Summary
我们描述了一种通过农业细菌根诱导毛茸茸的根的方法 - 在塔特里麦（法戈皮鲁姆塔塔里库姆）中介导的转化。这可用于研究塔塔麦中继发代谢物的基因功能和产生，用于任何基因转化，或用于改良后的其他药用植物。
Abstract
塔塔麦 （TB） -Fagopyrum 榻地（L.） Gaertn] 拥有各种生物和药理活性，因为它含有丰富的二次代谢物，如黄酮类化合物，特别是鲁氏素。全球逐渐利用植物原体诱导药用植物中的毛根，以研究基因功能，提高继发代谢物的产量。在这项研究中，我们描述了一种在结核病中产生由根介导的毛根的详细方法。在7-10天时选择科蒂莱顿和低血节轴作为外植体，并感染携带二进制载体的A.根茎，这诱发了1周后出现的令人毛骨悚然的毛根。根据形态、抗性选择（卡那霉素）和记者基因表达（绿色荧光蛋白）确定产生的毛根转化。随后，转换后的毛根根据需要自我传播。同时，骨髓性细胞病（MYB）转录因子FtMYB116，利用A.根细胞介导的毛根转化为结核病基因组，以验证FtMYB116在合成黄酮类化合物中的作用。结果表明，FtMYB116显著推广了黄酮类相关基因的表达和黄酮类化合物（鲁汀和奎西汀）的产生率（p < 0.01），表明A.rhizo基因介导的毛根可以作为研究基因功能和次生代谢物产生的有效替代工具。本研究中描述的生成毛根的详细分步协议可在调整后用于任何基因转化或其他药用植物。
Introduction
塔特里麦 （TB） （法戈皮鲁姆塔塔里库姆（L.） 盖尔滕） 是属于法戈皮鲁姆属和家族 Polygonaceae1的二恶二甲。结核病作为一种中药同源性食品，由于其独特的化学成分和多种生物活动，对疾病产生了浓厚的兴趣。结核病主要富含碳水化合物、蛋白质、维生素和类胡萝卜素，以及多酚，如酚酸和黄酮类化合物1。黄酮类化合物的各种生物和药理活性，包括抗氧化、抗高血压2、抗炎以及抗癌和抗糖尿病特性，已被证明有3种。
植物杆菌是一种土壤细菌，通过感染伤口部位44、5，5有助于几种高等植物，特别是二叶草病的发展。这个过程是由诱导（Ri）质粒55、66中的T-DNA转移开始的，通常伴随着来自Ri质粒的外源基因的整合和表达以及产生毛根表型7的后续步骤。A. 根茎 -介导的转基因毛根，作为植物生物技术领域的一种强大工具，由于其稳定和高生产率和容易在短时间内获得，得到了最广泛的应用。此外，由A.根茎诱导的毛根有效地区分其拉皮性根发育和高分枝生长在无激素介质8。它们可用于多个研究领域，包括人工种子生产、根结核研究，以及研究与其他生物（如霉菌、线虫和根病原体77、9）9的相互作用。此外，毛茸茸根转化培养物已被广泛用作研究生化途径和化学信号的实验系统，并生产用作药品、化妆品和食品添加剂的植物二次代谢物8,8，10。在野生型毛茸茸的根部合成的有价值的二次代谢物，包括多叶生物碱、异丙酮、龙烷生物碱、二烯醇和黄酮类化合物，在众多物种中已经研究了几十年，如Panax人参11中的人参、阿美马伊1212中的科马林和TB2中的酚类化合物。
毛根已经产生使用A.根基因在79种植物从27个家族14。例如，在大豆15，16，16萨尔维亚17，普伦巴戈印度18，莲花雅波尼库斯19，和菊花（Cichorium intybus L.）中报道了A.rhizo基因介导的毛根转化。1520.结核病毛根转化也已调查2.关于由A.根基因介导的毛状根的开发，很少详细的协议，要么携带二进制向量。例如，Sandra等人21日介绍了一种在野生型芽中维持的转基因马铃薯毛根生产方法。完全发育的毛根可以在将A.rhizo基因注射到马铃薯植物的茎间5-6周后可视化。另一项研究也报道了由A.根茎诱导的转基因毛根系统，该基因含有黄麻中的gusA报告基因（科丘齐斯帽状体L.）。22.此外，Supaart等人23利用表达载体pBI121转化的转基因烟草毛根获得，该基因携带β1-四氢大麻素酸（THCA）合成酶的基因，以产生THCA。
然而，有效生成毛茸茸的根部转化的分步过程，特别是在结核病中，其表现相对较少。在这项研究中，我们描述了一个详细的协议，使用携带报告基因（GFP），选择性标记（Kan）和感兴趣的基因（b4，从我们组识别，但未发表的基因从基本螺旋环螺旋（bHLH）家族）产生毛茸茸的根基因转化在结核病。实验持续了5-6周，从种子的接种到毛茸茸的根的生成，涉及外植制剂、感染、凝育、亚培养和随后的传播。此外，A. 根茎基因包含携带骨髓性细胞变核转录因子116（FtMYB116）的二FtMYB116元质粒，用于确定FtMYB116能否促进在结核病基因和代谢水平上通过TB毛根转化积累类黄酮，尤其是鲁氏素。FtMYB116是一种光诱导转录因子，调节不同光照条件下鲁因的合成。黄酮合成酶（CHS），黄酮-3-羟基酶 （F3H），黄酮-3'-羟基酶 （F3'H）和黄酮醇合成酶 （FLS）24是参与鲁金生物合成代谢途径的关键酶.因此，本研究证明了FtMYB116在TB毛根的过度表达，关键酶基因的表达，以及鲁汀和其他黄酮类化合物（如奎西汀）的含量。
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Protocol
本研究中使用的结核病被命名为BT18，它起源于山西省农科院小杂粮研究中心培育的"金乔二号"品种。该协议的主要步骤如图1所示。
注：快速操作与植物相关的操作，并尽可能关闭培养皿，以避免枯萎和污染。除非另有说明，所有外植株孵育是在14小时光和10小时暗光期25°C下进行的。除非另有说明，否则所有与植物或细菌有关的操作都是在层压流量罩无菌条件下进行的。表1提供了A.根茎和体外植物培养物的所有介质成分。调整pH值后，所有介质在120°C下进行20分钟的自动固化。凝固介质通过将25 mL的介质填充到直径为9厘米的培养皿中，使其凝固。
注意：将所有转基因细菌和植物放入适当的废物容器中。将所有危险化学品放在烟盒中，并存放在危险废物容器中。
1. 结核病外泄制剂
- 结核病种子的制备
- 选择在温度低于+20°C下保存不超过2年的丰满和未损坏的结核病种子（图1A1）。
- 在28°C下将种子浸入水中约20分钟，以便种子涂层很容易被剥落（图1A2）。如有必要，使用剪刀在种子上切开一个槽，以方便剥皮。
- 结核病种子的灭菌
- 将 100~200 个去皮种子放入 100 mL 消毒锥形瓶中。
- 使用75%乙醇对种子进行30s消毒。
- 用5%次氯酸钠代替乙醇，消毒15分钟。
注：在灭菌不足的情况下，使用浓度为1克/L的二氯化汞消毒可作为替代灭菌剂，以取代次氯酸钠。
注意：二氯化汞是危险的，不是环境友好型材料。在熏蒸柜中操作，如果在任何情况下使用二氯化汞，则将其放入危险废物容器中。 - 倒出次氯酸钠。
- 使用无菌脱离子水清洗种子 5 次。
- 用无菌的纸把种子擦干。
- 结核幼苗的制备
- 在300mL植物组织培养瓶中制备50 mL Murashige和Skoog（MS）基底介质（1962年），辅以30克/升蔗糖和7克/升铝粉（MSSA）（表1）。
- 在高压灭菌前，将 pH 调整为 5.8。
- 每瓶MSSA介质均匀分配10个种子。
- 在光线条件下在25°C~1°C下在培养室中发芽种子7~10天。
- 无菌外植的准备
- 当展开2块结核时，选择结核的强健幼苗（图1C）。
- 切断树苗从根部（图1C红破头箭头），避免与介质接触。
- 把它们放在无菌的培养皿中。
- 将下科基切成 0.8⁄1 厘米段，并将小乳片剪切成约 0.5 厘米的碎片。
- 在24小时的光照条件下，在MSSA介质上预栽这些外植。
- 将它们转移到100mL消毒锥形瓶中，现在可以感染。
2. 制备A.根基因进行转化
注：A. 根基因菌株ACCC10060由药用植物开发研究所提供，并保存在+80°C。A. 根茎基因与二进制载体pK7GWIWG2D（II）进行转化，该载体含有T-DNA携带B4基因，附带GFP作为指标基因，Kan抗性基因作为可选择标记。该基因b4是转录因子bHLH家族的成员，尚未发表。为了评估结核病毛状根的潜力，A. 根茎基因与含有MYB116基因的二元载体pK7WG2D进行转化，以研究其在基因表达水平和代谢分析下对二次代谢物（如黄酮类物）产生的影响。活性A.根基因应做好充分准备，同时与外植。
- A. 根基因的激活
- 冰上解冻的根
- 浸入细菌，并均匀地将它们线到酵母曼尼醇介质 （YEB）， 辅以 15 g/L agar 粉末， 50 毫克/L 里法霉素， 和 50 毫克/L 异种霉素 （YEBARS， pH 7.0）.
- 在28°C下孵育细菌12~16小时。
- 选择单克隆殖民地，并在另一种培养皿中以上述相同的方式进行栽培。
- 选择单克隆菌落，并在含有20 mL YEB介质的100 mL消毒锥形瓶中培养它们，辅以50mg/L里福霉素和50mg/L异种霉素（YEBRS，pH 7.0），在28°C和200 rpm，16~18小时，直到OD600值达到2.0。
- 在28°C下与另一100 mL锥形瓶中孵育2%~4%的上述培养物，在28°C下含有20mL的YEBRS介质，在4-5小时内将200rpm孵育，直到OD600值达到约0.5（图1D）。
3. 结核病外植株的感染和筛查
注：该协议的目标是获得基因转化的毛茸茸的根。野生型根作为负对照来评估转基因表达。在此协议中，A. 根茎基因被转换与二进制载体pK7WG2D携带FtMYB116或pK7GWIWG2D（II）携带b4基因提前。
- A. 根基因的重新悬浮
- 将步骤 2.1.6 中获得的培养体转移到 50 mL 消毒离心管中。
- 在 4，000 x g下旋转 10 分钟，在 20 °C 下。
- 去除上清液，用MS介质重新悬浮细菌颗粒，辅以30克/升蔗糖和300μM醋酸酮（AS）（MSSAS，pH 5.8）至OD600 ± 0.2。
- 外植感染
- 将步骤 3.1.3 中获得的细菌悬浮液注入锥形瓶中，其中包含步骤 1.4.6 中制备的外植株 10 分钟（图 1E）。
- 拿出外植，用无菌的纸把它们晒干。
4. 与A. 根茎的外植共同培养
- 将无菌 9 厘米直径的过滤纸放在 MS 介质上，该滤纸使用 7 g/L agar 粉末进行凝固，并辅以 30 g/L 蔗糖和 100 μM AS（MSSAAS 介质，pH 5.2）。
- 在黑暗中将滤纸覆盖在25°C下3天（图1F）。
5. 归纳和选择性培养
- 在MSSA介质上放置约20种受感染的外植剂，辅以500毫克/升的锥形和50毫克/L卡那霉素（Kan）（MSSACK，pH 5.8）（图1G）。
- 在25°C~1°C的光照条件下垂直孵育它们。毛茸茸的根发生在孵育后大约1周（图1H黑破折号箭头指示毛茸茸的根发生）。
注：如有必要，每 15 天更换一次 MSSACK 介质。
6. 培养结核病毛根
注：这个程序旨在收获充满活力的毛茸茸的根。定期观察繁殖过程中毛根的生长，并及时清除受污染和灭活的根。如有必要，重复以下步骤以传播更多毛茸茸的根。从亚耕到收获大约需要10-14天。
- 选择显示白色外观和快速生长的毛茸茸的根。
- 把它们切成2-3厘米的碎片。
- 清楚地将它们编号在干净的长凳上。
- 将它们培养在含有5 mL MS介质的100 mL消毒锥形瓶中，辅以30克/升蔗糖和50毫克/L Kan（MSSK，pH 5.8），在黑暗中25°C的旋转速度为80 rpm，直到它们扩散到烧瓶底部（图1I）。
7. 确定转化的毛根和保护
注：可根据形态和基因水平的方面来识别转化的毛根。识别也可以根据本协议未涵盖的毛根基因组和阻力进行。本程序主要侧重于报告基因和目标基因的鉴定。
- 去除黄褐色和受污染的毛根，选择白色外观的根。
- 评估蓝色/光双紫外线转光器下是否有绿色荧光。
- 选择在编号管中表现出强荧光信号的毛茸茸的根部，或使用标记的锡箔包裹后，用吸水纸将其晾干。
- 在液氮中对它们进行嗜血，然后将所有收获储存在+80°C，以便进一步调查。
- 基因鉴定
- 将0.1克毛根三化成液氮中的细粉。
- 根据植物基因组DNA试剂盒制造商的指示，使用经过修饰的溴二乙二甲苯（CTAB）方法制备结核病独立转基因系的基因组DNA。
- 使用表2所列的100纳克基因组DNA模板和引物执行聚合酶链反应（PCR）。
- 执行放大周期如下：在94°C下预化5分钟，在94°C下变性30秒，引底剂在55°C下退火30秒，引素在72°C延长30秒。经过36个周期，并在72°C下完成最后延长步骤10分钟，在1%的琼脂胶凝胶上分析扩增产物。
- 用核酸染色染色凝胶，并在紫外线下可视化。
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Representative Results
农业细菌根- 介导的结核毛根转化
这项研究描述了为利用A.根茎获得基因转化的毛根而建立的分步协议。从结核病种子的接种到已鉴定的毛根的收获，大约需要5-6周的时间，图1（A-H）描述了一些关键步骤。A-H简单地说，消毒的壳种子接种（图1B），以实现更快的无菌发芽。A. 根茎（图 1D） 和无菌外植应分别提前激活和制备.接下来是一些关键步骤，包括感染活性A.根细胞（图1E）、共培养（图1F）和选择性培养（图1G）。G受感染的外植株应均匀地放置在凝固的MS介质上，并且必须在它们之间保持空间，以便容易地分离不同的转基因系。毛茸茸的根在外植的伤口部位以蓬松的白色形式出现（图1H）。毛茸茸的根组成一个高度分支和互锁矩阵，可以根据需要传播（图1I）。收获的毛根可用于研究基因功能或基因或蛋白质-蛋白质相互作用。或者，TB 毛茸茸的根可以大量传播，以产生二次代谢物，如在指定的生物反应器中的鲁辛。
利用二进制载体（pK7GWIWG2D（II））证实在结核病中诱导转基因毛根的方法，该载体携带了GFP和b4（转录因子bHLH家族的成员，尚未发布）。记者基因GFP通过在蓝色/光双紫外转射器下可视化信号（图2）或识别目标基因（图3），轻松区分转基因毛根和非转基因根。经过改造的毛根在蓝色或紫外线照射下发光时表现出绿色荧光（图2A中使用黑色箭头表示），而未转换的毛根则未显示绿色荧光（图2B）。具有高 GFP 信号的毛茸茸的根被传播了两周，如图 2 Figure 2C所示。
为了进一步确定二元载体是否已成功转化为结核病基因组，进行了基因识别。简单地说，根据经过修改的CTAB方法25，为PCR分析准备了结核病毛根的植物基因组DNA。PCR是通过放大基因（Kan、GFP和b4）进行的，这分别存在于GFP图3中。底漆列在表2中。所有转基因系中的3个基因的存在（图3，通道5-11）表明，二元载体已成功转化为结核病基因组。在野生型根（图3，车道3）和实验负控制（图3，第4车道）中不存在Kan和GFP，而b4在野生型根部被检测到。这3个基因无疑出现在正控制（图3，车道2），但显然不存在在负控制（图3，车道4）。
使用上述毛茸茸的根系评估结核病中光诱导转录因子FtMYB116
FtMYB116是采用上述毛根诱导协议来表达的。这是通过将基因FtMYB116预插入二进制载体pK7WG2D，然后感染A.根瘤基因来实现基因过度表达来实现的。简单地说，使用液氮将0.1克毛根三分成细粉。根据植物RNA分离试剂盒26制造商的指示提取了总RNA。然后进行反向转录PCR和实时PCR，以放大FtMYB116和鲁辛合成通路相关基因。随后验证了FtMYB116对鲁因合成相关基因表达和鲁因的产生性调节作用。
图 4A显示了FtMYB116在 TB 毛状根的转基因线中的相对表达式。与对照组相比，FtMYB116的相对表达在所有3条独立转基因系中都有相当大的增加。图4B和图4C通过FtMYB116过度表达，在代谢水平上促进鲁汀和奎西汀的生物合成。与野生型相比，转基因中鲁汀和克霉素的含量明显增加（p < 0.01），分别达到40毫克/克/克，是野生型的8倍。所有3条转基因系中CHSCHS、F3H、F3'H和FLS的相对基因表达明显高于对照组F3'H（F3H图4D）。这些结果共同证实，本研究中描述的策略可以成功地用于在结核病中产生毛茸茸的根转化，并研究继发代谢物的基因表达和代谢结果。
图1：在结核病中诱导A.根茎- 介导的转基因毛根的过程。显示关键阶段的代表性图像： （A1） 和 （A2） 表示脱去种子外衣之前和之后;（B） 代表在含有 MSSA 介质的组织瓶中接种的每 10 个种子;（C） 表示接种后 7-10 天的结核病幼苗，红色破折号箭头显示切割点;（D） 和 （E） 分别指示A. 根茎（OD 600 = 0.5） 的制备和外植的感染;（F） 和 （G） 分别象征着在 MSSAs 介质上与活性A. 根茎的培养，以及 MSSACK 介质上的选择性培养;毛茸茸的根从（H）出现，如黑破折号箭头所示;和 （I） 显示毛茸茸的根层形成的传播;黑破折号箭头表示诱导毛茸茸的根。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：携带GFP报告基因的二进制载体的变换。（A） 表示在蓝色/光双紫外线转射器下检查选择性培养后诱导毛茸茸的根部。（B） 和 （C） 分别表示野生型根和转化毛根的传播。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：从基因组DNA中分离出7条独立转基因系的野生型根和毛茸茸的结核病根的基因（Kan、GFP和b4）的基因的PCR扩增。 GFP（A）： Kan， （B）： GFP ， （C）： b4.通道1：分子大小标记（白色箭头表示750 bp），车道2：质粒（二进制矢量pK7GWIWG2D（II）携带KanKan，GFP，b4基因作为正控制，车道3：野生型根，车道4：纯化H2O作为负控制，和车道5-11：7个独立的转基因线。 GFP b4请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：FtMYB116在结核病毛状根的转基因线中的相对表达。（A） FtMYB116的过度表达对 （B） 鲁汀和 （C） 曲霉素的生物合成的促进作用 （ 这个数字已由 Dong 等人 5修改过。实验在三联进行，并进行了3次。"*"表示使用学生t测试在 p < 0.01 处存在显著差异。（D） 转基因线中黄酮素合成途径相关基因的表达。相对表达式级别与行为控制级别一化。数据以均值 = 标准差 （n = 3）形式显示）。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 媒体 | 中等成分 | ||
| MSSA | Murashige 和 Skoog （MS） 介质含有 30 克/升的蔗糖，7 克/升、pH 5.8 中的 a加粉 | ||
| 叶巴尔 | 酵母曼尼醇介质（YEB）含有15克/升的a加粉，在50毫克/升时含有利法霉素，在50毫克/升时含有异霉素，pH7.0 | ||
| 耶布罗斯 | YEB含有利夫平素，在50毫克/升，和异种霉素在50毫克/升，pH 7.0 | ||
| MSSAS | MS 介质在 30 g/L 时含有蔗糖，醋酸酮 （AS） 在 300 μM，pH 5.8 | ||
| MSSAA | MS 介质在 30 g/L 时含有蔗糖，在 7g/L 时含有 a 加粉，AS 在 100μM 时，pH 5.2 | ||
| MSSACK | MS 介质在 30 g/L 时含有蔗糖，在 7 克/升时含有 agar 粉末，在 500 毫克/升时含有黄花粉，在 50 毫克/升时含有蔗糖（kan），pH 5.8 | ||
| MSSK | MS 介质在 30 g/L 时含有蔗糖，在 50 毫克/升时含甘蔗，pH 5.8 | ||
表1：介质及其成分。
| 底漆 | 序列 （5'-3'） | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTGG | |
| GFP-R | AAGTTCTCTATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTGTGG | |
| b4-R | 阿加茨卡特蒂加格 | |
| 坎-F | ATTCCTCTGGGCAC | |
| 坎-R | 加特加阿加阿加格海合 | |
表 2：引素序列。
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Discussion
结核病已用于与遗传和代谢5,水平1，2，5，27，282,的继发代谢物有关的几项研究。,27128毛茸茸的根培养作为代谢物产生的独特来源，在代谢工程29中起着关键作用，并可用于通过插入相关基因来改变代谢途径。Kim等人2最初介绍建立结核毛根培养物是由A.根基因介导的转化，以实现酚类化合物的产生。他们在结核毛根中获得的鲁丁含量比野生型根的含量高出10倍以上。在本研究中，FtMYB116的引入导致鲁丁相关基因的表达率较高，并激增了结核毛发根中鲁丁的产生。这项技术已证实适用于表皮表征和苯丙酮相关基因的表达，如FTF3H和FtFLS在TB毛茸茸的根5,5，30，31。,31张等人32日利用结核毛根对鲁因的产生进行了过度表达的一系列FtMYB转录因子。周等人33观察到，由于FTMYB11在TB毛茸茸的根部过度表达，鲁因语含量下降。这些结果连同我们的发现表明毛茸茸根转化对FtMYB转录因子和鲁辛生物合成相关基因相互作用的可行影响。
尽管关于诱导结核病毛茸茸根的分步协议的数据有限，但我们首次在分步协议中介绍，使用携带二元载体的A.rhizo基因，以高效和稳定的方式获得转基因结核毛根。在这些实验过程中，必须仔细考虑许多因素，以获得最佳诱导毛根。首先，外植的选择是一个决定因素。众所周知，TB品种会影响毛根的形态和酚类化合物的产生。Thwe等人30日说明，苯丙酮生物合成途径的基因表达和酚类化合物的含量在结核病品种中各不相同。他们还在一个品种中发现了毛茸茸的根，由于花青素含量13，它是深红紫色的。在我们的研究中，2个刚刚展开的粘质和下科基被选择作为外植。这是因为幼叶和嫩叶青睐高毛根诱导率2,2，30，而高度分化和老植物细胞对毛根诱导产生不利影响。其次，A. 根基因菌株对毛根诱导有显著影响。不同的细菌菌株在毛根的形态和诱导效率方面表现出不同的转化能力，这些能力可以通过菌株34所蕴藏的不同质粒来照亮。Aye等人35比较了几个A.根基因菌株（R1000、R1200、15834、LBA9402和A4）对结核病毛根诱导和苯丙酮生物合成的影响，发现结核病毛根生产最有希望的菌株是R1000。这一发现得到了Kim等人的支持。然而，ACCC10060菌株在Aye等人的研究中被排除在外，但在我们的研究中使用了它，显示出令人满意的感染效率。使用我们的协议获得的毛茸茸的根毛茸茸的白色外观与Salvia miltiorrhiza36中产生的毛茸茸的根一致，其中同一菌株ACCC10060携带二进制载体pK7GWIWG2D（II）用于沉默靶基因。第三，包括材料预处理和选择性培养中叶性集中的脱毛在毛根诱导中也起着至关重要的作用。任何步骤的不完全消毒都可能导致毛茸茸的根部转换失败。此外，细菌浓度对转化根的产生有重要影响。高浓度可能通过竞争抑制来减少植物细胞，而低浓度可能导致低可用性4。
此外，培养条件，如生长介质，适当的预栽和共生时间，和其他生物或非生物因素在毛根电感中起着重要的作用。黄等人37建议含有蔗糖的1/2 MS介质浓度为30克/升，用于共培养，以实现最大的结核毛根。这可以通过高盐介质来解释，适合毛茸茸的根的形成，而低盐介质赞成过多的细菌增殖34。AS是一种酚类化合物，通过34、38,38的农业细菌病毒区转录，可促进A.根茎-介导转化，在pH5.739，40,40的介质中可以有效诱导。因此，我们建议使用pH 5.2的共培养介质，辅以100μM的AS。黄等人37日报告说，TB毛茸茸的根在24日白天后从白色和淡黄色变成棕色。因此，他们每24天进行一次毛根亚栽;然而，我们建议每两周进行一次亚化，以避免毛茸茸的根部变黄。此外，光、激素、温度和紫外线辐射等环境条件似乎通过高度刺激或抑制信号转导41、42,42影响黄酮类生物合成相关基因的表达。先前的研究已经证明了远红光在监测TB毛茸茸根5中与鲁丁相关的基因表达的重要性。
A. 根基因介导的转化具有优势，即插入二元载体的任何外源基因都可以转移到转化的毛根克隆34，以实现过度表达，通过RNA沉默43功能丧失功能，或通过转录分析5发现新的代谢基因。毛茸茸的根有很大的潜力，产生继发代谢物，重组蛋白，甚至抗体44。这主要是因为其易生长的无激素介质，成本较低，无需再生成完整的植物21，和相对高的二次代谢物的产量相比，从起始植物材料31。这些根也可以从原来的外植中分离出来，以建立长期、稳定且具有特征的根克隆，保持其生物合成能力和表型。总之，基于这些发现，该协议提供了一种快速、独特和有效的方法，以产生转化的毛根，以研究二次代谢物的产生，并为其他植物的毛根诱导提供了参考。然而，探索毛根培养产生大量生物活性化合物产量的潜力取决于适当的生物反应器系统，其中某些参数，如氧气供应必须涉及44，8。8该协议仅限于在毛状根中衍生的二次代谢物的产生，并研究功能基因的可视化表型，如颜色的方差和次生代谢物的含量;然而，在这项研究中无法评估整个植物的皮象变化，而不管从毛根获得再生的植物。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作得到了中央公益性研究机构ZXKT17002基础研究基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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