera a colori, che causerà l'acquisizione di una scansione dal vivo.
- Se la finestra della fotocamera a colori mostra un'immagine nera, aumentare il tempo di esposizione (2 nella Figura 3) e/o il valore di guadagno (3 nella Figura 3) che si trova nel pannello di controllo dello strumento, nella scheda Fotocamera a colori. Se l'immagine visualizzata è troppo luminosa, diminuire il tempo di esposizione e/o il valore di guadagno.
- Assicurarsi che la manopola in avanti sul lato destro del microscopio (2 nella Figura 5) sia impostata su R per inviare il 20% del segnale alla telecamera/binocolo e l'80% del segnale al rilevatore.
- Concentrarsi sul campione regolando la distanza tra l'obiettivo e lo stage (Figura 4b). Questo viene fatto ruotando le manopole mostrate in Figura 4d sul lato destro del microscopio.
NOTA: La manopola più grande viene utilizzata per regolazioni grossolane, mentre la manopola più piccola è per cambiamenti di messa a fuoco più delicati e piccoli. - Assicurarsi che l'obiettivo scelto manualmente sia selezionato anche nel software. In primo luogo, fare clic sul pulsante Visualizza nella barra dei menu superiore e quindi fare clic su una barra della scala Mostra/nascondi per visualizzare la barra della scala sull'immagine (1 nella Figura 3). Quindi, passare alla scheda Galvanometro nel pannello di controllo delle istruzioni e selezionare l'obiettivo utilizzato (4 nella Figura 3). Assicurarsi che la barra della scala visualizzata sia corretta selezionando l'obiettivo corretto nel software.
- Nel software, selezionare il rilevatore appropriato accedendo alla scheda Diverter (ProEM – 6 nella Figura 3) e alle grate accedendo alla scheda Filtro (1200 gr/mm in caso di ProEM – 7 nella Figura 3) nella scheda SpectraPro SP-2300 .
- Aprire l'otturatore della lampada a banda larga (12 nella Figura 2) per consentire l'eccitazione UV del campione. Ruotare la manopola di intensità (11 nella Figura 2d) nella posizione desiderata (ad esempio, 8 – intensità intermedia) per controllare l'intensità dell'eccitazione della lampada a banda larga (UV).
- Per scegliere tra l'illuminazione ad ampio campo (apertura aperta) o un'illuminazione spot più piccola (apertura più chiusa), controllare le dimensioni dell'apertura del campo della lampada UV utilizzando il bastone e le manopole mostrate in 4 nella Figura 5.
- Nella scheda SpectraPro SP-2300, selezionare una lunghezza d'onda per osservare l'emissione del campione.
- Se le lunghezze d'onda di emissione del campione sono sconosciute, acquisire uno spettro di emissione.
- Nel sequencer, fare clic sul segno s per aggiungere una nuova sequenza ("nodo") per l'acquisizione di uno spettro di emissione.
- Fare clic su Spettrometro e quindi su Acquisizione Spettro (con scansione spettrale).
- Immettere una lunghezza d'onda minima (ad esempio, 400 nm) e una lunghezza d'onda massima (ovvero 700 nm) e fare clic su OK per impostare l'intervallo spettrale in cui verrà registrato lo spettro.
- Scegliere il tempo di esposizione adeguato nel menu a sinistra del software. Scegliere tempi più brevi (ad esempio, 0,1 s) per campioni molto luminosi e tempi più lunghi (ad esempio, 2 s) per gli emettitori dim.
- Regolare la potenza di eccitazione in caso di eccitazione della lampada a banda larga (UV) (vedere il punto 1.3 sopra).
NOTA: In caso di eccitazione di diodo NIR, può essere regolato dal menu a discesa Densità neutra sul lato sinistro del software PHySpec.
- Sul sequencer, fare clic sul pulsante di riproduzione doppia per eseguire l'intera sequenza. Una volta mostrato lo spettro, notare le aree di interesse per il rilevamento delle emissioni di campioni(ad esempio da 580 a 640 nm nel caso di campioni basati su Tb3,e Eu3).
- Se necessario, ottimizzare il rilevamento del segnale modificando la messa a fuoco del campione o regolando il tempo di esposizione nel software PHySpec. Ottenere un'ulteriore ottimizzazione del rilevamento del segnale attraverso l'aumento dell'intensità di emissione del campione modificando la potenza della sorgente di eccitazione (lampada a banda larga), come descritto in precedenza.
- Nel sequencer, fare clic sul segno s per aggiungere una nuova sequenza ("nodo") per l'acquisizione di uno spettro di emissione.
- Regolare il tempo di esposizione (ad esempio, 0,5 s – 2 nella Figura 3) e guadagno (3 nella Figura 3) della fotocamera a colori di conseguenza, per ottenere un'immagine di buona qualità. Se necessario, aggiungere la barra della scala all'immagine facendo clic sul pulsante Mostra/nascondi barra della scala nella seconda riga del menu nella parte superiore della finestra del software PHySpec.
- Raccomandazione: Prima di acquisire il cubo iperspettrale, registrare un'immagine di microscopia ottica campo luminoso del cristallo sotto luce bianca (Figura 6a) e/o UV pieno(Figura 6b) o limitato (Figura 6c) illuminazione (illuminazione UV controllata dall'apertura dell'otturatore, mostrato come 4 nella Figura 5). Per farlo, con il campione a fuoco, fare clic sul pulsante di riproduzione della fotocamera a colori.
- Fare clic su File e quindi Esporta visualizzazione finestra, scegliere il formato desiderato per esportare l'immagine ottenuta e salvare il file con l'estensione desiderata (.h5, . JPEG).
- Prima di acquisire l'immagine iperspettrale, spegnere l'illuminazione della luce bianca e la luce della stanza.
- Per ottenere il cubo iperspettrale, scrivere una nuova sequenza. Pertanto, nel sequencer, fare clic sul segno più per aggiungere un nuovo nodo.
- Fare clic su Confocal Imager.
- Fare clic su Acquisizione multi-spettro. Qui, il campo visivo desiderato è definito dal numero di punti da acquisire nelle direzioni x e y e dalla dimensione del passo. Ad esempio, utilizzare 100 punti in x e 100 punti in y con una dimensione di passo di 5 m per ottenere un'immagine di 500 x 500 m.
Nota: il numero totale di punti di acquisizione e il tempo di integrazione in ogni punto influiranno direttamente sul tempo di acquisizione totale del cubo iperspettrale.- Immettere i conteggi della posizione X desiderata (ad es. 100) e della posizione Y (ad esempio, 100), nonché la dimensione del passo desiderata (ad es., 5 m). Selezionare l'opzione Hardware per la sincronizzazione della fotocamera, per la mappatura delle emissioni visibili (e l'opzione Software in caso di rilevamento NIR). Fare clic su OK.
- Fare clic su Acquisizione multi-spettro. Qui, il campo visivo desiderato è definito dal numero di punti da acquisire nelle direzioni x e y e dalla dimensione del passo. Ad esempio, utilizzare 100 punti in x e 100 punti in y con una dimensione di passo di 5 m per ottenere un'immagine di 500 x 500 m.
- Fare clic su Confocal Imager.
- Nel sequencer, fare clic sulla riga di acquisizione multi-spectrum appena aggiunta per evidenziare il nodo.
- Fare clic sul pulsante Riproduci per eseguire il nodo selezionato.
NOTA: il tempo rimanente che verrà risultato dall'acquisizione verrà visualizzato accanto al nodo (in minuti, ad esempio, 28 minuti). - Una volta completata l'acquisizione, salvare il cubo iperspettrale nel formato di file appropriato (.h5).
3. Analisi dei dati iperspettrali
- Subito dopo l'acquisizione, se il cubo iperspettrale salvato non si apre automaticamente nel software, recuperare il cubo iperspettrale, che è stato salvato come file .h5, facendo clic su File nella barra dei menu superiore e quindi passando il cursore al passaggio del mouse e facendo clic su Apri file.... Quando la finestra intitolata Seleziona dati si apre a proviene, scegliere la cartella in cui viene salvato il file .h5 e fare doppio clic sul file per aprirlo.
- Dopo aver importato il file del cubo iperspettrale, modificare l'immagine del cubo iperspettrale visualizzata per mostrare l'intensità di una lunghezza d'onda spettrale specifica spostando la barra nella parte superiore dell'immagine del cubo verso sinistra (lunghezza d'onda inferiore, ad esempio, 580 nm) o destra (lunghezza d'onda superiore, ad esempio, 638 nm).
NOTA: la lunghezza d'onda selezionata viene visualizzata nella parte sinistra di questa barra superiore (1 nella figura 7). - Dopo aver scelto la lunghezza d'onda di interesse per l'analisi(ad esempio,l'intensità massima, che nel caso di [TbEu(bpm)(tfaa)6] è 613,26 nm), fare uno (o tutti) dei tre possibili tipi di analisi spettrale: (A) la distribuzione spettrale sotto forma di un'immagine (2 nella Figura 7); (B) un profilo di intensità delle emissioni in una regione di interesse (3 nella figura 7); (C) estrazione di uno spettro in un punto o regione di interesse specifico (4 nella figura 7).
- In caso di distribuzione spettrale da un'immagine, utilizzare la funzione Ritaglia e bin per aumentare il rapporto segnale-rumore nell'immagine. A tale scopo, fare clic nel menu in alto Elaborazione quindi scegliere dati e quindi l'opzione Ritaglia e Bin.
- Per un profilo di intensità di emissione, nell'immagine del cubo fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il profilo Crea destinazione o Crea X o Crea Y a seconda che sia necessario analizzare un solo punto (Destinazione - 5 e 6 nella Figura 7) o una riga (Profilo - 7 e 8 nella Figura 7). Selezionare l'area di analisi trascinando il profilo della linea di destinazione, orizzontale o verticale con il cursore e spostarlo nel cubo.
- Una volta selezionato correttamente il profilo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla regione e selezionare Aggiungi destinazione al grafico. Scegliere l'opzione per creare un nuovo grafico per visualizzare l'intensità di emissione ( assey) in funzione della posizione fisica dell'obiettivo (assex). Lo spettro apparirà sul nuovo grafico che è stato inserito (6 e 7 in Figura 7).
NOTA: È possibile creare più destinazioni, che verranno visualizzate come profili di emissione colorati diversi (5 e 6 nella figura 7).
- Una volta selezionato correttamente il profilo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla regione e selezionare Aggiungi destinazione al grafico. Scegliere l'opzione per creare un nuovo grafico per visualizzare l'intensità di emissione ( assey) in funzione della posizione fisica dell'obiettivo (assex). Lo spettro apparirà sul nuovo grafico che è stato inserito (6 e 7 in Figura 7).
- In alternativa, ottenere uno spettro di emissione di un'area specifica del campione (9 nella figura 7). Per iniziare, posizionare il cursore sull'immagine del cubo e fare clic con il pulsante destro del mouse. Fare clic sulle opzioni Selezione rettangolo o Selezione ellisse nella scheda visualizzata.
- Disegnare la forma di selezione (ad esempio, un rettangolo) sull'area desiderata facendo clic e trascinando il cursore sul cubo. Una volta che l'area è stata selezionata correttamente, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla regione e selezionare Aggiungi selezione al grafico.
- Nella finestra visualizzata Aggiungi al grafico, selezionare Crea un nuovo grafico per visualizzare gli spettri di emissione della destinazione e fare clic su OK.
NOTA: una nuova linea colorata (8 nella figura 7) apparirà sul grafico in cui viene mostrata l'emissione di destinazione, con l'intensità di emissione come l'asse y e la lunghezza d'onda sull'asse x. Questo spettro corrisponde all'intensità media dell'area selezionata per ogni lunghezza d'onda.
- Una volta ottenuto lo spettro, salvarlo prima di selezionare una nuova regione perché è possibile selezionare una sola regione alla volta. A tale scopo, selezionare la finestra in cui contiene il grafico. Nel menu File, selezionare Salva con nome e scegliere di salvare il grafico nella cartella desiderata, utilizzando il nome di scelta, in formato .h5, che può essere aperto nel software PHySpec, o in formato .csv, che può essere importato in Excel.
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Representative Results
Per illustrare la configurazione del microscopio iperspettrale per l'acquisizione dei dati su un singolo cristallo molecolare basato su Ln (ad esempio, [TbEu(bpm)(tfaa)6], Figura 1a), Figura 2 mostra una panoramica del sistema e il corretto posizionamento dei cubi ottici nella configurazione. Figura 3 Mostra una schermata del software PHySpec contenente i menu utilizzati durante l'acquisizione HSI. Figura 4 e Figura 5 mostrano la fase del microscopio in modo più dettagliato, incluso il posizionamento della diapositiva di vetro contenente il campione da analizzare. L'illuminazione UV selezionata è stata attivata per mostrare la luminescenza rossa visibile del cristallo (Figura 4a e 1 nella Figura 5). La figura 6a mostra un'immagine di campo luminosa del cristallo registrata dopo aver regolato il campione nella messa a fuoco corretta. La morfologia aghiforma-come del cristallo può essere chiaramente visto. Figura 6b,c mostra l'immagine dello stesso cristallo sotto eccitazione UV con vista completa (Figura 6b) o localmente confinata (Figura 6c) illuminazione. Sotto l'ampia illuminazione UV, le differenze di luminosità delle emissioni dalle diverse facce del cristallo sono immediatamente visibili. L'illuminazione limitata può essere utilizzata come opzione, principalmente per studiare eventuali effetti di consumo di energia o di luce nel cristallo, che possono innescare un comportamento simile a una guida d'onda. In questo caso, una forte emissione viene rilevata in un punto non direttamente sotto eccitazione. Ciò suggerisce che la migrazione efficiente dell'energia avviene attraverso il cristallo13 (5 e 6 in Figura 7).
Dal cubo iperspettrale acquisito, è inoltre possibile ottenere la distribuzione spettrale sotto forma di un'immagine che rappresenta una lunghezza d'onda specifica, il profilo di intensità di una specifica lunghezza d'onda di emissione, nonché gli spettri di emissione in qualsiasi pixel o area del cubo iperspettrale acquisito. Ad esempio, gli spettri di emissione forniti nella Figura 7 (pannello 4) mostrano le bande di emissione più caratteristiche dello ione Eu3: la banda osservata a 590 nm è assegnata al dipole magnetico (MD)3+ 5D0,7F1 transizione di Eu2 3,mentre i picchi di emissione nella regione da 610 a 630 nm derivano dal dipolo elettrico ipersensibile (ED) 5D.7 Il rapporto tra l'intensità integrata di queste due transizioni è ben noto per essere un'eccellente sonda dell'ambiente chimico intorno allo ione Ln3 nella struttura del singolo cristallo21: minore è la simmetria intorno allo ione Ln3, maggiore è il rapporto ED/MD. Questo permette di trarre conclusioni sul carattere di simmetria dell'ambiente chimico dello ione Ln3. Inoltre, la scissione Stark della transizione 5D0x7F2 può anche essere correlata con la simmetria intorno all'Ln3 nel suo ambiente cristallino - minore è la simmetria, maggiore è il numero di sottolivelli Stark. Nel caso del polimorfismo aghiforme cristallizzato nel sistema triclinico triclinico a bassa simmetrica, la transizione 5D0-7F2 si divide in quattro sotto-picchi (spectra mostrato in Figura 7, pannello 4). Tale analisi è particolarmente interessante quando si confrontano le proprietà ottiche di diversi polimorfi di un cristallo luminescente. In precedenza abbiamo dimostrato che le informazioni sull'ambiente chimico dedotto dall'analisi ottica erano ben correlate con la struttura cristallina molecolare ottenuta dall'analisi a raggi X a singolo cristallo13. Inoltre, il profilo spettrale lungo le diverse facce di cristallo mostrate nella Figura 7 (pannello 3), che indica un'emissione più luminosa sulla punta e sulle facce laterali, può anche essere correlato con l'Ln3 Distanze di ioni Ln3 nelle tre direzioni spaziali(Figura 1b): l'imballaggio Ln3 più denso lungo gli assi perpendicolarmente alle facce della punta e laterali, rispettivamente, favoriscono il trasferimento di energia agli ioni. Di conseguenza, il miglioramento delle emissioni si osserva nelle rispettive facce, quindi anisotropia ottica.
Nel complesso, le varie opzioni di analisi dei dati, mostrate nella Figura 7 e Figura 8, costituiscono le caratteristiche più importanti delle informazioni spettroscopiche e spaziali combinate, che possono essere esplorate dall'analisi HSI dei campioni luminescenti.
Figura 1: Struttura molecolare e disposizione cristallografica. (a) Struttura del complesso eterodinucleare basato su Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6], dove Ln1 e Ln2 sono Tb3 e Eu3 ioni. Gruppi disordinati e atomi di idrogeno sono omessi per chiarezza. Codice colore: Eu: ciano scuro; C: grigio; O: rosso; N: blu; F: verde lime. (b) Rappresentazione dell'imballaggio molecolare nel cristallo: (i) vista superiore e (ii) vista punta della struttura a ghigno singolo aghi con l'intermolecolare e l'intramolecolare selezionato Le distanze di Ln (le sottounità tfaa e gli atomi di idrogeno vengono omessi per chiarezza). (iii) Disposizione dell'imballaggio in cristallo dei dimeri [TbEu(bmp)(tfaa)6] (gli atomi di idrogeno sono omessi per chiarezza). (iv) Diagramma delle facce di crescita dei cristalli del dimero che rivelano il più breve Ln Ln distanze nelle direzioni cristallografiche (0 1 0) e (2 -1 1). La figura è stata modificata rispetto al riferimento 13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica del sistema di imaging iperspettrale. Mostrata è la configurazione necessaria per la mappatura della luminescenza nella regione spettrale visibile utilizzando l'eccitazione UV. (a) Vista generale del sistema, dove 1 è lo stadio del microscopio, 2 è la sezione contenente la configurazione ottica e 3 è lo spettrometro con i rivelatori visible e NIR. (b) Vista aperta dell'ottico situato vicino allo stadio del microscopio (lato destro di a) che mostra la configurazione ottica dell'esperimento: la posizione del cubo ottico 4 rimane vuota e il cubo al microscopio confocale viene posizionato nella posizione 5 per instradare la luce attraverso il percorso visibile, il cubo visibile viene posizionato nella posizione 6 per dirigere la luce visibile al percorso di rilevamento e il cubo confortante è posizionato nella posizione 7 al fine di instradare la luce verso il percorso di rilevamento visibile. 7 (c) Vista aperta del set-up ottico più vicino ai rilevatori (lato sinistro di a), che mostra la posizione 8, dove il cubo dello spettrometro confocale è posizionato per riflettere la luce allo spettrometro e alla telecamera visibile. L'insetto 9 mostra la vite per regolare la larghezza di apertura della sbarra dello spettrometro. (d) Vista dello stadio al microscopio, computer e lampada a banda larga (utilizzata per l'eccitazione UV). Nell'insetto, il controller della lampada a banda larga è mostrato con più dettagli: 10 è il pulsante di accensione/spegnimento, 11 è la manopola per controllare l'intensità della lampada e 12 è il pulsante dell'otturatore. (e) Schema che mostra il percorso ottico visibile/NIR dallo stadio al microscopio ai rivelatori, comprese le posizioni ottiche del cubo da 4 a 8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Screenshot del software PHySpec che mostra il menu con i parametri da regolare per l'HSI. 1 consente di inserire la barra della scala nell'immagine della fotocamera a colori; 2 e 3 permettono di controllare rispettivamente il tempo di esposizione e il valore di guadagno della fotocamera a colori; la lente obiettivo corretta deve essere selezionata in 4; 5 permette la selezione dell'apertura del foro stenopeico; 6 (Diverter) e 7 (Filtro) permettono di scegliere rispettivamente il rilevatore e la griglia; il tempo di esposizione per il rivelatore visibile è impostato in 8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Vista generale dello stadio del microscopio. (a) Posizionamento del vetrino contenente il campione sullo stage, con l'illuminazione UV ON che mostra la luminescenza rossa del campione (piccolo punto rosso al centro del vetrino). (b) Vista dello stadio del microscopio con il condensatore di illuminazione a luce bianca sulla parte superiore. (c) Controllore dello stadio che mostra il joystick che controlla il movimento dello stage nelle direzioni indicate dalle frecce arancioni e gialle (mostrate anche in (a). (d) Visualizzazione dettagliata del pulsante di messa a fuoco, che sposta lo stage nelle direzioni indicate dalla freccia rossa (mostrata anche in (b)). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I componenti dello stadio del microscopio. 1 stadio al microscopio con il campione sul vetrino posto sullo stadio campione sopra le lenti obiettivo; 2 ruote per regolare la messa a fuoco (ruota grande) e per dirigere l'emissione catturata (piccola ruota) solo al rivelatore (L), parzialmente al rivelatore e parzialmente alla fotocamera (R), o solo alle lenti binoculari (occhio); 3 filtri di eccitazione/emissione ruota utilizzato per scegliere la gamma di lunghezza d'onda eccitazione. Il dettaglio a destra mostra il cubo del filtro che tiene il filtro UV e il filtro passalungo utilizzati in questo esperimento; 4 nella parte superiore/inferiore sono mostrano le manopole per spostare il fascio di eccitazione attraverso il campione, mentre in mezzo, il controllo di apertura del campo circolare; 5 obiettivi; 6 Tasto ON/OFF dell'illuminazione della luce bianca; 7 manopola per regolare la luminosità della lampada a luce bianca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini a microscopia ottica del singolo cristallo analizzato. Queste immagini sono state ottenute sotto (un) illuminazione a luce bianca, (b) illuminazione UV a vista completa, utilizzando l'apertura circolare di eccitazione completamente aperta, e (c) l'illuminazione UV confinata localmente (contrassegnata dal cerchio bianco), utilizzando un'apertura circolare di eccitazione più stretta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Screenshot del software PHySpec che mostra il processo di analisi dei dati dei cubi iperspettrali. Diversi metodi di analisi spettrale possono essere applicati sul cubo iperspettrale acquisito: 1 mostra la lunghezza d'onda che è stata scelta per la distribuzione dell'immagine spettrale mostrata in 2; 3 mostra i profili di intensità orizzontale (7) e verticale (8) di 613,26 nm; 4 mostra gli spettri di emissione estratti dagli obiettivi 5 e 6, nonché dall'area evidenziata in 9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Applicazione alternativa di HSI che sonda la sinergia tra nanoparticelle di upconverting e complessi lanthanide. In questo esempio viene illustrata l'analisi iperspettrale di un sistema ibrido costituito da cristalli molecolari ([Tb2(bpm)(tfaa)6]) combinati con nanoparticelle di upconverting (NaGdF4:Tm3, Yb3). (a) Fotomicrografie sotto illuminazione bianca e luminosa UV insieme alla regione di interesse (ROI) utilizzata per l'imaging iperspettrale sotto l'irradiazione luminosa di 980 nm. (b) Le emissioni di Tm3 e indiretti Tb3 sono monitorate su un'area di 20 x 20 m2. (c) Variazione dell'intensità assoluta delle bande di emissione fluttuate in tutto il sistema ibrido indicando una certa variabilità nella quantità totale di materiale distribuito sulla superficie. (d) La costanza del rapporto tra l'emissione integrata del complesso rispetto a Tm3: 1G4,3H6 (quadrati) e Tm3 : 1G4,3F4 (cerchi) ha confermato la presenza simultanea delle due moieties in tutto il sistema ibrido e l'interazione omogenea tra di loro. Le barre di scala sono di 20 m nelle fotomicrografie e di 5 m nei ROI e nelle mappe spettrali. Fotomicrografie sono presentati in colori reali. La figura è stata modificata dal riferimento 11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo di imaging iperspettrale qui descritto fornisce un approccio semplice che consente di ottenere informazioni spettroscopiche in posizioni precise del campione. Utilizzando l'impostazione descritta, la risoluzione spaziale (mappingx e y) può raggiungere 0,5 m mentre la risoluzione spettrale può essere di 0,2 nm per il mapping nell'intervallo visibile e di 0,6 nm per l'intervallo NIR.
Al fine di condurre la mappatura iperspettrale su un singolo cristallo, la preparazione del campione segue una procedura semplice: il cristallo può essere semplicemente posizionato su un vetrino di microscopia di vetro, coperto da un vetro di copertura in base alle esigenze. Concentrare il campione utilizzando le lenti obiettivo appropriate e l'immagine del campo luminoso nella configurazione della fotocamera a colori nel software è un passo molto importante durante la fase di pre-analisi per ottenere le migliori immagini iperspettrali risolte. In genere, si ottengono intensità di emissione più elevate quando il campione è ben focalizzato. Una volta fatto questo, la scelta dei parametri dell'analisi come i conteggi x e y e la dimensione del passo determinerà il campo di vista e il campionamento spaziale, rispettivamente del cubo iperspettrale ottenuto. Tuttavia, l'apertura numerica dell'obiettivo e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione determinano il volume reale del campione che viene sondato in ogni punto di acquisizione. Ad esempio, per l'obiettivo utilizzato in questo studio, con apertura numerica (NA) di 0,4, e utilizzando l'eccitazione nella gamma spettrale UV (390 nm), il punto laser focalizzato ha una dimensione di circa 0,6 x 0,6 m nella direzione x e y. La dimensione del punto laser è stata calcolata utilizzando il sito web (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, accessibile il 26 settembre 2019). Se la dimensione del passo scelta è maggiore del campionamento spaziale, si può effettivamente campionare un'area più piccola di quella data dalla dimensione del passo. Se il campione è omogeneo, il sottocampionamento potrebbe non essere un problema. Tuttavia, se le variazioni spaziali nel campione sono importanti da rilevare, si ottiene un campionamento ottimale con una dimensione di passo impostata a metà delle dimensioni del raggio laser sul campione. Il tempo di esposizione scelto e l'intensità dell'illuminazione UV selezionata controlleranno l'intensità degli spettri ottenuti. Tali parametri variano da un campione all'altro, a seconda dell'intensità di emissione e della sensibilità verso l'eccitazione UV.
A questo punto, i passaggi critici all'interno del protocollo possono essere elencati come: l'allineamento del sistema ottico, il corretto posizionamento dei cubi ottici, la regolazione dell'apertura circolare dell'eccitazione e delle aperture della sacca del rivelatore, la scelta del foro stenopeico, la messa a fuoco del campione nella fotocamera a colori utilizzando le lenti obiettivo appropriate, l'intensità della lampada a banda larga e la corretta scelta del cubo del filtro passa lungo (consentire l'eccitazione UV) , nonché la scelta della dimensione del passo e del tempo di esposizione appropriati come accennato in precedenza. Infine, le luci della stanza devono essere spente durante tutto il tempo dell'acquisizione del cubo iperspettrale.
In caso di scarsa rilevazione del segnale sia con la fotocamera a colori che con lo spettrometro, la risoluzione dei problemi della tecnica dovrebbe includere il controllo attentamente di ciascuno dei passaggi critici indicati sopra, prima di avviare l'acquisizione del cubo iperspettrale. Anche la configurazione del segnale di uscita allo stadio del microscopio è importante. Le tre possibili configurazioni sono: occhio (100 % del segnale di uscita viene inviato al supporto binocolo del microscopio), L (100 % del segnale di uscita viene inviato ai rilevatori) e R (80 % del segnale di uscita viene inviato ai rilevatori e 20 % al supporto binoculare del microscopio). Durante l'acquisizione del cubo iperspettrale, è necessario utilizzare la configurazione R o L. Se tutti i parametri sopra elencati sono scelti correttamente, è possibile ottenere informazioni spaziali e spettrali ad alta risoluzione del campione.
Alcune possibili modifiche della tecnica qui descritta possono essere esemplificate dall'imaging iperspettrale di altri sistemi, come le microparticelle luminescenti14 o i sistemi ibridi ottici costituiti da cristalli molecolari combinati con nanoparticelle di upconverting (Figura 8)11. In questi esempi, il diodo laser NIR (980 nm) è stato utilizzato come fonte di eccitazione, sostituendo l'eccitazione UV, rilevando l'emissione visibile generata. Nell'ultimo esempio del sistema ibrido, HSI ha rivelato l'omogeneità delle pellicole ibride che combinano nanoparticelle di upconverting (NaGdF4:Tm3,Yb3)e [Tb2(bpm)(tfaa)6] cristalli in un sistema isotropico multi-wavelength-responsive, che mostra il trasferimento di energia tra materiali e molecole (Figura 8)11. Inoltre, utilizzando il rivelatore InGaAs del sistema, diventa possibile il rilevamento delle emissioni nella regione spettrale NIR (da 1000 a 1700 nm). Questo è di particolare interesse quando si cerca l'indagine di sonde ottiche basate su NIR per applicazioni biomediche3. In questo caso, è necessario impostare la configurazione dei cubi ottici del sistema (Figura 2e) per il percorso NIR. Nel caso di emissione NIR eccitazione-NIR, una delle limitazioni della tecnica iperspettrale qui descritta diventa evidente: essendo dipendente dalla lunghezza d'onda, la risoluzione spettrale nell'area NIR è inferiore a quella per il rilevamento visibile, vale a dire circa 0,6 nm (vs. 0.2 nm). Inoltre, per le caratteristiche di sotto-1 m, ad esempio cristalli molecolari più piccoli, nanoparticelle o sistemi ibridi, la risoluzione spaziale, dettata dalla configurazione del sistema (obiettivi utilizzati e lunghezze d'onda di eccitazione/emissione), diventa un'altra limitazione potenziale.
Infine, (indipendentemente dalla configurazione HSI scelta e dal regime di lunghezza d'onda) la manipolazione dei dati può essere effettuata sia con il software dello strumento che, come mostrato per il caso dei profili spettrali, può essere esportata per essere analizzata in altri pacchetti software come Origin® o Microsoft Excel. Nel nostro esempio, l'anisotropia ottica del cristallo è stata prontamente rivelata anche all'immagine della fotocamera a colori, vale a dire dalla forte variazione di intensità lungo le diverse facce di cristallo. Inoltre, sotto l'ampia eccitazione UV, si ottengono diverse intensità di emissione a seconda del volto analizzato (Figura 7). La possibilità di ottenere il profilo di intensità delle emissioni in diversi punti di interesse al cristallo (obiettivi nella figura 7) permette inoltre di studiare le variazioni nell'intensità delle emissioni e, se presente, anche nella forma spettrale. Il polimorfo a blocchi del [TbEu(bpm)(tfaa)6] costituisce un esempio in cui due facce di cristallo presentano intensità di emissione altrettanto elevate e un'intensità di emissione inferiore per il terzo13. Spendendo su questo, in caso di un sistema senza anisotropia, l'intensità di emissione sarebbe la stessa per tutte le facce di cristallo.
I metodi complementari per sondare l'anisotropia ottica sono ad esempio correlati alla presenza di emissioni polarizzate da un campione. Questi includono la memoria di polarizzazione o l'ellissomeria spettroscopica. Il primo consiste nella correlazione tra lo stato di polarizzazione della luce emessa dal materiale con lo stato di polarizzazione della luce di eccitazione incidente,22,23 mentre il secondo misura il cambiamento nello stato di polarizzazione della luce dopo essere stato riflesso obliquamente da un sottile campionepellicola 24. Tuttavia, un vantaggio dell'utilizzo dell'imaging iperspettrale come strumento per sondare l'anisotropia ottica, come illustrato di seguito, deriva dal fatto che la presenza di polarizzazione non è un requisito per l'analisi dei campioni. Inoltre, la preparazione del campione non richiede la fabbricazione di pellicole sottili, né un orientamento molto attento del cristallo rispetto all'incidente e alla luce raccolta. Questi aspetti rendono la tecnica dell'HSI potenzialmente più ampiamente applicabile. Inoltre, le caratteristiche anisotropiche vengono prontamente visualizzate al momento dell'acquisizione dell'immagine e l'analisi dei dati è semplice (come indicato sopra).
Considerando una portata più ampia, il significato della tecnica HSI può essere attribuito alla sua caratteristica unica per comettere il segnale ottico con le caratteristiche dipendenti dall'ambiente. Ad esempio, tale connessione è essenziale per migliorare la comprensione delle interazioni nano-bio3,15,16 nel campo in crescita della nanomedicina o anche per comprendere la relazione struttura-proprietà nella scienza dei materiali10,11,12,13. Come tale, le future applicazioni potenziali della tecnica qui descritta possono essere denominate come, ma non limitarsi a: analisi di campioni biologici in vitro, ex vivo e in vivo che eseguono la mappatura di molecole di interesse biologico4,6, adattamento dello stadio del microscopio per studiare le proprietà opto-elettroniche specifiche dell'ambiente(ad esempio campioni incorporati nei circuiti elettrici), rilevamento ottico della temperatura8,15 (aggiungendo un controller di temperatura allo stadio del microscopio) o di rilevamento del gas (adattando una camera a gas al microscopio). HSI è stato inoltre dimostrato come adatto per tecniche di eccitazione a fluorescenza invece di emissione di fluorescenza25. Un buon esempio dell'uso di questo particolare adattamento della tecnica iperspettrale è il rilevamento delle cellule tumorali nei tessuti biologici6. Di conseguenza, il protocollo qui descritto ha il potenziale per essere in gran parte esteso allo studio delle caratteristiche spettroscopiche di molti tipi diversi di strutture luminescenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare. Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Dylan Errulat e il professor Muralee Murugesu del Dipartimento di Chimica e Scienze Biomolecolari dell'Università di Ottawa per la fornitura di cristalli singoli [TbEu(bpm)(tfaa)6.] single crystals. E.M.R., N.R., e E.H. riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario fornito dall'Università di Ottawa, dalla Canadian Foundation for Innovation (CFI) e dal Natural Sciences and Engineering Research Council Canada (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope glass slides | FisherBrand | 12-550-15 | Glass slides used for sample preparation |
| Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager | PhotonETC | Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number |
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