Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحريض جذور شعر من قبل Agrobacterium rhizogenes-بوساطة التحول في الحنطة السوداء التارتية(Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60828
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 4, 1, 3, 5, 1, 1,2
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

Summary

نحن نصف طريقة لتحفيز جذور شعر من قبل Agrobacterium rhizogenes-بوساطة التحول في الحنطة السوداء Tartary(Fagopyrum tataricum). ويمكن استخدام هذا للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي في الحنطة السوداء الطرطرية، أو اعتمادها لأي تحول وراثي، أو استخدامها للنباتات الطبية الأخرى بعد التحسين.

Abstract

الحنطة السوداء الطرتارية (السل)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] تمتلك مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية لأنه يحتوي على الأيض الثانوية وفيرة مثل الفلافونويدات، وخاصة روتين. وقد استخدمت الجذور الزراعية البكتريا تدريجيا في جميع أنحاء العالم للحث على جذور شعر في النباتات الطبية للتحقيق في وظائف الجينات وزيادة غلة الأيض الثانوية. في هذه الدراسة، وصفنا طريقة مفصلة لتوليد جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتفي السل. تم اختيار Cotyledons ومحور تحت تأثير الحمل في 7-10 أيام كنباتات خارجية ومصابة بـ A. rhizogenes تحمل ناقلًا ثنائيًا ، مما أدى إلى جذور شعر ية مُرعرة مُرقدة ظهرت بعد أسبوع واحد. تم تحديد التحول الجذر المشعر المتولد على أساس مورفولوجيا، واختيار المقاومة (kanamycin)، والتعبير الجيني المراسل (بروتين الفلورسنت الأخضر). في وقت لاحق، تم نشر الجذور المشعرة المتحولة ذاتيا على النحو المطلوب. وفي الوقت نفسه، تم تحويل عامل النسخ mymyB116، إلى الجينوم السل باستخدام جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتللتحقق من دور FtMYB116 في توليف الفلافونويدات. وأظهرت النتائج أن التعبير عن الجينات ذات الصلة بالفلافونويد وغلة مركبات الفلافونويد (الروتين والكيرسيتين) كانت بشكل كبير (p < 0.01) التي روجت لها FtMYB116، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام جذور مشعرة بوساطة الرهيزوجيناتكأداة بديلة فعالة للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي. يمكن اعتماد البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة الموصوفة في هذه الدراسة لتوليد جذور شعر لأي تحول وراثي أو غيرها من النباتات الطبية بعد التعديل.

Introduction

الحنطة السوداء الطرتاري (السل)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) هو نوع من dicotyledon ينتمي إلى جنس Fagopyrum والأسرة Polygonaceae1. ويحظى السل، بوصفه نوعاً من الأغذية المتجانسة للطب الصيني، باهتمام كبير بسبب تكوينه الكيميائي المميز وأنشطته البيولوجية المتنوعة ضد الأمراض. السل غني في المقام الأول بالكربوهيدرات والبروتينات والفيتامينات والكاروتينات وكذلك في البوليفينول مثل الأحماض الفينولية والفلافونويدات1. وقد أظهرت مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية من الفلافونويدات، بما في ذلك مضادات الأكسدة، خافض للضغط2،والمضادة للالتهابات، فضلا عن خصائص مضادة للسرطان ومضادة للسكري،3.

Agrobacterium rhizogenes هي بكتيريا التربة التي تساهم في تطوير مرض الجذر شعر في العديد من النباتات أعلى، وخاصة dicotyledons، عن طريق إصابة مواقع الجرح4،,5. هذه العملية بدأت من خلال نقل T-DNA في الجذر تحريض (Ri) plasmid5،6 وعادة ما يرافقه التكامل والتعبير عن الجينات الخارجية من البلازميد ري والخطوات اللاحقة لتوليد الورم الجذر شعر7. A. جذور رهيزوجيناتمجففة بوساطة، كأداة قوية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية، وقد استخدمت على نطاق واسع نظرا لإنتاجيتها مستقرة وعالية وسهولة الحصول عليها في فترة قصيرة. وعلاوة على ذلك، يتم تمييز الجذور شعر الناجمة عن A. رهيزوجينات بكفاءة من خلال تطوير جذر plagiotropic والنمو المتفرعة للغاية في متوسطة خالية من الهرمونات8. ويمكن استخدامها في عدة مجالات من البحوث، بما في ذلك إنتاج البذور الاصطناعية، وبحوث العقيدات الجذرية، وفي دراسة التفاعلات مع الكائنات الحية الأخرى مثل الفطريات mycorrhizal، والديدان الخيطية، ومسببات الأمراض الجذرية7،9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ثقافات تحويل الجذر المشعرة على نطاق واسع كنظام تجريبي للتحقيق في المسارات الكيميائية الحيوية والإشارات الكيميائية وإنتاج الأيض الثانوية النباتية التي تستخدم كمستحضرات صيدلانية ومستحضرات تجميل وإضافات غذائية8،10. وقد تم التحقيق في الأيض الثانوية القيمة، بما في ذلك قلويدات الإندول، aconites، قلويدات التروبان، تيربينويدس، والفلافونويدات، توليفها في جذور شعر البرية من نوع لعدة عقود في العديد من الأنواع، مثل الجنسينوسيد في باناكس الجينسنغ11،الكوممارين في أمي ماجوس12،والمركبات الفينولية في السل2،,13.

وقد تم إنتاج جذور شعر باستخدام A. rhizogenes في 79 نوعا من النباتات من 27 أسرة14. على سبيل المثال، A. رهيزوجينات-بوساطةتحول الجذر شعر تم الإبلاغ في فول الصويا15،,16، سالفا17، Plumbago indica18،لوتس japonicus19،والهندباء(Cichorium intybus L.) 20. السل مشعر الجذر التحول كما تم التحقيق2. عدد قليل من البروتوكولات التفصيلية المتاحة بشأن تطوير جذور شعر بوساطة A. rhizogenes إما تحمل ناقل ثنائي أم لا. فعلى سبيل المثال، أدخلت ساندرا وآخرون21 طريقة لإنتاج جذور شعر بطاطا معدلة وراثياً مستدامة في براعم برية من النوع. يمكن تصور الجذور المشعرة المتطورة بالكامل بعد 5-6 أسابيع من حقن A. rhizogenes تحمل جين مراسل جوس في الإنترنودس الجذعية لنباتات البطاطا. كما أفادت دراسة أخرى نظام الجذر المشعر المعدلة وراثيا الناجمة عن A. rhizogenes إيواء جين مراسل gusA في الجوت(Corchorus capsularis L.) 22.وعلاوة على ذلك، حصل Supaart وآخرون23 على جذور مشعرة للتبغ المحورة وراثيا باستخدام A. rhizogenes تحولت مع التعبير ناقلات pBI121 تحمل جين منحمضرباعي هيدروكانابينوليك (THCA) synthase لإنتاج THCA.

ومع ذلك، فإن العملية التدريجية لتوليد فعال من التحول الجذري المشعر، وخاصة في مجال السل، كانت أقل وضوحاً نسبياً. في هذه الدراسة ، وصفنا بروتوكولًا مفصلًا باستخدام A. rhizogenes الذي يحمل جين المراسل(GFP)، وهو علامة انتقائية(Kan)، وجينًا مهمًا (b4) ، وهو جين محدد من مجموعتنا ولكنه غير منشور من حلزون حلقة أساسية(bHLH)الأسرة) لتوليد التحول الوراثي الجذر المشعر في السل. استمرت التجربة لمدة 5-6 أسابيع ، من تلقيح البذور إلى توليد الجذور المشعرة ، والتي تنطوي على إعداد النبزة ، والعدوى ، والتعبد ، والتبوّاب ، والانتشار اللاحق. وعلاوة على ذلك، تم استخدام A. rhizogenes التي تحتوي على البلازميد ثنائي يحمل transgene السل من عامل النسخ النخاعي 116(FtMYB116)لتحديد ما إذا كان FtMYB116 يمكن أن تعزز تراكم الفلافونويدات، وخاصة الروتين، في السل في الجين ومستوى التمثيل الغذائي من خلال التحول الجذر شعر السل. FtMYB116، وهو عامل النسخ الناجم عن الضوء ، وينظم توليف روتين تحت ظروف الإضاءة المختلفة5. Chalcone synthase(CHS)، فلافانون -3 - هيدروكسيلاز(F3H)، فلافونويد -3 '-هيدروكسيلاز(F3'H)، والفلافونول synthase(FLS)24 هي الإنزيمات الرئيسية المشاركة في المسار الأيضي لعملية التركيب الحيوي روتين. لذلك ، توضح هذه الدراسة التعبير المفرط لـ FtMYB116 في جذور TB المشعرة والتعبير عن جينات الإنزيم الرئيسية وكذلك محتوى الروتين والفلافونويدات الأخرى مثل الكيرسيتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

السل المستخدمة في هذه الدراسة كان اسمه BT18 ، والتي نشأت من سلالة "JinQiao No.2" المزروعة من قبل مركز بحوث الحبوب الصغيرة المتنوعة من أكاديمية شانشي للعلوم الزراعية. يتم توضيح الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول في الشكل 1.

ملاحظة: تشغيل التلاعب المتعلقة بالنباتات الخارجية بسرعة، وعندما يكون ذلك ممكنا، والحفاظ على أطباق بيتري مغلقة لتجنب الذبول والتلوث. ما لم ينص على خلاف ذلك، أجريت جميع الحاضنات explant تحت شرط ضوء 14-ح و10-ح فترة ضوئية داكنة في 25 درجة مئوية. ما لم ينص على خلاف ذلك، تم إجراء جميع العمليات المتعلقة بالنباتات السابقة أو البكتيريا في ظروف معقمة في غطاء تدفق لامينار. يتم توفير جميع المكونات الإعلامية لـ A. rhizogenes والثقافات النباتية في المختبر في الجدول 1. بعد ضبط درجة الحموضة ، تم ضبط جميع الوسائط في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم إعداد الوسائط الصلبة عن طريق ملء 25 مل من المتوسط في طبق بيتري قطره 9 سم والسماح لها بترسيخ.

تنبيه: إيداع جميع البكتيريا والنباتات المعدلة وراثيا في حاوية النفايات المناسبة. تشغيل جميع المواد الكيميائية الخطرة في خزانة أبخرة وإيداعها في حاوية النفايات الخطرة.

1- إعداد القابلات المسببة للسل

  1. إعداد بذور السل
    1. حدد بذور السل الممتلئة وغير التالفة(الشكل 1A1)التي تم الحفاظ عليها عند درجة حرارة أقل من −20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن عامين.
    2. نقع البذور في الماء في 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا بحيث يمكن بسهولة تقشير معطف البذور قبالة(الشكل 1A2). إذا لزم الأمر، استخدم مقص لقطع فتحة على البذور لتسهيل تقشير.
  2. تعقيم بذور السل
    1. ضع 100-200 بذور مقشرة في قارورة مخروطية معقمة 100 مل.
    2. تطهير البذور باستخدام الإيثانول 75٪ لمدة 30 s.
    3. استبدال الإيثانول مع 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم وتطهير لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام التطهير باستخدام ثنائي كلوريد الزئبق بتركيز 1 غرام/لتر لمدة 8 سنوات كمقمّقم بديل ليحل محل هيبوكلوريت الصوديوم في أي حالة من حالات التعقيم غير الكافي.
      تنبيه: ثنائي كلوريد الزئبق خطير وليس مادة صديقة للبيئة. تشغيله في خزانة fuming وإيداعه في حاوية النفايات الخطرة، إذا تم استخدام ثنائي كلوريد الزئبق في أي حال.
    4. صب هيبوكلوريت الصوديوم.
    5. غسل البذور باستخدام الماء المعقم deionized 5 مرات.
    6. لطخة البذور الجافة مع ورقة ثنائية العقيمة.
  3. إعداد شتلات السل
    1. إعداد 50 مل موراشيج وSkoog (MS) المتوسطة القاعدية (1962) تستكمل مع 30 غرام / لتر السكروز و 7 ز / لتر مسحوق أجار (MSSA)(الجدول 1)في زجاجة زراعة الأنسجة النباتية 300 مل.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 قبل التعقيم.
    3. توزيع 10 بذور بالتساوي لكل زجاجة من متوسطة MSSA.
    4. تنبت البذور في غرفة الثقافة في 25 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية تحت شرط الضوء لمدة 7-10 أيام.
  4. إعداد النباتات المعقمة
    1. حدد شتلات قوية من السل(الشكل 1C)،عندما تتكشف 2 قطعة من cotyledons.
    2. قطع الشتلات من الجذور(الشكل 1C أحمر اندفاعة رؤوس الأسهم)،وتجنب الاتصال مع المتوسطة.
    3. وضعها في طبق بيتري معقم.
    4. قطع يبوكوتل إلى شرائح 0.8-1 سم، وقص cotyledons إلى قطع 0.5 سم تقريبا.
    5. قبل زراعة هذه explants على MSSA المتوسطة تحت شرط الضوء لمدة 24 ساعة.
    6. نقلها إلى قارورة مخروطية 100 مل معقم، والتي هي الآن جاهزة للعدوى.

2. إعداد A. رهيزوجينات للتحول

ملاحظة: تم توفير سلالة A. rhizogenes ACCC10060 من قبل معهد تطوير النباتات الطبية والحفاظ عليها عند −80 درجة مئوية. A. تم تحويل رهيزوجينات مع ناقل ثنائي pK7GWIWG2D (II) التي تؤوي T-DNA تحمل الجين B4 المصاحبة GFP كجين مؤشر والجينات المقاومة كان كعلامة يمكن اختيارها. الجين b4 هو عضو في الأسرة bHLH عامل النسخ, التي لم تنشر بعد. لتقييم إمكانات جذور السل المشعرة، تم تحويل A. rhizogenes مع الناقل الثنائي pK7WG2D الذي يحتوي على جين MYB116 للتحقيق في تأثيره على إنتاج الأيض الثانوي مثل الفلافونويدات على مستوى التعبير الجيني والتحليلات الأيضية. تنشيط A. يجب أن تكون مستعدة جيدا في نفس الوقت مع explants.

  1. تفعيل A. رهيزوجينات
    1. ذوبان الريزوجينات A. على الجليد
    2. تراجع البكتيريا وخط لهم بالتساوي على الخميرة مانيتول المتوسطة (YEB) تستكمل مع 15 غ / لتر مسحوق أجار, 50 ملغ / لتر ريفامبيسين, و 50 ملغ / لتر spectinomycin (YEBARS, درجة الحموضة 7.0).
    3. احتضان البكتيريا في 28 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
    4. اختيار مستعمرة أحادية النسيلة والثقافة في طبق آخر بيتري في نفس الطريقة المذكورة أعلاه.
    5. حدد المستعمرات أحادية النسيلة والثقافة لهم في قارورة مخروطية معقمة 100 مل تحتوي على 20 مل من متوسطة YEB تكملها مع 50 ملغ / لتر ريفامبيسين و 50 ملغ / لتر spectinomycin (YEBRS، درجة الحموضة 7.0) في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة حتى قيمة OD600 تصل إلى 2.0.
    6. احتضان 2٪ -4٪ من الثقافة المذكورة أعلاه في قارورة مخروطية أخرى 100 مل تحتوي على 20 مل من وسط YEBRS عند 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 4-5 ساعة حتى تصل قيمة OD600 إلى حوالي 0.5(الشكل 1D).

3- العدوى بالنباتات المسببة للسل وفحصها

ملاحظة: الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على جذور مشعرة متحولة وراثيا. تم استخدام الجذور البرية كتحكم سلبي لتقييم التعبير المعدل وراثيا. في هذا البروتوكول، تم تحويل A. rhizogenes مع ناقلات ثنائية إما pK7WG2D تحمل جين FtMYB116 أو pK7GWIWG2D (II) تحمل جين B4 مقدما.

  1. إعادة تعليق A. رهيزوجينات
    1. نقل الثقافة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1.6 إلى أنبوب طارد ة بالسيارة معقم 50 مل.
    2. تدور في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية.
    3. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه البكتيرية مع MS المتوسطة تستكمل مع 30 غرام / لتر السكروز و 300 ميكرومتر acetosyringone (AS) (MSSAS، درجة الحموضة 5.8) إلى OD600 × 0.2.
  2. عدوى النباتات الخارجية
    1. غرس التعليق البكتيري الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.1.3 في قارورة مخروطية تحتوي على النباتات الجاهزة المعدة في الخطوة 1.4.6 لمدة 10 دقيقة(الشكل 1E).
    2. إخراج explants، ولطخة لهم الجافة باستخدام ورقة bibulous معقمة.

4. الزراعة المشتركة للنباتات مع A. rhizogenes

  1. ضع ورق فلتر معقم قطره 9 سم على متوسط MS ، والذي يتم ترسيخه باستخدام مسحوق أجار 7 جرام / لتر مُكمل بـ 30 جرام / لتر من السكروز و 100 ميكرومتر AS (MSSAAS متوسط ، درجة الحموضة 5.2).
  2. تراكب explants على ورقة تصفية في 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام في الظلام(الشكل 1F).

5- الثقافة التعريفية والانتقائية

  1. ضع ما يقرب من 20 من النباتات المصابة على متوسطة MSSA المكملة بـ 500 ملغم/لتر من التشيفوتتاكسي و50 ملغم/لتر كاناميسين (كان) (MSSACK، درجة الحموضة 5.8)(الشكل 1G).
  2. احتضانها عموديا تحت حالة الضوء عند 25 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية. تحدث الجذور المشعرة بعد أسبوع واحد تقريبًا من الحضانة(تشيررؤوس الأسهم السوداء ذات الاندفاعة السوداء الشكل 1H إلى حدوث جذور شعرية).
    ملاحظة: استبدال MSSACK المتوسطة كل 15 يوما إذا لزم الأمر.

6. subculturing جذور السل شعر

ملاحظة: يهدف هذا الإجراء إلى حصاد جذور شعر قوية. مراقبة نمو الجذور المشعرة بانتظام أثناء الانتشار ، وإزالة تلك الملوثة والمنشطة في الوقت المناسب. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات التالية لنشر المزيد من الجذور المشعرة. يستغرق ما يقرب من 10-14 يوما من subculturing إلى الحصاد.

  1. حدد الجذور شعر تظهر مظهر الأبيض والنمو السريع.
  2. قطع لهم إلى قطع من 2-3 سم.
  3. من الواضح أن رقم لهم على مقاعد البدلاء نظيفة.
  4. الثقافة الفرعية لهم في قارورة مخروطية 100 مل معقم تحتوي على 5 مل من متوسطة MS تكملها مع 30 غرام / لتر السكروز و 50 ملغ / لتر كان (MSSK، درجة الحموضة 5.8) بسرعة دوارة من 80 دورة في الدقيقة في 25 درجة مئوية في الظلام حتى أنها مبالغفيها إلى الجزء السفلي من القارورة(الشكل 1I).

7- تحديد الجذور المشعرة المتحولة والحفاظ عليها

ملاحظة: يمكن تحديد الجذور المشعرة المتحولة استنادًا إلى جوانب المورفولوجيا ومستوى الجينات. ويمكن أيضا أن يتم تحديد وفقا لالجينوم الجذر شعر والمقاومة، والتي لا تغطيها في هذا البروتوكول. يركز هذا الإجراء في المقام الأول على الجينات المراسلة وتحديد الجينات المستهدفة.

  1. إزالة التوني والجذور المشعرة الملوثة واختيار تلك مع مظهر أبيض.
  2. تقييم ما إذا كان هناك الفلورة الخضراء تحت الأزرق / الضوء المزدوج فوق البنفسجي ة transilluminator.
  3. حدد الجذور المشعرة التي تظهر إشارة فلورية قوية في الأنابيب مرقمة أو ملفوفة باستخدام tinfoil ملحوظ بعد تجفيفها بورقة ماصة.
  4. Lyophilize لهم في النيتروجين السائل، تليها تخزين كل الحصاد في −80 درجة مئوية لمزيد من التحقيق.
  5. التعرف الجيني
    1. ثلاثية 0.1 غرام من الجذور المشعرة إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل.
    2. إعداد الحمض النووي الجينومي للخطوط المعدلة وراثيا مستقلة من السل باستخدام تعديل cetyltrimethylammonium بروميد الأسلوب25 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمصنع الجينوم ية DNA عدة.
    3. تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام 100 نانوغرام من قالب الحمض النووي الجينومي والتمهيديات المدرجة في الجدول 2.
    4. أداء دورة التضخيم على النحو التالي: predenaturation في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة، التطهر في 94 درجة مئوية لمدة 30 ث، التمهيدي الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ث، وتمديد التمهيدي في 72 درجة مئوية لمدة 30 ث. بعد 36 دورة وخطوة تمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وتحليل منتجات التضخيم على 1٪ المواد الهلامية أغاروز.
    5. الطخ المواد الهلامية بتلطيخ الحمض النووي وتصورها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Agrobacterium rhizogenesبوساطة السل تحويل الجذر شعر
تصف هذه الدراسة البروتوكول خطوة بخطوة التي أنشئت للحصول على جذور شعر متحولة وراثيا باستخدام A. rhizogenes. استغرق الأمر ما يقرب من 5-6 أسابيع من تلقيح بذور السل إلى حصاد الجذور المشعرة المحددة ، ويتم تصوير بعض الخطوات الرئيسية في الشكل 1 (A-H). لفترة وجيزة، تم تلقيح البذور المعقمة قصفت(الشكل 1B)لتحقيق الإنبات المعقمة أسرع. A. يجب تنشيط rhizogenes (الشكل 1D)والنباتات المعقمة وإعدادها مقدما، على التوالي. ويتبع ذلك بعض الخطوات الرئيسية، بما في ذلك عدوى النباتات الجديدة مع تنشيط A. rhizogenes (الشكل 1E)،والثقافة المشتركة(الشكل 1F)،والثقافة الانتقائية(الشكل 1G). وينبغي وضع النباتات المصابة بالتساوي على وسط التصلب المتعدد المتين ويجب الحفاظ على الفضاء بينها لفصل الخطوط المعدلة وراثياً المختلفة بسهولة. جذور شعر تظهر مع لون أبيض رقيق بطريقة plagiotropic في مواقع الجرح من explants(الشكل 1H). الجذور شعر تشكل مصفوفة متفرعة للغاية ومتشابكة ويمكن نشرها على النحو المطلوب(الشكل 1I). يمكن استخدام الجذور المشعرة التي تم حصادها للتحقيق في وظيفة الجينات أو التفاعل بين الجينات والبروتين والبروتين. وبدلاً من ذلك، يمكن نشر جذور السل المشعرة على نطاق واسع لإنتاج مستقلبات ثانوية مثل الروتين في المفاعلات الحيوية المعينة.

وقد تم إثبات طريقة للحث على جذور مشعرة معدلة وراثيا في السل باستخدام ناقل ثنائي(pK7GWIWG2D (II) )يحمل جينات GFP و B4 (عضو في العامل النسخي bHLH الأسرة، لم تنشر بعد). تم استخدام جين المراسل GFP لتمييز الجذور المشعرة المعدلة وراثيا بسهولة عن تلك غير المحورة عن طريق تصور الإشارة تحت زرقاء / ضوء الأشعة فوق البنفسجية المزدوجة transilluminator(الشكل 2)أو عن طريق تحديد الجين المستهدف(الشكل 3). أظهرت الجذور المشعرة المتحولة مضان أخضر عندما أضاءت تحت الضوء الأزرق أو فوق البنفسجي (ممثلة باستخدام رؤوس الأسهم السوداء في الشكل 2A)، في حين أن الجذور المشعرة غير المحولة لم تظهر الفلورية الخضراء(الشكل 2B). تم نشر الجذور المشعرة مع إشارة GFP عالية لمدة أسبوعين ، كما هو موضح في الشكل 2C.

ولمزيد من التحديد ما إذا كان الناقل الثنائي قد تم تحويله بنجاح إلى جينوم السل، أجريت عمليات تحديد الجينات. باختصار ، تم إعداد الحمض النووي الجينومي النباتي للجذور المشعرة للسل لتحليل PCR استنادًا إلى طريقة CTAB المعدلة25. تم إجراء PCR عن طريق تضخيم الجينات(كان، GFP، و B4)، والتي كانت موجودة في الشكل 3، على التوالي. يتم سرد الالتمهيديفي الجدول 2. وأشار وجود الجينات الثلاثة في جميع الخطوط المحورة وراثياً(الشكل 3،الممرات 5-11)إلى أن المتجه الثنائي قد تحول بنجاح إلى جينوم السل. كان كان وGFP غائبين في الجذور البرية من النوع(الشكل 3، حارة 3)والتحكم السلبي التجريبي(الشكل 3، حارة4)، في حين تم الكشف عن B4 في الجذور البرية من النوع. هذه الجينات 3 قدمت بلا شك في السيطرة الإيجابية(الشكل 3، حارة 2)ولكن كانت غائبة على ما يبدو في السيطرة السلبية(الشكل 3، حارة4).

تقييم عامل النسخ الناجم عن الضوء FtMYB116 في السل باستخدام نظام الجذر المشعر المذكور أعلاه
وأعرب عن FtMYB116 من خلال توظيف بروتوكول المذكورة أعلاه من الحث الجذر شعر. وقد تم تحقيق ذلك عن طريق إدخال الجين FtMYB116 في الناقل الثنائي pK7WG2D ومن ثم إصابة مع A. rhizogenes لتحقيق فرط التعبير الجيني. لفترة وجيزة، كانت جذور شعر 0.1 غرام triturated إلى مسحوق ناعم باستخدام النيتروجين السائل. تم استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي باتباع تعليمات الشركة المصنعة للمصنع الجيش الملكي النيبالي مجموعة العزل26. ثم تم إجراء النسخ العكسي PCR وPCR في الوقت الحقيقي لتضخيم FtMYB116 وروتين توليف مسار الجينات ذات الصلة. في وقت لاحق تم التحقق من الآثار التنظيمية لFtMYB116 على التعبير الجيني المتعلق بتوليف الرروتين وغلة الروتين.

يوضح الشكل 4A التعبير النسبي لـ FtMYB116 في الخطوط المعدلة وراثياً للجذور المشعرة بالسل. بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهر التعبير النسبي لـ FtMYB116 زيادة كبيرة في جميع الخطوط المعدلة وراثيا المستقلة 3. يوضح الشكل 4B والشكل 4C تعزيز التركيب الحيوي للروتين والكيرسيتين على مستوى التمثيل الغذائي من خلال فرط التعبير عن FtMYB116. وكانت محتويات روتين وكيرسيتين في المعدلة وراثيا بشكل ملحوظ(ف < 0.01) زيادة مقارنة مع تلك الموجودة في النوع البري، لتصل إلى 40 و 0.5 ملغ / غرام من FW، على التوالي، والتي كانت 8 أضعاف تلك الموجودة في النوع البري. كانت التعبيرات الجينية النسبية لـ CHSو F3Hو F3'Hو FLS في جميع الخطوط المعدلة وراثياً 3 أعلى بشكل ملحوظ من تلك الموجودة في مجموعة التحكم(الشكل 4D). معا، أكدت هذه النتائج أن الاستراتيجية الموصوفة في هذه الدراسة يمكن استخدامها بنجاح لتوليد تحول الجذر شعر في السل والتحقيق في التعبير الجيني والغلة الأيضية من الأيض الثانوية.

Figure 1
الشكل 1: عمليات للحث على جذور مشعرة معدلة وراثيابوساطة A. رهيزوجيناتفي السل. يتم عرض الصور التمثيلية للمراحل الحرجة:(A1)و(A2)تمثل قبل وبعد تقشير معاطف البذور. (ب)يمثل كل 10 بذور تلقيح في زجاجة الأنسجة التي تحتوي على وسيط MSSA؛ (ج)يدل على شتلات السل في 7-10 أيام بعد التطعيم، ورؤوس الأسهم الحمراء اندفاعة تظهر نقاط القطع؛ (D)و(E)تشير إلى إعداد A. rhizogenes (OD600 = 0.5) وعدوى النباتات، على التوالي؛ (F)و(G)ترمز إلى التثاق مع تنشيط A. rhizogenes على MSSAAS التهيئة المتوسطة والانتقائية على MSSACK المتوسطة، على التوالي؛ جذور شعر الخروج من(H)، كما هو مبين من قبل رؤوس الأسهم السوداء اندفاعة ؛ و(أنا)يظهر انتشار تكوين الجذر شعر؛ تشير رؤوس الأسهم السوداء المتقطعة إلى الجذور المُشعرة المستحثة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحويل المتجه الثنائي الذي يحمل جين مراسل GFP. (أ)يدل على الجذور المشعرة المستحثة بعد الثقافة الانتقائية التي تم فحصها تحت الضوء الأزرق / الخفيف المزدوج فوق البنفسجي. (B)و(C)تمثل الجذر البرية من نوع وانتشار الجذور المشعرة المتحولة، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تضخيم PCR للجينات(Kan, GFP,و B4)من الحمض النووي الجينومي المعزول عن الجذر البري والجذور المشعرة للسل في 7 خطوط معدلة وراثياً مستقلة. (أ):كان،(ب):GFP،(C):b4. حارة 1: علامات الحجم الجزيئي (رأس السهم الأبيض يشير إلى 750 نقطة أساس)، حارة 2: plasmid (ثنائي ناقلات pK7GWIWG2D (الثاني) تحمل كان، GFP،والجينات b4) كما السيطرة الإيجابية، حارة 3: الجذر البرية من نوع، حارة 4: تنقية H2O كتحكم سلبي، والممرات 5-11: خطوط المعدلة وراثيا المستقلة 7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التعبير النسبي لـ FtMYB116 في الخطوط المعدلة وراثياً للجذور المشعرة بالسل. (أ)والتأثير الترويجي للتعبير المفرط لـ FtMYB116 على التركيب الحيوي لـ (B) روتين و(C)كيرسيتين (تم تعديل هذا الرقم من Dong et al.5). أجريت التجارب في ثلاث مرات وأجريت 3 مرات. "**" يشير إلى فرق كبير في p < 0.01 باستخدام الطالب تي-اختبار. (د)التعبير عن الجينات المتعلقة مسارات تخليق الفلافونويد في الخطوط المعدلة وراثيا. تم تطبيع مستوى التعبير النسبي إلى مستوى التحكم في actin. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وسائل الاعلام مكونات متوسطة
MSSA وسيط Murashige و Skoog (MS) يحتوي على السكروز في 30 غرام / لتر ، ومسحوق أجار في 7 غرام / لتر ، درجة الحموضة 5.8
يبرس الخميرة مانيتول المتوسطة (YEB) التي تحتوي على مسحوق أجار في 15 غ / لتر، ريفامبيسين في 50 ملغ / لتر، وspectinomycin في 50 ملغ / لتر، درجة الحموضة 7.0
YEBRS YEB تحتوي على ريفامبيسين في 50 ملغ / لتر، وspectinomycin في 50 ملغ / لتر، درجة الحموضة 7.0
MSSAS MS المتوسطة التي تحتوي على السكروز في 30 غرام / لتر، وacetosyringone (AS) في 300 ميكرومتر، درجة الحموضة 5.8
MSSAA MS المتوسطة التي تحتوي على السكروز في 30 غرام / لتر، مسحوق أجار في 7g/L، وAS في 100μM، درجة الحموضة 5.2
MSSACK MS المتوسطة التي تحتوي على السكروز في 30 غرام / لتر، مسحوق أجار في 7 غرام / لتر، cefotaxime في 500 ملغ / لتر، وكاناميسين (كان) في 50 ملغ / لتر، درجة الحموضة 5.8
MSSK MS المتوسطة التي تحتوي على السكروز في 30 غرام / لتر، وكان في 50 ملغ / لتر، درجة الحموضة 5.8

الجدول 1: وسائط الإعلام ومكوناتها.

التمهيدي تسلسل (5'-3')
GFP-F CCACAAGTTCAGGTGTCCG
GFP-R AAGTTCACCTCTGTGCCGTTC
b4-F AAATCTTTCCCTGTGG
b4-R ATGCCATCATTGCCAAG
كان-ف ATTCGGCTATGACTGGGCAC
كان آر TGAATCCAGAAAAGCGGCCA

الجدول 2: تسلسل التمهيدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدم السل في العديد من الدراسات المتعلقة بالأيض الثانوي على المستويات الوراثية والأيضية1،2،5،,27،28. ثقافة الجذر شعر، كمصدر فريد لإنتاج المستقلب، يلعب دورا محوريا في الهندسة الأيضية29 ويمكن استخدامها لتغيير المسارات الأيضية عن طريق إدراج الجينات ذات الصلة. كيم وآخرون2 في البداية إدخال إنشاء الثقافات الجذرية شعر السل من قبل A. rhizogenesبوساطة التحول لتحقيق إنتاج المركبات الفينولية. وكان محتوى الروتين الذي حصلوا عليه في جذور السل المشعرة أعلى بعشر مرات من المحتوى الموجود في الجذور البرية. في هذه الدراسة، أدى إدخال FtMYB116 إلى تعبير أعلى عن الجينات ذات الصلة بالروتين وارتفع إنتاج الروتين في جذور السل المشعرة. وقد تم تأكيد هذه التقنية لتكون ملائمة لتوصيف phenotypic والتعبير عن الجينات ذات الصلة الفينيل بروبانويد مثل FtF3H وFtFLS في جذور السل شعر5،30،31. استخدم Zhang et al.32 جذور ًا مشعرة بالسل للتحقيق في إنتاج الروتين من خلال التعبير المفرط عن سلسلة من العوامل النسخة FtMYB. ولاحظ تشو وآخرون33 انخفاضاً في محتوى الروتين بسبب فرط تعبير FtMYB11 في جذور السل المشعرة. تشير هذه النتائج إلى جانب النتائج التي توصلنا إليها إلى الآثار الممكنة للتحول الجذري المشعر على التفاعل بين العوامل النسخية FtMYB والجينات المتعلقة بالتركيب الحيوي للروتين.

على الرغم من وجود بيانات محدودة فيما يتعلق ببروتوكول خطوة بخطوة لتحريض جذور السل المشعرة، فإننا نصف هنا البروتوكول خطوة بخطوة لأول مرة للحصول على جذور مشعرة للسل معدلة وراثياً بطريقة فعالة ومستقرة باستخدام A. rhizogenes تحمل ناقل ثنائي. خلال هذه العمليات التجريبية ، يجب النظر في العديد من العوامل بعناية للحصول على الجذور المُستحثة المثلى. أولاً، إن اختيار النباتات الخارجية هو عامل حاسم. ومن المعروف أن أصناف السل تؤثر على مورفولوجيا الجذور المشعرة وإنتاج المركبات الفينولية. وأوضح ثوي وآخرون30 أن التعبير الجيني في مسار الفينيل بروبانويد التركيب البيولوجي ومحتويات المركبات الفينولية تختلف بين أصناف السل. كما وجدوا جذور شعر في صنف واحد ، والذي كان عميق المحمر الأرجواني بسبب محتوى الأنثوسيانين13. في دراستنا، تم اختيار 2 الكوتيلون اتضحت للتو وhypocotyls كما explants. وذلك لأن الشباب والأوراق العطاء صالح معدل تحريض جذر شعر عالية2،30، في حين أن الخلايا النباتية المتمايزة للغاية والقديمة تؤثر سلبا على الحث الجذر شعر. ثانيا، سلالة من أ. رهيزوجينات له تأثير كبير على تحريض الجذر شعر. سلالات بكتيرية مختلفة تظهر قدرات تحويل مختلفة من حيث مورفولوجياس وكفاءة التعريفي من جذور شعر، والتي يمكن أن تكون مضيئة من قبل البلازميدات المختلفة التي تؤويها سلالات34. أي وآخرون35 مقارنة آثار العديد من سلالات A. رهيزوجينات (R1000، R1200، 15834، LBA9402، و A4) على الحث على جذور السل شعر والفينيل بروبانويد الحيوي ووجدت أن السلالة الأكثر واعدة لإنتاج الجذر شعر في السل كان R1000. وقد أيد هذه النتيجة كيم وآخرون2 ومع ذلك، فإن سلالة ACCC10060 التي تم استبعادها في دراسة آي وآخرون ولكن ها هو في دراستنا أظهرت كفاءة مرضية العدوى. مظهر أبيض رقيق من جذور شعر التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول لدينا هو في الاتفاق مع جذور شعر ولدت في سالفا miltiorrhiza36، حيث نفس سلالة ACCC10060 تحمل ناقلات ثنائية pK7GWIWG2D (الثاني) كان يستخدم لإسكات الجين المستهدف. ثالثا، إزالة الجراثيم بما في ذلك المعالجة المسبقة للمواد وتركيز cefotaxime في الثقافة الانتقائية تلعب أيضا أدوارا حيوية في تحريض الجذر شعر. يمكن أن يؤدي التطهير غير الكامل في أي خطوة إلى فشل تحويل الجذر المشعر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التركيز البكتيري له تأثير كبير على إنتاج الجذور المتحولة. قد تقلل التركيزات العالية من الخلايا النباتية عن طريق تثبيط تنافسي ، في حين أن التركيزات المنخفضة قد تسبب انخفاض التوافر4.

وعلاوة على ذلك، فإن الظروف الثقافية مثل متوسط النمو، والوقت المناسب قبل الاستزراع وcoculturing، وغيرها من العوامل الحيوية أو اللاأحيائية تلعب دورا هاما في الحث الجذر شعر. وأوصى هوانغ وآخرون37 بـ 1/2 MS المتوسطة التي تحتوي على السكروز بتركيز 30 غرام/لتر للزراعة المشتركة لتحقيق أقصى قدر من الجذور المشعرة بالسل. ويمكن تفسير ذلك من خلال وسط الملح عالية التي هي مناسبة لتشكيل الجذر شعر، في حين أن متوسط الملح المنخفض تفضل الضرب البكتيري المفرط34. AS هو نوع من المركبات الفينولية التي يمكن أن تسهل A. rhizogenesبوساطة التحول في عدد من الأنواع النباتية عن طريق النسخ من منطقة فير من Agrobacterium34،38، ويمكن أن يكون فير المستحثة بشكل فعال في وسط مع درجة الحموضة من < 5.739،40. ولذلك، نوصي متوسطة الاستزراع المشترك مع درجة الحموضة 5.2 تستكمل مع 100 ميكرومتر من AS. وأفاد هوانغ وآخرون37 بأن جذور السل المشعرة تحولت إلى اللون البني بعد اليوم الرابع والعشرين من اللون الأبيض والأصفر الشاحب. ولذلك، فإنها ثقافة فرعية جذور شعر كل 24 يوما. ومع ذلك، نوصي subculturing كل أسبوعين لتجنب براوننج من جذور شعر. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن الظروف البيئية مثل الضوء والهرمونات ودرجة الحرارة والأشعة فوق البنفسجية تؤثر على التعبير عن الجينات المتعلقة بالفلافونويد الحيوي عن طريق نقل الإشارات المحفزة للغاية أو المحبطة41،42. وقد أظهرت الدراسة السابقة أهمية الضوء الأحمر البعيد في رصد التعبير الجيني المتعلق بالروتين في جذور السلالمشعرة 5.

وA. rhizogenes-بوساطة التحول لديه ميزة أن أي جين خارجي الفائدة إدراجها في ناقل ثنائي يمكن نقلها إلى استنساخ الجذر شعر متحولة34 لتحقيق فرط التعبير، وفقدان الوظيفة عن طريق الجيش الملكي النيبالي إسكات43،أو اكتشاف الجينات الأيضية الجديدة من قبل التحليلات transcriptome5. جذور شعر لديها إمكانات كبيرة لإنتاج الأيض الثانوية، والبروتينات المؤتلفة، والأجسام المضادة حتى44. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى نموها السهل والسريع في المتوسط الخالي من الهرمونات ، كونها أقل تكلفة ، ولا يوجد شرط للتجديد إلى نباتات كاملة21، والعائد المرتفع نسبيًا من الأيض الثانوية مقارنة بذلك من المواد النباتيةالأولية 31. ويمكن أيضا فصل هذه الجذور من explant الأصلي لإنشاء استنساخ الجذر على المدى الطويل، مستقرة، وتتميز الحفاظ على قدرتها على التركيب الحيوي والأنماط الظاهرية. بالإجمال, استنادا ً إلى هذه النتائج, هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة, متميزة, وفعالة لإنتاج جذور شعر متحولة للتحقيق في إنتاج الأيض الثانوية ويضع مرجعا لتحريض الجذر شعر في النباتات الأخرى. ومع ذلك ، فإن إمكانية استكشاف ثقافات الجذر المشعر لتوليد غلة هائلة من المركبات النشطة بيولوجيا يعتمد على نظام المفاعل الحيوي4المناسب الذي يجب أن تشعر فيه بعض المعلمات مثل إمدادات الأكسجين 4،8. ويقتصر هذا البروتوكول على إنتاج الأيض الثانوي المشتق من الجذور المشعرة والتحقيق في النمط الظاهري المرئي للجينات الوظيفية مثل تباين اللون ومحتويات الأيض الثانوية؛ ومع ذلك ، فإن التغيرات في النبات بأكمله بغض النظر عن الحصول على النباتات المتجددة من الجذور المشعرة لا يمكن تقييمها في هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل صناديق البحوث الأساسية لمعاهد بحوث الرعاية العامة المركزية ZXKT17002.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Tags

علم الوراثة، العدد 157، الحنطة السوداء التارتية، جذور شعر، التحول الجيني، GFP، rhizogenes Agrobacterium،المستقلب الثانوي، وظيفة الجينات
تحريض جذور شعر من قبل <em>Agrobacterium rhizogenes</em>-بوساطة التحول في الحنطة السوداء التارتية<em>(Fagopyrum tataricum)</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y.,… More

Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter