Summary
Vi beskriver en metode til at fremkalde behårede rødder af Agrobacterium rhizogenes-medierettransformation i Tartary boghvede (Fagopyrum tataricum). Dette kan bruges til at undersøge genfunktioner og produktion af sekundære metabolitter i tartary boghvede, vedtages for enhver genetisk transformation, eller anvendes til andre lægeplanter efter forbedring.
Abstract
Tartary boghvede (TB)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besidder forskellige biologiske og farmakologiske aktiviteter, fordi den indeholder rigelige sekundære metabolitter såsom flavonoider, især rutin. Agrobacterium rhizogenes er gradvist blevet brugt over hele verden til at fremkalde behårede rødder i lægeplanter til at undersøge genfunktioner og øge udbyttet af sekundære metabolitter. I denne undersøgelse har vi beskrevet en detaljeret metode til at generere A. rhizogenes-medieret behårede rødder i TB. Cotyledons og hypocotyledonary akse på 7-10 dage blev valgt som explants og inficeret med A. rhizogenes bærer en binær vektor, som inducerede utilsigtede behårede rødder, der dukkede op efter 1 uge. Den genererede behårede rodtransformation blev identificeret på grundlag af morfologi, resistensudvælgelse (kanamycin) og reportergenekspression (grønt fluorescerende protein). Efterfølgende blev de transformerede behårede rødder selvopformeret efter behov. I mellemtiden, en myeloblastosis (MYB) transskription faktor, FtMYB116, blev omdannet til TB genom ved hjælp af A. rhizogenes-medieretbehårede rødder til at kontrollere den rolle, FtMYB116 i syntetisering flavonider. Resultaterne viste, at udtrykket af flavonoide-relaterede gener og udbyttet af flavonoidforbindelser (rutin og quercetin) var signifikant (p < 0,01) fremmes af FtMYB116, hvilket indikerer, at A. rhizogenes-medieret behårede rødder kan bruges som et effektivt alternativt redskab til at undersøge genfunktioner og produktion af sekundære metabolitter. Den detaljerede trin-for-trin protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse for at generere behårede rødder kan vedtages for enhver genetisk transformation eller andre lægeplanter efter justering.
Introduction
Tartary boghvede (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) er en type af dicotyledon tilhører slægten Fagopyrum og familien Polygonaceae1. Som en form for kinesisk medicin homolog mad, tb har modtaget betydelig interesse på grund af sin karakteristiske kemiske sammensætning og forskellige bioaktiviteter mod sygdomme. TB er primært rig på kulhydrater, proteiner, vitaminer og carotenoider samt i polyfenoler såsom phenolsyrer og flavonoider1. Forskellige biologiske og farmakologiske aktiviteter af flavonoider, herunder antioxidative, antihypertensiv2,og anti-inflammatoriske samt anticancer og antidiabetisk egenskaber, er blevet påvist3.
Agrobacterium rhizogenes er en jord bakterie, der bidrager til udviklingen af behårede rodsygdom i flere højere planter, især tokimbladedeoner, ved at inficere sårsteder4,5. Denne proces indledes ved overførsel af T-DNA i den rodfremkaldende (Ri) plasmid5,6 og ledsages almindeligvis af integration og ekspression af et eksogent gen fra Ri plasmid og de efterfølgende trin til at generere den behårede rodfænotype7. A. rhizogenes-medieret transgene behårede rødder, som et kraftfuldt redskab inden for plantebioteknologi, har været mest udbredt på grund af deres stabile og høje produktivitet og nem opnåelse i en kort periode. Desuden er behårede rødder induceret af A. rhizogenes effektivt udmærker sig ved deres plagiotropiskrod udvikling og stærkt forgrenede vækst i et hormon-frit medium8. De kan bruges på flere forskningsområder, herunder kunstig frøproduktion, rodknudelforskning og til at studere samspillet med andre organismer såsom mykorrhizalsvampe, nematoder og rodpatogener7,9. Desuden er behårede rodtransformationskulturer blevet flittigt anvendt som et forsøgssystem til at undersøge de biokemiske veje og kemisk e-signalering og til at producere sekundære plantemetabolitter, der anvendes som lægemidler, kosmetik og tilsætningsstoffer til fødevarer8,10. De værdifulde sekundære metabolitter, herunder indol alkaloider, aconites, tropane alkaloider, terpenoids, og flavonoider, syntetiseret i vilde type behårede rødder er blevet undersøgt i flere årtier i mange arter, såsom ginsenoside i Panax ginseng11, coumarine i Ammi majus12, og phenolforbindelser i TB2,13.
Behårede rødder er blevet produceret ved hjælp af A. rhizogenes i 79 plantearter fra 27 familier14. For eksempel, A. rhizogenes-medieretbehårede rod transformation er blevet rapporteret i sojabønne15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, og cikorie (Cichorium intybus L.) 20. TB behårede rod transformation er også blevet undersøgt2. Få detaljerede protokoller er tilgængelige med hensyn til udviklingen af behårede rødder medieret af A. rhizogenes enten bærer en binær vektor eller ej. For eksempel introducerede Sandra et al.21 en metode til fremstilling af transgene kartoffelbehårede rødder, der blev opretholdt i vilde skud. De fuldt udviklede behårede rødder kunne visualiseres 5-6 uger efter injektion af A. rhizogenes bærer gus reporter genet i stilken internoder af kartoffelplanter. En anden undersøgelse havde også rapporteret en transgene behårede rodsystem induceret af A. rhizogenes huser gusA reporter genet i jute (Corchorus capsularis L.) 22.Desuden opnåede Supaart et al.23 transgene tobaksbehårede rødder ved hjælp af A. rhizogenes omdannet med udtrykket vektor pBI121, der bærer genet Δ1-tetrahydrocannabinolic syre (THCA) syntase til fremstilling af THCA.
Men en trinvis proces for en effektiv generation af behårede rod transformation, især i TB, har været relativt mindre påvist. I denne undersøgelse har vi beskrevet en detaljeret protokol ved hjælp af A. rhizogenes bærer reporter gen (GFP), en selektiv markør (Kan), og et gen af interesse (b4, en identificeret fra vores gruppe, men ikke offentliggjort gen fra grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) familie) til at generere behårede rod genetiske transformation i TB. Forsøget varede i 5-6 uger, fra podning af frø til generation af behårede rødder, der involverer explant forberedelse, infektion, coculturing, subkulering, og efterfølgende formering. Endvidere, A. rhizogenes indeholder en binær plasmider transporterer TB transgene af myeloblastosis transskription faktor 116 (FtMYB116) blev brugt til at afgøre, om FtMYB116 kan fremme ophobning af flavonoider, især rutin, i TB på genet og metaboliske niveau gennem TB behårede rod transformation. FtMYB116, som er en let transskriptionsfaktor, regulerer syntesen af rutin under forskellige lysforhold5. Chalcone syntase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3'-hydroxylase (F3'H) og flavonol syntase (FLS)24 er vigtige enzymer, der er involveret i rutinbiosyntesens metaboliske vej. Derfor viser denne undersøgelse overekspression af FtMYB116 i TB behårede rødder og ekspression af vigtige enzymgener samt indholdet af rutin og andre flavonoider såsom quercetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den TB, der anvendes i denne undersøgelse blev navngivet som BT18, som stammer fra racen af "JinQiao No.2" dyrket af Research Center of Small Diverse Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science. De primære trin i denne protokol er illustreret i figur 1.
BEMÆRK: Betjen eksplantalt-relateret manipulation hurtigt, og når det er muligt, skal du holde petriskålene lukket for at undgå visnen og kontaminering. Medmindre andet er angivet, blev alle explant inkubationer udført under betingelse af en 14-h lys og en 10-h mørk fotoperiode ved 25 °C. Medmindre andet er angivet, blev alle explants- eller bakterierelaterede operationer udført under aseptiske forhold i en laminar strømhætte. Alle medieingredienser til A. rhizogenes og in vitro-plantekulturer findes i tabel 1. Efter justering af pH blev alle medier autokviret ved 120 °C i 20 min. Størknede medier blev fremstillet ved at fylde 25 ml medium i en petriskål med en diameter på 9 cm og gøre det muligt at størkne.
FORSIGTIG: Aflejr alle de genetisk modificerede bakterier og planter i den relevante affaldsbeholder. Betjen alle farlige kemikalier i et stinkskab og deponere dem i beholderen til farligt affald.
1. Fremstilling af tb explants
- Fremstilling af TB-frø
- Der vælges buttede og ubeskadigede TB-frø (figur 1A1), som er konserveret ved en temperatur på under-20 °C i højst 2 år.
- Læg frøene i blød ved 28 °C i ca. 20 minutter, således at frøpelsen let kan skrælles af(figur 1A2). Brug om nødvendigt en saks til at skære en sprække på frøene for at lette peeling.
- Sterilisering af TB-frø
- Placer 100-200 skrællede frø i en 100 ml steriliseret konisk kolbe.
- Desinficere frøene med 75% ethanol i 30 s.
- Ethanolen udskiftes med 5 % natriumhypochlorit, og desinficeres i 15 minutter.
BEMÆRK: Desinfektion ved hjælp af kviksølvbichlorid i en koncentration på 1 g/l i 8 min. kan anvendes som alternativ sterilisator til erstatning af natriumhypochlorit i tilfælde af utilstrækkelig sterilisering.
FORSIGTIG: Kviksølvbichlorid er farligt og ikke et miljøvenligt materiale. Betjen den i det rygende skab, og aflejr den i beholderen til farligt affald, hvis der under alle omstændigheder anvendes kviksølvbichlorid. - Hæld natriumhypochloritud.
- Vask frøene med sterilt deioniseret vand 5 gange.
- Blot frøene tørre med en steril bibulous papir.
- Fremstilling af TB-planter
- Der fremstilles et basalmedium på 50 ml Murashige og Skoog (MS) (1962) suppleret med 30 g/L saccharose og 7 g/L agarpulver (MSSA) (tabel 1) i en 300 ml plantevævskulturflaske.
- PH-værdien justeres til 5,8 før autoklavering.
- Fordel 10 frø jævnt pr. flaske MSSA-medium.
- Spire frøene i et kulturrum ved 25 °C ± 1 °C under lystilstanden i 7-10 dage.
- Fremstilling af sterile explants
- Vælg robuste kimplanter af TB (Figur 1C), når de 2 stykker cotyledons udfoldes.
- Skær frøplanterne af rødderne (Figur 1C rød-dash pilespidser), undgå kontakt med mediet.
- Læg dem i en steril petriskål.
- Skær hypocotyls i 0,8-1 cm segmenter, og shear cotyledons i ca 0,5 cm stykker.
- Forkultur disse explants på MSSA medium under lystilstand i 24 timer.
- Overfør dem til en 100 ml steriliseret konisk kolbe, som nu er klar til infektion.
2. Forberedelse af A. rhizogenes til transformation
BEMÆRK: A. rhizogenes-stammen ACCC10060 blev venligst leveret af Institut for Udvikling af Lægemiddelplanter og bevaret ved −80 °C. A. rhizogenes blev omdannet med den binære vektor pK7GWIWG2D (II), der huser en T-DNA, der bærer b4-genet, der ledsager et GFP som indikatorgen og Kan-resistensgenet som en valgbar markør. Genet b4 er medlem af transskriptionfaktoren bHLH-familien, som endnu ikke er blevet offentliggjort. For at vurdere potentialet i TB behårede rødder blev A. rhizogenes omdannet med den binære vektor pK7WG2D, der indeholder MYB116-genet, for at undersøge dets virkning på produktionen af sekundære metabolitter såsom flavonoider på niveau med genekspression og metaboliske analyser. Aktiveret A. rhizogenes skal være velforberedt på samme tid med explants.
- Aktivering af A. rhizogenes
- Tø A. rhizogenes på is
- Dyp bakterierne og line dem jævnt på gær mannitol medium (YEB) suppleret med 15 g /L agar pulver, 50 mg /L rifampicin, og 50 mg / l spectinomycin (YEBARS, pH 7.0).
- Bakterierne inkuberes ved 28 °C i 12-16 timer.
- Vælg en monoklonal koloni og kultur det i en anden petriskål på samme ovenfor beskrevne måde.
- Der vælges monoklonale kolonier og kulturkultur i en 100 ml steriliseret konisk kolbe indeholdende 20 ml YEB-medium suppleret med 50 mg/l rifampicin og 50 mg/l spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ved 28 °C og 200 omdrejninger i 16-18 timer, indtil OD600-værdien når 2,0.
- Inkuber 2%-4% af ovennævnte dyrkning i en anden konisk kolbe på 100 ml indeholdende 20 ml YEBRS-medium ved 28 °C og 200 omdrejninger i 4-5 timer, indtil OD600-værdien når ca. 0,5 (Figur 1D).
3. Infektion og screening af TB explants
BEMÆRK: Formålet med denne protokol er at opnå genetisk transformerede behårede rødder. De vilde rødder blev brugt som negativ kontrol til at vurdere det transgene udtryk. I denne protokol blev A. rhizogenes omdannet med binær vektor enten pK7WG2D bærer genet af FtMYB116 eller pK7GWIWG2D (II) transporterer genet af b4 på forhånd.
- Suspension af A. rhizogenes
- Kulturen i trin 2.1.6 overføres til et steriliseret centrifugalrør på 50 ml.
- Spin ved 4.000 x g i 10 min ved 20 °C.
- Supernatanten fjernes, og bakteriepelleten fjernes igen med MS-medium suppleret med 30 g/L saccharose og 300 μM acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5.8) til OD600 ≈ 0,2.
- Infektion af explants
- Anciennitetssuspensionen i trin 3.1.3 indsaett i en konisk kolbe indeholdende de explants, der er fremstillet i trin 1.4.6 i 10 min.E
- Tag ud explants, og blot dem tørre ved hjælp af en steril bibulous papir.
4. Coculture af explants med A. rhizogenes
- Der anbringes et sterilt filterpapir med en diameter på 9 cm på MS-mediet, som er størknet med 7 g/L agarpulver suppleret med 30 g/L saccharose og 100 μM AS (MSSAAS medium, pH 5.2).
- Overlejr eksplanterne på filterpapiret ved 25 °C i 3 dage i mørke (Figur 1F).
5. Induktion og selektiv kultur
- Ca. 20 inficerede explants anbringes på MSSA-mediet suppleret med 500 mg/l cefotaksog 50 mg/l kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figur 1G).
- Inkuber dem lodret under lystilstanden ved 25 °C ± 1 °C. De behårede rødder forekommer ca. 1 uge efter inkubation(Figur 1H sort-dash pilespidser indikerer forekomst af behårede rødder).
BEMÆRK: Udskift MSSACK-mediet hver 15.
6. Subkulering TB behårede rødder
BEMÆRK: Denne procedure har til formål at høste kraftige behårede rødder. Regelmæssigt observere væksten af behårede rødder under formering, og fjerne de forurenede og inaktiverede dem i tide. Hvis det er nødvendigt, gentage følgende trin for at udbrede mere behårede rødder. Det tager cirka 10-14 dage fra subkulering til høst.
- Vælg de behårede rødder, der viser hvidt udseende og hurtig vækst.
- Skær dem i stykker på 2-3 cm.
- Klart nummerere dem på en ren bænk.
- Subkultur dem i en 100 ml steriliseret konisk kolbe indeholdende 5 ml medium suppleret med 30 g/L saccharose og 50 mg/l Kan (MSSK, pH 5.8) ved en roterende hastighed på 80 rpm ved 25 °C i mørke, indtil de overstrækkes til bunden af kolben (Figur 1I).
7. Identifikation af transformerede behårede rødder og bevarelse
BEMÆRK: Transformerede behårede rødder kan identificeres ud fra aspekteraf morfologi og genniveau. Identifikation kan også udføres i henhold til det behårede rodgenom og modstand, som ikke er omfattet af denne protokol. Denne procedure fokuserer primært på reporter gen og mål gen identifikation.
- Fjern tawny og forurenet behårede rødder og vælg dem med hvidt udseende.
- Vurder, om der er grøn fluorescens under en blå/lys dobbelt ultraviolet transilluminator.
- Vælg de behårede rødder, der udviser et stærkt fluorescenssignal i de nummererede rør eller indpakkes med en mærket stanniol efter tørring af dem med et absorberende papir.
- Lyophilisere dem i flydende nitrogen, efterfulgt af opbevaring af al høstved −80 °C til yderligere undersøgelse.
- Identifikation af gener
- Triturate 0,1 g af de behårede rødder i fint pulver i flydende nitrogen.
- Den genomiske DNA fra uafhængige transgene linjer af TB fremstilles ved hjælp af den modificerede cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) metode25 i henhold til instruktion fra producenten af anlæggets genomiske DNA-kit.
- Udfør polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af 100 ng genomisk DNA-skabelon og primere, der er anført i tabel 2.
- Forstærkningscyklussen udføres på følgende måde: fornaturering ved 94 °C i 5 min, denaturering ved 94 °C i 30 s, primer glødning ved 55 °C i 30 s og primer forlængelse ved 72 °C i 30 s. Efter 36 cyklusser og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 10 min analyseres forstærkningsprodukterne på 1% agarosegeler.
- Plette geler med nukleinsyre farvning og visualisere dem under UV-lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-medieret TB behårede rod transformation
Denne undersøgelse beskriver den trinvise protokol, der blev etableret for at opnå genetisk transformerede behårede rødder ved hjælp af A. rhizogenes. Det tog ca. 5-6 uger fra podning af TB-frø til høst af de identificerede behårede rødder, og nogle vigtige trin er afbildet i figur 1 (A-H). Kort blev steriliserede afskallede frø podet (figur 1B) for at opnå hurtigere steril spiring. A. rhizogenes (figur 1D) og sterile explants skal aktiveres og forberedes på forhånd. Dette efterfølges af nogle vigtige trin, herunder infektion af explants med aktiveret A. rhizogenes (Figur 1E), samkultur (Figur 1F) og selektiv kultur (Figur 1G). De inficerede explants bør placeres jævnt på den størknede MS medium og rummet skal opretholdes mellem dem til let adskille de forskellige transgene linjer. Behårede rødder vises med en fluffy hvid farve i en plagiotropic måde i såret steder af explants (Figur 1H). De behårede rødder danner en stærkt forgrenet og en sammenkoblet matrix og kan formeres efter behov (Figur 1I). De høstede behårede rødder kan bruges til at undersøge genfunktionen eller genet- eller proteinproteininteraktion. Alternativt kan TB behårede rødder massivt formeres til at give sekundære metabolitter såsom rutin i udpegede bioreaktorer.
Metoden til at fremkalde transgene behårede rødder i TB er blevet underbygget ved hjælp af en binær vektor (pK7GWIWG2D (II)bærer gener GFP og b4 (et medlem af den transskriptionelle faktor bHLH familie, endnu ikke offentliggjort). Reportergenet GFP blev brugt til nemt at skelne de transgene behårede rødder fra de ikke-transgene ved at visualisere signalet under en blå/lys dobbelt ultraviolet transilluminator (figur 2) eller ved at identificere målgenet (figur 3). De transformerede behårede rødder udviste grøn fluorescens, når de belyste under blåt eller ultraviolet lys (repræsenteret med sorte pilespidser i figur 2A),mens de utransformerede behårede rødder ikke udviste den grønne fluorescens (figur 2B). De behårede rødder med et højt GFP-signal blev formeret i fjorten dage, som vist i figur 2C.
For yderligere at identificere, om den binære vektor er blevet omdannet til TB-genomet, blev der udført genidentifikationer. Kort, plante genomisk DNA af TB behårede rødder blev udarbejdet til PCR analyse baseret på den modificerede CTAB metode25. PCR blev udført ved at forstærke generne (Kan, GFP, og b4), som var til stede i figur 3, henholdsvis. Primerne er anført i tabel 2. Tilstedeværelsen af de 3 gener i alle de transgene linjer (Figur 3,baner 5-11) viste, at den binære vektor er blevet omdannet til TB-genomet. Kan og GFP var fraværende i vilde-type rødder (Figur 3, lane 3) og eksperimentel negativ kontrol ( Figur3,lane 4), mens b4 blev påvist i vilde type rødder. Disse 3 gener blev utvivlsomt præsenteret i den positive kontrol (Figur 3,bane 2), men var tilsyneladende fraværende i den negative kontrol ( Figur3,bane 4).
Evaluering af den lysinducerede transskriptionsfaktor FtMYB116 i TB ved hjælp af ovennævnte behårede rodsystem
FtMYB116 blev udtrykt ved at anvende ovennævnte protokol over behårede rodinduktion. Dette blev opnået ved at preindsætte genet FtMYB116 i den binære vektor pK7WG2D og derefter inficere med A. rhizogenes at opnå genoverekspression. Kort, behårede rødder på 0,1 g blev tritureret i fint pulver ved hjælp af flydende nitrogen. Total RNA blev udvundet ved at følge instruktionerne fra producenten af plantRNA isolation kit26. Derefter reverse-transskription PCR og realtid PCR blev udført for at forstærke FtMYB116 og rutin syntetisering vej relaterede gener. Efterfølgende blev ftmyb116's regulerende virkninger på rutin-synteserelateret genekspression og udbyttet af rutin verificeret.
Figur 4A viser det relative udtryk for FtMYB116 i de transgene linjer af tb behårede rødder. Sammenlignet med kontrolgruppen udviste ftmyb116's relative udtryk en betydelig stigning i alle 3 uafhængige transgene linjer. Figur 4B og figur 4C illustrerer fremme af biosyntesen af rutin og quercetin på metabolisk niveau gennem Overekspression af FtMYB116. Indholdet af rutin og quercetin i transgene var signifikant (p < 0,01) steget sammenlignet med indholdet i wild-typen og nåede henholdsvis 40 og 0,5 mg/g FW, som var 8 gange større end dem i vildtypen. De relative genudtryk for CHS, F3H, F3'Hog FLS i alle 3 transgene linjer var bemærkelsesværdigt højere end i kontrolgruppen (figur 4D). Tilsammen bekræftede disse resultater, at den strategi, der er beskrevet i denne undersøgelse, med held kunne anvendes til at generere behårede rodtransformationer i TB og undersøge genekspressionen og metaboliske udbytte af sekundære metabolitter.
Figur 1: Processer til at fremkalde A. rhizogenes-medieret transgene behårede rødder i TB. Der vises repræsentative billeder af kritiske stadier: (A1) og (A2) repræsenterer før og efter afskalning af frøfrakker; BB) repræsenterer hver ti frø, der er podet i en vævsflaske indeholdende MSSA-medium (C) betegner kimplanter af TB på 7-10 dage efter inokulering, og de røde-dash pilespidser viser skærepunkter; DD) ogE) angiver fremstillingen af henholdsvis A. rhizogenes (OD600 = 0,5) og infektion af explants (F) ogG) symboliserer sammenkulering med aktiveret A. rhizogenes på mssaas medium og selektiv dyrkning på MSSACK medium, henholdsvis; behårede rødder fremgår af (H), som det fremgår af de sorte-dash pilespidser; og (I) viser udbredelsen af behårede roddannelse; de sorte dash pilespidser angiver de inducerede behårede rødder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Transformation af den binære vektor, der bærer GFP reporter-genet. (A) betegner de inducerede behårede rødder efter selektiv kultur undersøgt under den blå/lyse dobbelte ultraviolette transilluminator. bB) ogc) repræsenterer vildrod og formering af henholdsvis transformerede behårede rødder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: PCR-forstærkning af gener (Kan, GFPog b4) fra genomisk DNA isoleret fra vilde rødder af TB i 7 uafhængige transgene linjer. (A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Lane 1: molekylære størrelse markører (hvid pilespids angiver 750 bp), lane 2:plasmid (binær vektor pK7GWIWG2D (II) transporterer Kan, GFP, og b4 gener) som den positive kontrol, lane 3: vilde-type rod, lane 4: renset H2O som den negative kontrol, og baner 5-11: de 7 uafhængige transgene linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Relativ ekspression af FtMYB116 i de transgene linjer af TB behårede rødder. (A) og den fremforstående virkning af ftmyb116's overekspression af biosyntesen i (B) rutin og (C) quercetin (Dette tal er blevet ændret fra Dong et al.5). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og udført 3 gange. "**" angiver en signifikant forskel på p < t0,01 ved hjælp af Student's t-test. (D) Ekspression af gener relateret til flavonoide synteseveje i transgene linjer. Det relative udtryksniveau blev normaliseret til niveauet for actin-kontrollen. Data præsenteres som middel ± standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Medier | Mellemstore ingredienser | ||
| MSSA (MSSA) | Murashige- og Skoog-medium (MS), der indeholder saccharose i 30 g/L, og agarpulver i 7 g/L, pH 5.8 | ||
| YEBARS | Gær Mannitol Medium (YEB) indeholdende agarpulver ved 15 g/L, rifampicin ved 50 mg/l og spectinomycin ved 50 mg/l, pH 7,0 | ||
| YEBRS delte et tid. | YEB indeholdende rifampicin ved 50 mg/l og spectinomycin ved 50 mg/l, pH 7.0 | ||
| MSSAS (MSSAS) | MS-medium indeholdende saccharose ved 30 g/L og acetosyringone (AS) ved 300 μM, pH 5,8 | ||
| MSSAA | MS-medium indeholdende saccharose ved 30 g/L, agarpulver ved 7g/L og AS ved 100 μM, pH 5.2 | ||
| MSSACK (MSSACK) | MS-medium indeholdende saccharose ved 30 g/L, agarpulver ved 7 g/L, cefotaxan ved 500 mg/l og kanamycin (kan) ved 50 mg/l, pH 5.8 | ||
| MSSK (MSSK) | MS-medium indeholdende saccharose ved 30 g/L og kan ved 50 mg/l, pH 5.8 | ||
Tabel 1: Medier og deres ingredienser.
| Primer | Rækkefølge (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F delte et par kan-f'er | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R delte et af de saa et | TGAATCCAGAAAAGCGGCCA | |
Tabel 2: Primer sekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TB er blevet anvendt i flere undersøgelser vedrørende sekundære metabolitter på genetisk og metabolisk niveau1,2,5,27,28. Behårede rodkultur, som en unik kilde til metabolitproduktion, spiller en central rolle i metabolisk teknik29 og kan bruges til at ændre metaboliske veje ved at indsætte de relaterede gener. Kim et al.2 introducerede oprindeligt etableringen af tb behårede rodkulturer ved A. rhizogenes-medieret transformation for at opnå produktion af phenolforbindelser. Indholdet af rutin, at de opnåede i TB behårede rødder var mere end 10 gange højere end i vilde-type rødder. I denne undersøgelse førte indførelsen af FtMYB116 til et højere udtryk for rutin-relaterede gener og steg produktionen af rutin i TB behårede rødder. Denne teknik er blevet bekræftet at være egnet til fænotypisk karakterisering og udtryk for phenylpropanoid-relaterede gener såsom FtF3H og FtFLS i TB behårede rødder5,30,31. Zhang et al.32 brugte tb behårede rødder til at undersøge produktionen af rutin ved at overudtrykke en række FtMYB transskriptionelle faktorer. Zhou et al.33 observerede et fald i indholdet af rutin på grund af overekspression af FtMYB11 i TB behårede rødder. Disse resultater sammen med vores resultater viser de mulige virkninger af behårede rod transformation på samspillet mellem FtMYB transskriptionelle faktorer og rutin biosyntese-relaterede gener.
Selv om der er begrænsede data vedrørende en trin-for-trin protokol for induktion af TB behårede rødder, vi beskriver heri trin-for-trin protokol for første gang at opnå transgene TB behårede rødder på en effektiv og stabil måde ved hjælp af A. rhizogenes transporterer en binær vektor. Under disse eksperimentelle processer, mange faktorer skal nøje overvejes for at opnå den optimale inducerede behårede rødder. For det første er udvælgelsen af explants en afgørende faktor. TB sorter er kendt for at påvirke morfologi af behårede rødder og produktion af phenolforbindelser. Thwe et al.30 illustrerede, at genekspressionen i den biosyntetiske sti phenylpropanoid og indholdet af phenolforbindelser varierede blandt TB-sorter. De fandt også behårede rødder i en sort, som var dyb rødlig-lilla på grund af sin anthocyanin indhold13. I vores undersøgelse blev 2 netop udfoldede cotyledoner og hypocotyl er udvalgt som explants. Dette skyldes, at unge og ømme blade favoriserer en høj behåret rod induktion sats2,30, mens meget differentierede og gamle planteceller negativt påvirker behårede rod induktion. For det andet, stammen af A. rhizogenes har en betydelig indvirkning på behårede rod induktion. Forskellige bakteriestammer udviser forskellige transformerende evner med hensyn til morfologier og induktionseffektivitet af behårede rødder, som kan belyses af de forskellige plasmider, der næres af stammerne34. Aye et al.35 sammenlignede virkningerne af flere A. rhizogenes stammer (R1000, R1200, 15834, LBA9402 og A4) på TB behårede rodinduktion og fenylpropanoid biosyntese og fandt, at den mest lovende stamme til behåret rodproduktion i TB var R1000. Dette fund er blevet støttet af Kim et al.2 Ikke desto mindre, stammen ACCC10060, der blev udelukket i undersøgelsen af Aye et al. men anvendes i vores undersøgelse udstillet tilfredsstillende infektion effektivitet. Den fluffy hvide udseende behårede rødder opnået ved hjælp af vores protokol er i overensstemmelse med de behårede rødder genereret i Salvia miltiorrhiza36, hvori den samme stamme ACCC10060 bærer den binære vektor pK7GWIWG2D (II) blev brugt til at lukke munden på målet. For det tredje spiller degerming, herunder forbehandling af materialer og en koncentration af cefotaxime i selektiv kultur, også afgørende roller i behåret rodinduktion. Ufuldstændig desinfektion i ethvert trin kan føre til svigt af behårede rod transformation. Desuden har den bakterielle koncentration en betydelig indflydelse på produktionen af transformerede rødder. Høje koncentrationer kan reducere plantecellerne ved konkurrencedygtig hæmning, mens lave koncentrationer kan forårsage lav tilgængelighed4.
Desuden, kultur betingelser såsom vækstmedium, passende preculturing og coculturing tid, og andre biotiske eller abiotiske faktorer spiller en vigtig rolle i behårede rod induktion. Huang et al.37 anbefalede 1/2 MS medium indeholdende saccharose i en koncentration på 30 g /L for codyrkning for at opnå maksimal TB behårede rødder. Dette kan forklares ved det høje saltmedium, der er egnet til behåret roddannelse, mens et lavt saltmedium favoriserer overdreven bakteriel multiplikation34. AS er en type phenolforbindelse , der kan lette A. rhizogenes-medieret transformation i en række plantearter ved transskription af vir regionen Agrobacterium34,38,og vir kunne effektivt induceres i et medium med en pH på < 5,739,40. Derfor anbefaler vi et samkulturmedium med pH 5.2 suppleret med 100 μM AS. Huang et al.37 rapporterede, at TB behårede rødder blev til brune efter dag 24 fra hvid og lysegul. Derfor er de subkulturerede behårede rødder hver 24 dage; Vi anbefaler dog, at du subkulerer hver fjortende dag for at undgå bruning af behårede rødder. Hertil kommer, at miljømæssige forhold såsom lys, hormoner, temperatur, og UV-stråling synes at påvirke ekspressionen af flavonoid biosyntese-relaterede gener ved meget stimulerende eller deprimerende signal transduktion41,42. Den tidligere undersøgelse har vist betydningen af langt rødt lys i overvågningen af rutin-relaterede genekspression i TB behårede rødder5.
Den A. rhizogenes-medierettransformation har den fordel, at enhver udefrakommende gen af interesse indsat i en binær vektor kan overføres til den transformerede behårede rod klon34 for at opnå overekspression, tab-of-funktion via RNA hæmning43, eller opdagelsen af nye metaboliske gener ved transcriptome analyser5. Behårede rødder har et stort potentiale til at producere sekundære metabolitter, rekombinant proteiner, og evenantibodies44. Dette skyldes primært deres nemme og hurtige vækst i hormon-fri medium, er billigere, ingen krav om regenerering i komplette planter21,og det relativt høje udbytte af sekundære metabolitter i forhold til den fra start plantemateriale31. Disse rødder kan også adskilles fra den oprindelige explant at etablere langsigtede, stabile, og karakteriseret rod kloner opretholde deres biosyntetiske kapacitet og fænotyper. Alt i alt, baseret på disse resultater, denne protokol giver en hurtig, særskilt og effektiv metode til at producere transformerede behårede rødder til at undersøge produktionen af sekundære metabolitter og fremsætter en reference for behårede rod induktion i andre planter. Mulighederne for at udforske behårede rodkulturer for at generere massive udbytter af bioaktive forbindelser afhænger imidlertid af det relevante bioreaktorsystem , hvor visse parametre såsom iltforsyning skal være berørt4,8. Denne protokol er begrænset til produktion af sekundære metabolitter, der er afledt af behårede rødder, og til at undersøge den visualiserede fænotype af funktionelle gener såsom farvevariansen og indholdet af sekundære metabolitter; De fænotypiske ændringer i hele planten uanset opnåelsen af regenererede planter fra de behårede rødder kunne dog ikke evalueres i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Grundforskningsfondene for de centrale offentlige velfærdsforskningsinstitutter ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
