Summary
여기서, 우리는 발광 하이퍼 스펙트럼 이미징 데이터를 얻고 하이퍼 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 란탄 기반 단결정의 광학 이방성 기능을 분석하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
이 작품에서, 우리는 발광 란탄화물 (Ln3 +)계분자 단결정의 분석에서 초스펙트럼 이미징 (HSI)의 새로운 응용을위한 프로토콜을 설명합니다. 대표적인 예로, 우리는 UV 흥분하에서 밝은 가시 방출을 나타내는 이종 핵 Ln 기반 복합체 [TbEu(bpm)(tfaa)6](bpm=2,2'-비피리미딘, tfaa- =1,1,1-trifluoracetytytonate)의 단일 결정을 선택했습니다. HSI는 발광 구조의 2차원 공간 이미징과 획득된 이미지의 각 픽셀의 스펙트럼 정보를 결합하는 새로운 기술입니다. 구체적으로, [Tb-Eu] 복합체의 단결정에 대한 HSI는 연구된 결정의 여러 지점에서 발광 강도의 변동을 밝히는 국소 스펙트럼 정보를 제공했다. 이러한 변화는 결정 구조의 각 방향에서 Ln3+ 이온의 상이한 분자 패킹에서 유래하는 결정에 존재하는 광학 이방성에 기인했다. 본 명세서에 기재된 HSI는 분자 물질의 분광 공간 조사를 위한 이러한 기술의 적합성의 예이다. 그러나 중요한 것은 이 프로토콜은 다른 유형의 발광 물질(예: 미크론 크기의 분자 결정, 무기 미세 입자, 생물학적 조직의 나노 입자 또는 라벨이 부착된 세포 등)에 대해 쉽게 확장될 수 있으며, 구조-물성 관계에 대한 심층적인 조사를 위한 많은 가능성을 열어줍니다. 궁극적으로 이러한 조사는 바이오 이미징에서 도파관 또는 광전자 장치와 같은 기술 응용 분야에 이르기까지 광범위한 응용 분야에 대한 첨단 재료 엔지니어링에 활용될 수 있는 지식을 제공할 것입니다.
Introduction
하이퍼스펙트럼 이미징(HSI)은,2,각 x-y 좌표가 모든 종류의 분광법, 즉 광발광, 흡수 및 산란 분광분광을 기반으로 할 수 있는 스펙트럼 정보를 포함하는 공간맵을생성하는 기술이다.3 결과적으로 x-y 좌표가 공간 축이고 z 좌표가 분석된 샘플의 스펙트럼 정보인 3차원 데이터 집합("하이퍼스펙트럼 큐브"라고도 함)을 얻습니다. 따라서, 하이퍼 스펙트럼 큐브는 기존의 분광법보다 샘플의 더 상세한 분광 조사를 제공, 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함. HSI는 원격 감지(예: 지질학, 식품 산업., 4)의분야에서 수년간 알려져 왔지만, 최근에는 생체 의학 응용 분야3,36,,77,8을위한6나노물질2,,5 또는 프로브의 특성화를 위한 혁신적인 기술로 부상하고 있다. 일반적으로 말하자면, UV/가시/근적외선(NIR) 도메인에 한정되는 것이 아니라, 예를 들어 다른 물질의 원소 분포를 특성화하기 위해 X선과 같은 다른 방사선 소스를 사용하여 확장할 수있다 9 – 또는 테라헤르츠 방사선, 여기서 HSI는 생물학적 조직에서 열 감지를 수행하기 위해 사용되었다8. 또한, 광발광 매핑은 단층 MoS210의광학적 특성을 프로브하기 위해 라만 매핑과 결합되었다. 그러나, 광학,HSI의 보고된 응용 가운데, 여전히 란탄계 물질11,12,13,,14,,15,,16,,17의HSI에 대한 몇 가지 예가 있다., 예를 들어, 우리는 인용할 수 있다: 조직에서암의 검출6,생물학적 조직에서의 광 침투 깊이의 분석7,다중 생물학적 이미징3,하이브리드 시스템11의다성분 에너지 전달분석, 및 나노입자의 분광특성의 응집 유발 변화에 대한 조사12. 분명히 HSI의 매력은 환경별 발광에 대한 지식을 생성하여 프로브에 대한 동시 공간 및 스펙트럼 정보를 제공하는 적합성에서 비롯됩니다.
본 명세서에서 이러한 강력한 기술을 활용하면 이종핵 결핵3+-Eu3+ 단결정[TbEu(bpm)(tfaa)]6]6(도 1a)13의광학 이방성을 조사하는 프로토콜을 기술한다. 관찰된 광학 이방성 은 다른 결정학적 방향에서 Ln3+ 이온의 상이한 분자 패킹에서 유래(그림 1b),더 밝게 보여주는 일부 결정 면의 결과, 다른 사람은 조광 광발광을 보여주는. 결정의 특정 면에서 증가된 발광 강도는 Ln3+··· Ln3+ 이온 거리는 가장 짧은13이었다.
이러한 결과에 의해 동기를 부여, 우리는 HSI를 통해 광학 이방성을 분석하는 상세한 방법론의 설립을 제안, 특정 분자 배열에서 유래 이온 에너지 전달 프로세스 및 조정 발광 특성의 더 나은 이해를위한 경로를 열어18,,19. 이러한 구조-특성 관계는 나노 및 마이크로 스케일의 도파관 시스템 및 광자기 저장 장치를 포함하되 이에 국한되지 않는 혁신적인 광학 재료 설계를 위한 중요한 측면으로 인식되어 왔으며, 보다 효율적이고 소형화된 광학 시스템에 대한 수요를해결한다 20.
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Protocol
주의: 이미저를 조작할 때 항상 사용되는 여기 파장에 맞는 안전 고글을 사용하는 것이 좋습니다.
1. 고스펙트럼 현미경의 구성
참고: 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템의 개요는 그림 2a에있으며, 이미서의 주요 구성 요소는 설명되어 있습니다. 이미징 시스템은 시료로부터 가시광선 또는 근적외선(NIR) 방출의 검출에 사용될 수 있다. 어떤 검출이 필요한지(가시 또는 NIR)에 따라 라이트는 두 개의 서로 다른 광경로(그림 2e)를통과합니다. 서로 다른 빔 선회 큐브와 이색 필터 큐브(광학 큐브)의 조합은 각각의 경로를 선택하기 위해 계측기의 특정 위치에 배치되어야 합니다.
- 이미징 시스템에 연결된 컴퓨터의 전원입니다. 컴퓨터 모니터를 켭니다.
- 적절한 광학 큐브 구성을 설정합니다(그림2b,c).
참고: 여기서, UV 여기 및 가시 방출 검출을 이용한 HSI 매핑에 대한 이미저구성(optical cube configuration)이설명된다. 그러나 분석된 샘플에 따라 NIR 여기 및 가시 또는 NIR 방출 검출을 위해 이를 변경할 수도 있습니다. 대표 결과 섹션을 참조하여 예를 들어 보겠습니다.- 현미경 단계(도 2a에서1)에서 시작하여 검출기를 향한 방출 빔 경로를 따라(도 2a에서3), 광학 큐브에 대한 첫 번째 위치를 남기고(도 2b에서4) 공석을 두고 공초점 현미경 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2b에서5로 표시된 위치에 배치하여 시료로부터의 방출이 가시광선 경로를 통해 전달되도록 한다.
- 검출기를 향한 광학 경로를 따라, 도 2b에서6으로 표시된 위치에서, 검출 경로로 가시 방출을 지시하기 위해 이색 거울 및 필터를 포함하는 가시 광학 큐브(CM1-P01)를 배치한다.
- 검출기를 향한 경로를 계속, 공초점 핀홀 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2b에서 7로 표시된 위치에 배치하여 가시광 검출 경로를 통해 빛을 지시한다. 그런 다음 경로를 따라 공초점 분광계 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2c의 위치 8에 배치하여 방출된 빛이 검출기에 도달되도록 합니다.
- HSI 매핑의 경우 사용되는 핀홀의 크기와 일치하도록 검출기 슬릿 개구부(그림 2c의9)를 수동으로 제어합니다(약 50mm는 최적입니다).
- PHySpec 소프트웨어에서 핀홀의 조리개를 선택합니다(그림 3의5).
참고: 핀홀 조리개가 작을수록 신호 강도가 희생되는 HSI 해상도가 좋습니다.
- 스위치(도2d에서 도 2d)를 ON 위치에 배치하여 광대역 램프(그림2d,인세트)를 켭니다. 여기 빛의 강도를 제어하려면 11(그림2d)으로표시된 노브를 더 높은 값(32 – 가장 낮은 강도) 또는 더 낮은 값(1 – 가장 높은 강도)으로 돌립니다. 광대역 램프 셔터(도 2d의12)를 설정 하는 동안 닫혀 있습니다.
주: 값이 높을수록 램프에서 방출되는 전력 밀도의 감쇠가 높고 값이 낮을수록 감쇠가 낮아집니다. - 스위치를 ON 위치로 설정하여 아래 순서대로 다음 하드웨어를 켭니다.
- ThorLabs 모션 컨트롤러를 켭니다.
- 니콘 전원을 켭니다.
- ASI 컨트롤러를 켭니다.
- 갈보 컨트롤러를 켭니다.
- ProEm 검출기를 켭니다.
- 베이스펙 감지기를켭니다.
- 컴퓨터에서 PHySpec 소프트웨어를 아이콘을 두 번 클릭하여 엽니다.
- IMA 업컨버전 시스템을 초기화하려면 키보드의 F8 키를 누르고 시스템에 연결 창에서 확인 버튼을 클릭합니다.
참고: 1.5.1단계. 시스템 탭을 클릭한 다음 연결을 클릭하여 시스템에 연결 창에 도착하여 수행할 수도 있습니다. 그런 다음 OK 버튼을 클릭하여 이미징 시스템을 소프트웨어에 연결할 수 있습니다. - 그림 3과같이 모든 메뉴가 인터페이스(컬러카메라, ProEm 및 Bayspec)와화면 왼쪽에 있는 계측기 제어판에 표시되는지 확인합니다.
- IMA 업컨버전 시스템을 초기화하려면 키보드의 F8 키를 누르고 시스템에 연결 창에서 확인 버튼을 클릭합니다.
2. [TbEu(bpm)(tfaa)6]단결정의 하이퍼스펙트럼 이미징
- 샘플을 준비하기 위해 현미경 유리 슬라이드에 결정을 놓습니다. 더 높은 배율을 사용해야 하는 경우, 얇은 커버 유리로 크리스탈을 덮고 테이프로 고정하여 시료를 대물 렌즈를 향하도록 얇은 커버 유리로 배치할 수 있습니다.
- 샘플이 현미경 단계에서 제조된 유리 슬라이드를 놓고 금속암(그림 4a,b)을사용하여 고정합니다.
- 사용 목적 위에 샘플을 배치하기 위해 ASI 컨트롤러의 조이스틱(그림4c)을사용하여 샘플을 이동합니다.
- 올바른 필터 큐브를 목표 아래 바퀴에 수동으로 배치하여 램프의 UV 여기를 선택하고 검출기쪽으로 가시 방출을 전달하도록 합니다(그림 5의3).
참고: 추가 필터 큐브는 녹색 또는 파란색 광등 여기를 사용할 수 있으므로 적절한 여기 파장에 적합한 필터 큐브를 배치하는 것이 중요합니다. - 20X 목표(그림 5에서5로 표시)를 샘플 아래에 수동으로 배치하고 현미경의 왼쪽에 있는 흰색 버튼(그림 5에서6)을 눌러 백색광을 켭니다.
- 백색광 전원 버튼 아래의 노브를 돌려 밝기를 조정합니다(그림 5의7).
- PHySpec 소프트웨어에서 컬러 카메라 창에서 재생(비디오) 버튼을 누르면 라이브 스캔이 발생합니다.
- 컬러 카메라 창에 검은색 이미지가 표시되면 색상 카메라 탭 아래의 계기판제어판에 있는 노출 시간(그림 3에서2) 및/또는 게인 값(그림 3의3)을 늘립니다. 조회한 이미지가 너무 밝으면 노출 시간 및/또는 이득 값을 줄입니다.
- 현미경의 오른쪽에 있는 전방 손잡이(그림 5의2)가 R로 설정되어 신호의 20%를 카메라/쌍안경으로 보내고 신호의 80%를 검출기로 전송합니다.
- 목표와 스테이지 사이의 거리를 조정하여 샘플에 초점을 맞춥니다(그림4b). 이것은 현미경의 오른쪽에 그림 4d에 표시된 노브를 돌려 수행됩니다.
참고 : 더 큰 손잡이는 거친 조정에 사용되며, 작은 손잡이는 더 섬세하고 작은 초점 변경을위한 것입니다. - 수동으로 선택한 목표도 소프트웨어에서 선택되어 있는지 확인합니다. 먼저 상단 메뉴 모음의 보기 단추를 클릭한 다음 한 개의 [보기] 막대를 클릭하여 배율 표시줄을 클릭하여 이미지에 축척 막대를 표시합니다(그림 3의1). 그런 다음 명령 제어판의 갈바노미터 탭으로 이동하여 사용된 목표를 선택합니다(그림 3의4). 소프트웨어에서 적절한 목표를 선택하여 표시된 축척 막대가 올바른지 확인합니다.
- 소프트웨어에서 SpectraPro SP-2300 탭에서 탭 전환기 (ProEM – 6 그림 3)로이동하여 적절한 검출기를 선택하고 탭 필터 (ProEM의 경우 1200 gr / mm – 그림 3의경우 7)로 이동하여 격자를 선택하십시오..
- 시료의 UV 여기가 일어날 수 있도록 광대역 램프 셔터(도 2에서12)를 엽니다. 광대역 램프(UV) 여기의 강도를 제어하기 위해 강도 손잡이(도 2d에서11)를 원하는 위치(예: 8 – 중간 강도)로 돌립니다.
- 와이드 필드 조명(개방 조리개) 또는 더 작은 스팟 조명(더 닫힌 조리개) 중에서 선택하려면 그림 5에표시된 스틱과 노브를 사용하여 UV 램프 필드 조리개 크기를 제어합니다.
- SpectraPro SP-2300 탭에서 파장을 선택하여 샘플 방출을 관찰합니다.
- 시료의 방출 파장을 알 수 없는 경우 방출 스펙트럼을 획득합니다.
- 시퀀서에서 + 기호를 클릭하여 방출 스펙트럼을 수집하기 위한 새 시퀀스("노드")를 추가합니다.
- 분광계를 클릭한 다음 스펙트럼 수집(스펙트럼 스캔)을클릭합니다. Spectrum Acquisition
- 최소 파장(즉, 400nm)과 최대 파장(즉, 700nm)을 입력하고 확인을 클릭하여 스펙트럼이 기록될 스펙트럼 범위를 설정합니다.
- 소프트웨어의 왼쪽 메뉴에서 적절한 노출 시간을 선택합니다. 매우 밝은 시료의 경우 더 짧은 시간(예: 0.1s)을 선택하고 희미한 방출기의 경우 더 긴 시간(예: 2s)을 선택합니다.
- 광대역 램프(UV) 여기의 경우 여기 전력을 조정합니다(위의 1.3단계 참조).
참고: NIR 다이오드 여기의 경우 PHySpec 소프트웨어 의 왼쪽에 있는 중립 밀도 드롭다운 메뉴에서 조정할 수 있습니다.
- 시퀀서에서 더블 재생 버튼을 클릭하여 전체 시퀀스를 실행합니다. 스펙트럼이 표시되면, 샘플 방출의 검출을 위한 관심 영역을기록하십시오(예: Tb3+및 Eu3+기반 샘플의 경우 580 ~ 640 nm).
- 필요에 따라 시료의 초점을 변경하거나 PHySpec 소프트웨어의 노출 시간을 조정하여 신호 감지를 최적화합니다. 전술한 바와 같이 여기 소스(광대역 램프)의 전력을 변경하여 시료 방출 강도의 증가를 통해 신호 검출의 추가 최적화를 달성한다.
- 시퀀서에서 + 기호를 클릭하여 방출 스펙트럼을 수집하기 위한 새 시퀀스("노드")를 추가합니다.
- 이에 따라 컬러 카메라의 노출 시간(예: 0.5s ~ 2)과e.g., 게인(그림 3에서3)을 조정하여 양질의 이미지를 얻습니다. Figure 3 필요한 경우 PHySpec 소프트웨어 창 상단의 메뉴 두 번째 행에 있는 배율 표시/숨기기 막대버튼을 클릭하여 이미지에 축척 막대를 추가합니다.
- 권장 사항: 하이퍼스펙트럼 큐브를 획득하기 전에, 백색광 아래결정의 밝은 필드 광학 현미경 이미지를기록(도 6a)및/또는 UV 전체(도6b)또는 제한된 조명(도6c)조명(셔터 조리개에 의해 제어되는 UV 조명, 그림 5에4로 나타낸). 이렇게 하려면 샘플에 포커스를 맞추고 컬러 카메라의 재생 버튼을 클릭합니다.
- 파일을 클릭한 다음 창 보기 내보내기를클릭하고 원하는 형식을 선택하여 가져온 이미지를 내보내고 원하는 확장자(.h5, . JPEG).
- 하이퍼스펙트럼 이미지를 획득하기 전에 방 조명뿐만 아니라 백색광 조명을 끕니다.
- 하이퍼스펙트럼 큐브를 얻으려면 새 시퀀스를 작성합니다. 따라서 시퀀서에서 + 기호를 클릭하여 새 노드를 추가합니다.
- 공초점 이미저를 클릭합니다.
- 다중 스펙트럼 수집을클릭합니다. 여기서, 원하는 시야는 x 및 y 방향및 스텝 크기에서 획득할 점의 수에 의해 정의된다. 예를 들어 x에서 100포인트, y에서 100점을 5μm 단계 크기로 사용하여 500 x 500 μm의 이미지를 얻습니다.
참고: 각 지점의 총 수집 지점 수와 통합 시간은 하이퍼스펙트럼 큐브의 총 수집 시간에 직접적인 영향을 미칩니다.- 원하는 X 위치(예를 들어, 100) 및 Y 위치(예를 들어, 100)를 입력하고 원하는 스텝 크기(예를 들어, 5 μm)를 카운트한다. 눈에 보이는 방출 매핑(및 NIR 감지의 경우 소프트웨어 옵션)을 위해 카메라 동기화에 대한 하드웨어 옵션을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
- 다중 스펙트럼 수집을클릭합니다. 여기서, 원하는 시야는 x 및 y 방향및 스텝 크기에서 획득할 점의 수에 의해 정의된다. 예를 들어 x에서 100포인트, y에서 100점을 5μm 단계 크기로 사용하여 500 x 500 μm의 이미지를 얻습니다.
- 공초점 이미저를 클릭합니다.
- 시퀀서에서 새로 추가된 다중 스펙트럼 수집 선을 클릭하여 노드를 강조 표시합니다.
- 재생 버튼을 클릭하여 선택한 노드를 실행합니다.
참고: 획득에 소요되는 남은 시간은 노드 옆에 표시됩니다(예: 분(예: 28분). - 수집이 완료되면 하이퍼스펙트럼 큐브를 적절한 파일 형식(.h5)에 저장합니다.
3. 하이퍼 스펙트럼 데이터 분석
- 수집 직후 저장된 hyperspectral 큐브가 소프트웨어에서 자동으로 열리지 않으면 위쪽 메뉴 모음에서 파일을 클릭한 다음 커서를 가리키고 열기를 클릭하여 .h5 파일로 저장된 Open File…. hyperspectral 큐브를 Select data(s) to open 복구하고 열기 를 클릭합니다.
- 하이퍼스펙트럼 큐브 파일을 가져오면 표시된 하이퍼스펙트럼 큐브 이미지를 수정하여 큐브 이미지 상단의 막대를 왼쪽(예: 하부 파장, 예: 580nm) 또는 오른쪽(더 높은 파장, 예: 638nm)으로 이동하여 특정 스펙트럼 파장의 강도를 표시합니다.
참고: 선택한 파장이 이 위쪽 막대의 왼쪽에 표시됩니다(그림 7의1). - 분석에 대한 관심의 파장을 선택한 후(예를 들어,최대 강도, 이는 [TbEu(bpm)(tfaa)]의 경우 613.26 nm), 하나의 (또는 전부) 스펙트럼 분석의 세 가지 유형의 확인: (A) 이미지의 형태로 스펙트럼 분포6 (도 7에서2); (b) 관심 영역 전반에 걸친 방출 강도 프로파일(그림 7에서3); (c) 특정 지점 또는 관심 영역에서 스펙트럼의 추출(도 7의4).
- 이미지에서 스펙트럼 분포의 경우 자르기 및 Bin 기능을 사용하여 이미지의 신호 대 잡음 비율을 높입니다. 이렇게 하려면 상단 메뉴 처리를 클릭한 다음 데이터를 선택한 다음 자르기 및 Bin옵션을 선택합니다.
- 방출 강도 프로파일의 경우 큐브 이미지에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 대상 만들기 또는 X 만들기 프로파일 또는 Y 프로파일 만들기(그림 7의대상 - 5 및 6) 또는 선(그림 7의프로파일 - 7 및 8)을 분석해야 하는 경우 Y 프로파일 을 클릭하고 선택합니다. 커서를 사용하는 대상, 수평 또는 수직 선 프로파일을 드래그하여 분석 영역을 선택하고 큐브를 가로질러 이동합니다.
- 프로파일이 제대로 선택되면 지역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 그래프에 대상 추가를선택합니다. 대상(x축)의 물리적 위치의 함수로 방출 강도(y축)를 표시하는 새 그래프를 만드는 옵션을 선택했습니다.y 스펙트럼은 삽입된 새 그래프에 나타납니다(그림 7의6 및 7).
참고: 여러 대상을 만들 수 있으며, 이러한 대상은 서로 다른 색상 방출 프로파일로 표시됩니다(그림 7의5 및 6).
- 프로파일이 제대로 선택되면 지역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 그래프에 대상 추가를선택합니다. 대상(x축)의 물리적 위치의 함수로 방출 강도(y축)를 표시하는 새 그래프를 만드는 옵션을 선택했습니다.y 스펙트럼은 삽입된 새 그래프에 나타납니다(그림 7의6 및 7).
- 대안적으로, 샘플의 특정 영역의 방출 스펙트럼을 얻는다(도 7에서9). 먼저 큐브 이미지 위로 커서를 마우스 오른쪽 단추로 마우스 오른쪽 단추로 이동합니다. 팝업 탭에서 사각형 선택 또는 타원 선택 옵션을 클릭합니다.
- 큐브를 가로질러 커서를 클릭하고 드래그하여 원하는 영역 위에 선택 셰이프(예: 사각형)를 그립니다. 영역이 제대로 선택되면 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 그래프에 선택 추가를선택합니다.
- 나타나는 창에서 그래프에 추가, 새 그래프 만들기를 선택하여 대상의 방출 스펙트럼을 표시하고 확인을클릭합니다.
참고: 새 색선(그림 7의8)은 대상 방출이 표시되는 그래프에 표시되며, 방출 강도는 y축과 x축의 파장으로 표시됩니다. 이 스펙트럼은 각 파장에 대해 선택한 영역의 평균 강도에 해당합니다.
- 스펙트럼이 얻어지면 한 번에 하나의 영역만 선택할 수 있으므로 새 영역을 선택하기 전에 저장합니다. 이렇게 하려면 그래프가 포함된 창을 선택합니다. 파일 메뉴에서 로 저장을 선택하고 원하는 이름을 사용하여 원하는 폴더에 그래프를 저장하도록 선택합니다.
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Representative Results
Ln 기반, 분자 단결정(즉, [TbEu(bpm)(tfaa)]6], 도 1a에대한 데이터 수집을6위한 초스펙트럼 현미경의 구성을 설명하기 위해, 도 2는 설정에서 광학 큐브의 올바른 배치뿐만 아니라 시스템의 개요를 나타낸다. 그림 3은 HSI 획득 시 사용된 메뉴를 포함하는 PHySpec 소프트웨어의 스크린샷을 보여 줍니다. 도 4 및 도 5는 분석할 샘플을 포함하는 유리 슬라이드의 배치를 포함하여 현미경 단계를 보다 자세하게 보여준다. 선택된 UV 조명은 결정의 가시적 적색 발광을 나타내기 위해 켜졌다(도4a 및 도 5에서1). 도 6a는 적절한 초점으로 샘플을 조정한 후 기록된 결정의 밝은 필드 이미지를 나타낸다. 결정의 바늘 같은 형태는 명확하게 볼 수 있습니다. 도 6b, c는 전체 보기(도6b)또는 국소로 제한된(도6c)조명으로 UV 여기 하에서 동일한 결정의 이미지를 보여준다. 넓은 UV 조명 아래에서 크리스탈의 다른 면에서 방출 밝기의 차이를 즉시 볼 수 있습니다. 제한된 조명은 주로 도파관과 같은 동작을 유발할 수 있는 결정의 에너지 또는 광 전달의 영향을 조사하기 위한 옵션으로 사용될 수 있습니다. 이 경우, 강한 방출은 바로 여기 아래가 아닌 지점에서 검출된다. 이는 효율적인 에너지 이동이 결정13(그림 7에서5 및 6)을 통해 일어난다는 것을 시사한다.
획득된 하이퍼스펙트럼 큐브로부터, 획득된 하이퍼스펙트럼 큐브의 임의의 픽셀 또는 영역에서 특정 파장의 특정 파장, 특정 방출 파장의 강도 프로파일, 방출 스펙트럼을 나타내는 이미지의 형태로 스펙트럼 분포를 얻을 수 있다. 일례로, 도 7(패널 4)에 주어진 방출 스펙트럼은 Eu3+ 이온의 가장 특징적인 방출 대역을 나타내고 있다: 590 nm에서 관찰된 대역은 자기 다이폴(MD)에 할당되어 5D00→7F1 2 전이EU3+, 610 에서7630 nm 의 방출 피크동안( 610 에서 630 nm) 및 과감성 전기 디폴트(2+)에서 2.3+ 53+ 이러한 두 전이의 통합 강도 사이의 비율은 단결정21의구조에서 Ln3+ 이온 주위의 화학 적 환경의 우수한 프로브로 잘 알려져 있다: Ln3+ 이온 주위의 대칭이 낮을수록, 더 큰 ED/MD 비율이다. 이를 통해 Ln3+ 이온의 화학 적 환경의 대칭 특성에 대한 결론을 도출 할 수 있습니다. 더욱이, 5D0→7F2 전이의 스탁 스플릿 은 또한 결정학적 환경에서 Ln3+주위의 대칭과 상관 될 수 있습니다 - 낮은 대칭, 높은 스탁 하위 레벨의 수입니다. 낮은 대칭 트라이클리닉 결정 시스템에서 결정화된 바늘형 다형성의 경우, 5D0→7F2 전이가 4개의 서브 피크로 분할된다(도 7,패널 4에 나타낸 스펙트럼). 이러한 분석은 발광 결정의 여러 다형성의 광학적 특성을 비교할 때 특히 매력적이다. 앞서 단결정 X선 분석13에의해 얻어진 분자 결정 구조와 광학 분석으로부터 추론된 화학적 환경에 대한 정보가 잘 상관된다는 것을 입증하였다. 또한 그림 7(패널 3)에 표시된 다른 크리스탈 면을 따라 스펙트럼 프로파일이 팁과 측면 면에서 더 밝은 방출을 나타내며 Ln3+··· 세 가지 공간 방향에서 Ln3+ 이온 거리(그림 1b):팁과 측면 면에 수직으로 축을 따라 조밀한 Ln3+ 패킹은 각각 이온 이온 에너지 전달을 선호합니다. 따라서, 방출 향상은 각각의 얼굴에서 관찰된다, 따라서, 광학 이방성.
전반적으로 그림 7과 그림 8에표시된 다양한 데이터 분석 옵션은 발광 샘플의 HSI 분석을 통해 탐색할 수 있는 결합된 분광 및 공간 정보의 가장 중요한 특징을 구성합니다.
그림 1: 분자 구조 및 결정학적 배열. (a)이종 핵 Ln 계 복합체의 구조 [TbEu(bpm)(tfaa)6],여기서 Ln1 및 Ln2는 결핵3+ 및 Eu3+ 이온이다. 무질서한 단 및 수소 원자는 명확성을 위해 생략됩니다. 색상 코드: Eu: 다크 시안; C: 회색; O: 빨간색; N: 블루; F : 라임 그린. (b)결정내의 분자 패킹의 표현: (i) 상단 뷰 및 (ii) 선택된 분자간 및 분자내 Ln····· 바늘형 단결정 구조의 팁 보기 Ln 거리 (tfaa 하위 단위 및 수소 원자는 명확성을 위해 생략됩니다). (iii) [TbEu(bmp)(tfaa)]의 결정 패킹배열은 6]이량체(수소 원자는 명확성을 위해 생략된다). (iv) 가장 짧은 Ln·····를 드러내는 디머의 결정 성장면 다이어그램 (0 1 0) 및 (2-1 1) 결정방향에서 Ln 거리. 도면은 참조 13에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템의 개요. UV 여기를 사용하여 가시 스펙트럼 영역에서 발광 매핑에 필요한 구성을 도시화합니다. (a)시스템의 일반적인 뷰는, 1은 현미경 단계이고, 2는 광학 구성을 포함하는 단면이고, 3은 가시및 NIR 검출기가 있는 분광계이다. (b)실험을 위한 광학 구성을 보여주는 현미경 스테이지(a)에 가까운 광학 설정의 개방도: 광학 큐브 위치 confocal microscope 4는 가시경로를 통해 빛을 라우팅하기 위해 위치 5에 배치되고, 가시큐브는 가시광선을 검출 경로로 지시하기 위해 위치 7 6에 배치되고, 공초점 핀홀은 가시적 경로에 배치되고, 공초점 핀홀은 가시적 핀홀이 가시경로에 배치된다. 6 (c)검출기 (a의 왼쪽)에 가까운 광학 설정의 개방뷰를 열고, 공초점 분광계 큐브가 분광계및 가시 카메라에 빛을 반사하도록 배치된 위치 8을표시합니다. 인세트 9는 분광계 슬릿의 개구 폭을 조정하는 나사를 보여줍니다. (d)현미경 단계, 컴퓨터 및 광대역 램프 (UV 여기사용) 컨트롤러의 보기. 인세트에서 광대역 램프 컨트롤러는 더 자세히 표시됩니다 : 10은 켜기 / 끄기 버튼, 11은 램프의 강도를 제어하는 손잡이이며 12는 셔터 버튼입니다. (e)현미경 스테이지에서 검출기까지의 가시/NIR 광학 경로를 보여주는 방식( 광학 큐브 위치 포함)을 4 에서 8까지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HSI에 대해 조정될 매개변수가 있는 메뉴를 보여주는 PHySpec 소프트웨어의 스크린샷. 1은 컬러 카메라 이미지에 스케일 막대를 삽입할 수 있도록 합니다. 도 2와 3은 각각 컬러 카메라의 노출 시간과 이득 값을 제어할 수 있도록 한다. 적절한 대물 렌즈는 4에서선택해야합니다. 5는 핀홀의 조리개를 선택할 수 있습니다. 도 6(전환기) 및 7(필터)은 각각 검출기와 격자를 선택할 수 있도록 한다; 7 가시 검출기의 노출 시간은 8로설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현미경 단계의 일반적인 보기. (a)샘플의 적색 발광을 보여주는 UV 조명 ON(유리 슬라이드 중앙에 있는 작은 빨간 점)과 함께 단계에서 샘플을 포함하는 유리 슬라이드의 배치. (b)상단에 백색 광 조명 응축기가있는 현미경 단계의 보기. (c)스테이지 컨트롤러는 주황색과 노란색 화살표로 표시된 방향으로 스테이지의 움직임을 제어하는 조이스틱을 보여 주었습니다(또한 (a)에 도시됨). (d)빨간색 화살표로 표시된 방향으로 스테이지를 이동하는 포커스 버튼의 상세보기(또한(b)에표시됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 현미경 단계의 성분. 1 현미경 단계는 목적 렌즈의 상부에 샘플 스테이지상에 놓인 유리 슬라이드상의 샘플; 2개의 바퀴는 초점(large wheel)을 조정하고 캡처된 방출(작은 바퀴)을 검출기(L)로만, 부분적으로 검출기(R)로, 또는 부분적으로 카메라(R)로 또는 전적으로 쌍안경 렌즈(eye)로 지시하는; 여기 파장 범위를 선택하는 데 사용되는 3 가지 여기 / 방출 필터 휠. 오른쪽의 세부 사항은 이 실험에 사용된 UV 필터와 긴 패스 필터를 들고 있는 필터 큐브를 보여 주며; 상단/하단에 4개는 샘플을 통해 여기 빔을 이동하는 노브를 보여주고, 그 사이에, 원형 필드 조리개 제어; 5 개의 대목적 렌즈; 6 백색광 조명의 켜기/끄기 버튼; 백색 등등 밝기를 조정하는 손잡이 7개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 분석된 단결정의 광학 현미경 이미지. 이들 이미지는(a)백색광 조명,(b)풀뷰 UV 조명, 여기 원형 조리개를 사용하여 완전히 개방되고,(c)국소로 밀폐된 UV 조명(흰색 원으로 표시됨)을 사용하여, 가까운 여기 원형 조리개를 사용하여 수득하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 하이퍼스펙트럼 큐브 데이터 분석 프로세스를 보여주는 PHySpec 소프트웨어의 스크린샷입니다. 다양한 스펙트럼 분석 방법은 획득 한 하이퍼 스펙트럼 큐브에 적용 할 수 있습니다 : 1은 2에도시 된 스펙트럼 이미지 분포에 대해 선택된 파장을 나타낸다; 도 3은 613.26 nm 수평(7) 및 수직(8) 강도 프로파일을 나타낸다. 도 4는 표적 5 및 6및 도 9에서 강조표시된 영역으로부터 추출된 방출 스펙트럼을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 상전 나노 입자와 란탄화물 복합체 사이의 시너지 효과를 프로빙하는 HSI의 대체 적용. 이 예는 분자 결정([Tb 2(bpm)(tfaa)6]으로 구성된 하이브리드 시스템의6고스펙트럼 분석을 업컨버터닝 나노 입자와 결합한(NaGdF4:Tm3+ +Yb3+)을 나타낸다.2 (a)980 nm 광 조사 하에서 하이퍼 스펙트럼 이미징에 사용되는 관심 영역 (ROI)과 함께 흰색 및 UV 광 조명 아래 의 현미경 그래프. (b)Tm3+ 및 간접 Tb3+ 배출은 20 x 20 μm2의영역에 걸쳐 모니터링. (c)방출 대역의 절대 강도의 변화는 표면에 분포된 재료의 총량에서 약간의 가변성을 나타내는 하이브리드 시스템 전반에 걸쳐 변동된다. (d) 복합체의 통합 방출과 TM3+사이의 비율의 불변성 : 1G4→3H6 (사각형) 및 Tm 3+: 1G 44→3F4 (원) 하이브리드 시스템 전반에 걸쳐 두 개의 모이티의 동시 존재를 확인하였다. 스케일 바는 광현미경 에서 20 μm이고 ROI 및 스펙트럼 맵에서는 5 μm입니다. 사진 현미경은 실제 색상으로 제공됩니다. 도면은 참조 11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 하이퍼스펙트럼 이미징 프로토콜은 샘플의 정확한 위치에서 분광 정보를 얻을 수 있는 간단한 접근법을 제공합니다. 설명된 설정을 사용하여 공간해상도(x 및 y 매핑)는 0.5 μm까지 도달할 수 있으며 스펙트럼 해상도는 가시 범위에서 매핑하는 데 0.2 nm, NIR 범위에 는 0.6 nm가 될 수 있습니다.
단결정에 hyperspectral 매핑을 수행하기 위해, 샘플 준비는 쉬운 절차를 따릅니다 : 결정은 단순히 필요에 따라 커버 유리로 덮여 유리 현미경 슬라이드에 배치 할 수 있습니다. 소프트웨어의 컬러 카메라 설정에서 적절한 대물 렌즈와 밝은 필드 이미지를 사용하여 샘플을 초점을 맞추는 것은 사전 분석 단계에서 가장 잘 해결된 하이퍼스펙트럼 이미지를 얻기 위한 매우 중요한 단계입니다. 일반적으로 시료가 잘 집중될 때 더 높은 방출 강도가 얻어진다. 이 작업이 완료되면 x 및 y 개수 및 단계 크기와 같은 분석 매개변수를 선택하면 얻어진 하이퍼스펙트럼 큐브의 시야와 공간 샘플링이 각각 결정됩니다. 그러나 목표의 수치 조리개와 여기/방출 파장은 각 수집 지점에서 프로브되는 샘플의 실제 부피를 결정합니다. 예를 들어, 본 연구에서 사용된 목표의 경우, 0.4의 수치 조리개(NA)를 사용하고, UV 스펙트럼 범위(390 nm)에서 여기를 사용하여, 집중된 레이저 스팟은 x 및 y 방향으로 약 0.6 x 0.6 μm의 크기를 가지못한다. 레이저 스폿의 크기는 웹 사이트를 사용하여 계산되었습니다 (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, 2019년 9월 26일에 액세스). 선택한 단계 크기가 공간 샘플링보다 큰 경우 실제로 단계 크기에 의해 주어진 영역보다 작은 영역을 샘플링할 수 있습니다. 샘플이 균일한 경우 언더샘플링이 문제가 되지 않을 수 있습니다. 그러나 시료의 공간 적 편차가 검출하는 데 중요한 경우, 최적의 샘플링은 샘플의 레이저 빔 의 절반 크기로 설정된 단계 크기로 얻어진다. 선택한 노출 시간 및 UV 선택 조명의 세기는 얻어진 스펙트럼의 세기를 제어합니다. 이러한 매개 변수는 방출 강도와 UV 여기를 향한 민감도에 따라 샘플마다 다릅니다.
이 시점에서 프로토콜 내의 중요한 단계는 다음과 같이 나열 될 수있다 : 광학 시스템의 정렬, 광학 큐브의 올바른 배치, 여기 및 검출기 슬릿 개구부의 원형 조리개 조절, 핀홀의 선택, 적절한 목표 렌즈를 사용하여 컬러 카메라의 샘플의 초점, 광대역 램프의 강도와 긴 패스 필터 큐브의 적절한 선택 (UV 여기 허용) , 위에서 언급한 바와 같이 적절한 걸음 수 크기 및 노출 시간의 선택뿐만 아니라. 마지막으로, 하이퍼스펙트럼 큐브 수집의 모든 시간 동안 룸 표시등이 꺼져 있어야 합니다.
컬러 카메라 또는 분광계로 신호 감지가 불량한 경우, 이 기술의 문제 해결에는 하이퍼스펙트럼 큐브 수집을 시작하기 전에 위에 제시된 중요한 단계 각각을 주의 깊게 확인하는 것이 포함되어야 합니다. 현미경 단계에서 출력 신호의 구성도 중요합니다. 세 가지 가능한 구성은 눈(출력 신호의 100%가 현미경 쌍안경 마운트로 전송됨), L(출력 신호의 100%가 검출기로 전송됨) 및 R(출력 신호의 80%가 검출기로 전송되고 현미경 쌍안경 마운트로 20%)입니다. 하이퍼스펙트럼 큐브를 획득하는 동안 R 또는 L 구성을 사용해야 합니다. 위에 나열된 모든 파라미터가 올바르게 선택되면 샘플의 고해상도 공간 및 스펙트럼 정보를 얻을 수 있습니다.
본 명세서에 기재된 기술의 일부 가능한 변형은 발광 미세입자(14) 또는 업컨버터닝 나노입자와 결합된 분자 결정으로 구성된 광학 하이브리드 시스템과 같은 다른 시스템의 하이퍼스펙트럼 이미징에 의해 예시될 수있다(도 8)11. 이러한 예에서, NIR 레이저 다이오드(980 nm)는 생성된 가시 방출을 검출하면서, UV 여기를 대체하는 여기 소스로서 사용되었다. 하이브리드 시스템의 후자의 예에서, HSI는 업컨버터닝 나노입자(NaGdF4:Tm3+ +Yb3+)및 [Tb 2(bpm)(tfaa)] 6] 결정을 결합한 하이브리드 필름의 균질성을 다파장 반응형 등소성 시스템으로, 물질과 분자 간의 에너지 전달을 나타내는 다파장 반응 등방성 시스템으로 나타났다(도8)11.26 또한 시스템의 InGaAs 검출기를 사용하여 NIR 스펙트럼 영역(1000 ~ 1700 nm)에서 의 배출가스 검출이 가능해집니다. 이것은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 NIR 기반 광학 프로브의 조사를 추구 할 때 특히 관심3. 이 경우, 시스템의 광학 큐브구성(도 2e)은NIR 경로에 대해 설정되어야 한다. NIR 여기-NIR 방출의 경우, 여기서 설명한 초스펙트럼 기술의 한계 중 하나는 분명해진다: 파장에 의존하는 것으로서, NIR 영역의 스펙트럼 분해능은 가시적 검출, 즉 약 0.6 nm(vs. 0.2 nm)에 비해 낮다.vs. 또한, 서브-1 μm 피처의 경우, 예를 들어 더 작은 분자 결정, 나노 입자 또는 하이브리드 시스템에서 시스템 구성(사용된 목표 및 여기/방출 파장)에 의해 결정되는 공간 해상도는 또 다른 잠재적 한계가 됩니다.
마지막으로, (선택한 HSI 구성 및 파장 정권에 관계없이) 데이터 조작은 계측기의 소프트웨어로 수행하거나 스펙트럼 프로파일의 경우와 같이 Origin® 또는 Microsoft Excel과 같은 다른 소프트웨어 패키지에서 분석할 수 있도록 내보낼 수 있습니다. 이 예에서, 크리스탈의 광학 이방성도 컬러 카메라 이미지, 즉 다른 크리스탈 면을 따라 강한 강도 변화에 의해 즉시 드러났다. 더욱이, 넓은 UV 여기 하에서, 분석되는 면에 따라 상이한 방출 강도가 얻어진다(도7). 결정(도 7의표적)에서 상이한 관심 지점에서 방출 강도 프로파일을 얻을 수 있는 가능성은 더욱 방출 강도의 변화를 연구할 수 있게 하고, 존재하는 경우, 또한 스펙트럼 형상에서 도가능하다. [TbEu(bpm)(tfaa)6]의블록형 다형체는 두 개의 결정면이 제313에대해 동등하게 높은 방출 강도 및 낮은 방출 강도를 나타내는 예를 구성한다. 이에 따라 이방성없이 시스템의 경우 방출 강도는 모든 크리스탈 면에 대해 동일합니다.
광학 이방성 을 프로브하는 상보적 인 방법은 예를 들어 샘플에서 편광 방출의 존재와 관련이 있습니다. 여기에는 편광 기억 또는 분광 타원형이 포함됩니다. 제1은 입사환광의 편광상태와 물질에 의해 방출되는 빛의 편광 상태 사이의 상관관계로 구성되며,22,23은 박막(24)에 의해 비스듬히 반사된24후 빛의 편광 상태의 변화를 측정한다.22 그러나, 여기에 표시된 것처럼 광 이방성 프로파일을 조사하기위한 도구로 hyperspectral 이미징을 사용하는 장점은 편광의 존재가 샘플 분석을위한 요구 사항이 아니라는 사실과 함께 제공됩니다. 더욱이, 시료 제제는 박막의 제조를 필요로 하지 않으며, 입사및 수집된 빛에 대하여 결정의 매우 신중한 배향도 없다. 이러한 측면은 HSI의 기술을 잠재적으로 더 광범위하게 적용 가능하게 합니다. 또한 이방성 특징은 이미지 수집 시 즉시 시각화되며 데이터 분석은 간단합니다(위의 예시).
더 넓은 범위를 고려할 때, HSI 기술의 중요성은 환경에 의존하는 특징으로 광 신호를 코어레이팅하는 독특한 특성에 기인할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 연결은 나노-바이오 상호작용의 이해를 향상시키기 위해 필수적이다3,,15,,16 나노 의학의 성장 분야에서 또는 재료 과학에서 구조 특성 관계를 이해하기 도10,,11, 12,,12,13. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 기술의 미래 잠재적 응용은, 그러나 이에 제한되지 않음: 생체외에서생물학적 샘플의 분석, 생체 내 생체 및 생체 내 생물학적 관심의 분자의 매핑을 수행하는4,,6,현미경 단계의 적응은 환경 별 광전자 적 특성(예를 들어 전기 회로에 내장 된 샘플), 광학 온도 감지8,,15 (현미경 단계에 온도 제어기를 추가하여) 또는 가스 감지 (챔버에 온도 컨트롤러를 추가하여) HSI는 형광방출(25)대신에 형광 여기 기술에 적합하다는 것이 더욱 입증되었다. 이러한 특정 한 hyperspectral 기술 적응의 사용의 좋은 예는 생물학적 조직에서 암 세포의 검출6. 따라서, 여기에 기술된 프로토콜은 발광 구조의 많은 상이한 모형의 분광 특징의 연구 결과로 크게 확장될 가능성이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다. 저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 [TbEu (bpm)(tfaa)6]단결정의 제공에 대한 오타와 대학의 화학 및 생물 분자 과학학과에서 씨 딜런 Errulat및 교수 Muralee Murugesu 감사합니다. E.M.R, N.R., E.H.는 오타와 대학, 캐나다 혁신 재단(CFI), 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)가 제공하는 재정적 지원을 감사하게 생각합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope glass slides | FisherBrand | 12-550-15 | Glass slides used for sample preparation |
| Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager | PhotonETC | Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number |
References
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