Summary
אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.
Abstract
כוסמת טרארי (שחפת) ( ליטר) Gaertn בעלת פעילות ביולוגית ופרמקולוגית שונים, משום שהוא מכיל מטבוליטים משניים שופע כגון פלבנואידים, במיוחד rutin. Agrobacterium בשימוש בהדרגה ברחבי העולם כדי לגרום שורשים שעירים צמחי מרפא לחקור פונקציות גן ולהגדיל את התשואה של מטבוליטים משנית. במחקר זה, תיארנו שיטה מפורטת ליצירת . ריזוגנים-תיווך שורשיםשעירים בשחפת. Cotyledons וציר hypocotyledonary ב 7 – 10 ימים נבחרו כאקסוצמחים ונגועים עם . ריזוזוגנים נושאת וקטור בינארי, אשר המושרה שורשים השעירים האדוקיות שהופיעו לאחר 1 שבוע. השינוי שנוצר שורש השורש זוהה על בסיס מורפולוגיה, בחירת התנגדות (kanamycin), וביטוי גן העיתונאי (חלבון פלורסנט ירוק). לאחר מכן, השורשים השעירים הפכו את עצמם כנדרש. בינתיים, מיאלואובלסטוזיס (MYB) שעתוק גורם, FtMYB116, הפכה הגנום שחפת באמצעות א. ריזוזוגנים-תיווך השורשים שעירים כדי לאמת את התפקיד של FtMYB116 ב סינתזה פלאונואידים. התוצאות הראו כי הביטוי של גנים הקשורים פלונואיד ואת התשואה של תרכובות פלונואיד (rutin ו-quercetin) היו באופן משמעותי (p < 0.01) קידם על ידי FtMYB116, המציין כי . ריזוזוגנים-תיווך שורשים שעירים יכול לשמש כלי אלטרנטיבי יעיל לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משנית. פרוטוקול צעד אחר צעד המפורט במחקר זה ליצירת שורשים שעירים יכול להיות מאומץ לכל שינוי גנטי או צמחי מרפא אחרים לאחר הסתגלות.
Introduction
כוסמתטרטרית ( ליטר) הוא סוג של דו-פסיגיים השייך לסוג fagopyrum והמשפחה המאירוניים1בתוך השנה. כסוג של הרפואה הסינית מזון הומוולוגי, TB קיבל עניין רב בשל ההרכב הכימי הייחודי שלה ופעילויות ביוקליות מגוונות נגד מחלות. TB הוא עשיר בעיקר בפחמימות, חלבונים, ויטמינים, קרוטנואידים כמו גם ב פוליפנולים כגון חומצות פנופילית ו פלבנואידים1. פעילויות ביולוגיות ותרופתי שונות של פלונונואידים, כולל אנטיחמצוני, אנטי יתר לחץ דם2, אנטי דלקתיות, כמו גם antioxidative ותכונות נוגדות סוכרת, הוכחו3.
Agrobacterium ריזוגנס הוא חיידק האדמה תורמת לפיתוח של מחלת שורש שעירים בכמה צמחים גבוהים, במיוחד dicotyledons, על ידי זיהום אתרי הפצע4,5. תהליך זה הוא יזם על ידי העברת ה-DNA ב-לגרימת שורש (Ri) פלמיד5,6 והוא מלווה בדרך כלל על ידי שילוב וביטוי של גן אקסוגני מן הפלביניים Ri ואת השלבים הבאים של יצירת השורש השעיר פנוטיפ7. א. ריזוגנים-שורשים שעירים מתווכת, ככלי רב-עוצמה בתחום ביוטכנולוגיה הצמח, השתמשו באופן נרחב ביותר בשל הפרודוקטיביות היציבה והגבוהה שלהם ובידור קל בתקופה קצרה. יתר על כן, שורשים שעירים הנגרמת על ידי. ריזוזוגנים מכובד ביעילות על ידי פיתוח שורש plagiotropic שלהם וצמיחה מסעף מאוד בינונית ללא הורמון8. ניתן להשתמש בהם במספר תחומים של מחקר, כולל ייצור זרעים מלאכותיים, מחקר גולה שורש, ובלימוד האינטראקציות עם אורגניזמים אחרים כגון פטריות mycorrhizal, nematodes, ופתוגנים שורש7,9. בנוסף, תרבויות שונות השינוי השורש השתמשו בהרחבה כמערכת ניסיונית כדי לחקור את מסלולים ביוכימיים ואיתות כימי לייצר צמח משני מטבוליטים המשמשים כתרופות, קוסמטיקה, תוספי מזון8,10. מטבוליטים משניים יקרי ערך, כולל "אינדול אלקלואידים", "הטרואידים", "טרפננואידים", ופלונונואידים, מסונתז בשורשים שעירים פראי-סוג, נחקרו במשך מספר עשורים במינים רבים, כגון ginsenoside ג'ינסנג11, coumarine ב ammi majus12, תרכובות פנופילית בשחפת2,13.
שורשים שעירים הופקו באמצעות . ריזוזוגנים ב 79 מינים צמחים מ 27 משפחות14. למשל, א. ריזוזוגנים-תיווך השינוי שורש שעירדווחה ב סויה15,16, מרווה17, plumbago indica18, לוטוס יפני19, ו עולש (cichorium intybus L) 20. TB שיער השינוי שורש יש גם נחקר2. פרוטוקולים מפורטים מעטים זמינים לגבי פיתוח של שורשים שעירים תיווך על ידי . ריזוגנים שנושאים וקטור בינארי או לא. למשל, סנדרה ואח '21 הציג שיטה של הפקת תפוחי אדמה שעירים שעיר מתמשכת בעלי סוג פראי נצרי. שורשים שעירים מפותח לחלוטין יכול להיות דמיינו 5-6 שבועות לאחר ההזרקה של . ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי גאס לתוך בלוטות הגזע של צמחי תפוחי אדמה. מחקר נוסף דיווח גם על מערכת שורש טרנסגניים השעיר הנגרמת על ידי . ריזוזוגנים מחסה את הגן העיתונאי gusa ב יוטה (מקהלה capsularis L.) 22. יתר על כן, Supaart ואח '23 השיגו שורשי טבק השעירים באמצעות . ריזוזוגנס שינתה את הביטוי וקטור pBI121 נושאת את הגן של Δ1-הטטרקאנאיפילית חומצה (thca) סטנדרטים לייצר thca.
עם זאת, תהליך צעד אחר צעד עבור הדור האפקטיבי של שינוי שורש בסיס, במיוחד בשחפת, הוכח פחות יחסית. במחקר זה, תיארנו פרוטוקול מפורט באמצעות. ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי (gfp), סמן סלקטיבי (Kan), וגנים של עניין (b4, מזוהה מהקבוצה שלנו אבל לא פורסם הגן מתוך סליל בסיסי לולאה-סליל (bhlh) משפחה) כדי ליצור שעיר השינוי הגנטי השורש בשחפת. הניסוי נמשך 5-6 שבועות, מן החיסונים של זרעים לדור שורשים שעירים, מעורבים הכנה ההסבר, זיהום, coculturing, subculturing, והתפשטות הבאים. יתר על כן, ריזוגנים המכילים בינארי פלבאמצע נושאת את שחפת מגנטית של שעתוק מיאלואובלסטוזיס גורם 116 (FtMYB116) שימש כדי לקבוע אם FtMYB116 יכול לקדם הצטברות של פלונונואידים, במיוחד rutin, בשחפת על הגן ואת רמת מטבולית באמצעות שחפת שיער שעירים שורש. FtMYB116, שהוא גורם המושרה באור, מווסת את סינתזה של רוטין בתנאי אור שונים5. כלקון סינתז (CHS), flavanone-3-הידרוקסילאז (F3H), פלונואיד-3'-הידרוקסילז (F3'H), ופלונול סינתז (fls)24 הם אנזימים מפתח המעורבים במסלול חילוף החומרים של הביוטין של רוטין. לכן, מחקר זה מדגים את ביטוי היתר של FtMYB116 ב שורשים שעירים TB ואת הביטוי של גנים אנזים מפתח, כמו גם את התוכן של רוטין ופלבנואידים אחרים כגון quercetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TB בשימוש במחקר זה נקרא בשם BT18, אשר מקורו גזע של "JinQiao מס ' 2" מעובד על ידי מרכז המחקר של גרגר קטן שונות של האקדמיה החקלאית שאנש של המדע החקלאי. השלבים העיקריים של פרוטוקול זה מומחשים באיור 1.
הערה: הפעל מניפולציה הקשורות לאקסוצמחים במהירות, וכאשר הדבר אפשרי, השאר את מנות פטרי סגורות כדי להימנע מוויטינג וזיהום. אלא אם נכתב אחרת, כל הincubations האלה נערכו במצב של אור 14-h ו photoperiod כהה 10-h ב -25 ° c. אלא אם נכתב אחרת, כל הפעולות explants או חיידקים הקשורים בוצעו בתנאים אספטי במכסה הזרם למינארי. כל מרכיבי המדיה של הגנים והצומח בתרבויות מבחנה מסופקים בטבלה 1. לאחר התאמת ה-pH, כל אמצעי התקשורת היו אוטומטיים ב 120 ° c עבור 20 דקות. התקשורת הייתה מוכנה על ידי מילוי 25 מ ל בתוך צלחת פטרי בקוטר 9 ס מ ומאפשר לו לגבש.
התראה: הפקדה את כל החיידקים והצמחים ששונו גנטית לתוך מיכל הפסולת המתאים. הפעל את כל הכימיקלים המסוכנים בארון המים והכנס אותם למיכל הפסולת המסוכנת.
1. הכנת מתקני שחפת
- הכנת זרעי שחפת
- בחרו זרעי שחפת שמנמנות ולא ניזוק (איור 1A1) שנשמרו בטמפרטורה פחות מ-20 ° c במשך יותר משנתיים.
- משרים את הזרעים במים ב -28 ° c בקירוב כ -20 דקות, כך שניתן לקלוף בקלות ממעיל הזרע (איור 1A2). במקרה הצורך, השתמשו במספריים לחיתוך חריץ על הזרעים כדי להקל על הפילינג.
- סטריליזציה של זרעי שחפת
- מקום 100 – 200 הזרעים קלוף לתוך מבחנה חרוט 100 mL.
- לחטא את הזרעים באמצעות 75% אתנול עבור 30 s.
- החלף את האתנול עם היפוכלוריט של 5% נתרן וחטא במשך 15 דקות.
הערה: חיטוי באמצעות כספית ביוכלוריד בריכוז של 1 g/L עבור 8 דקות עשוי לשמש כחיטוי אלטרנטיבי להחליף היפוכלוניט נתרן בכל מקרה של עיקור לקוי.
התראה: כספית ביוכלוריד מסוכנת ולא חומר ידידותי לסביבה. הפעל אותו בארון הפוגות והכנס אותו למיכל הפסולת המסוכנת, אם נעשה שימוש בכספית כספית בכל מקרה. - . תשפוך את ההיפוכלוריט של הנתרן
- רוחצים את הזרעים במים מעוקרים ומפוקרים 5 פעמים.
- למחוק את הזרעים יבשים עם נייר bibulous סטרילי.
- הכנת שתילי השחפת
- להכין 50 mL מורראשיג ו Skoog (MS) הבסיס בינונית (1962) שיושלם עם 30 g/L סוכות ו 7 g/L אגר אבקה (MSSA) (שולחן 1) בבקבוק תרבות של הצמח מ mL 300.
- כוונן את ה-pH ל 5.8 לפני הפעלה אוטומטית.
- הפץ 10 זרעים באופן שווה לכל בקבוק של מדיום MSSA.
- לנבוט הזרעים בחדר תרבות ב 25 ° c ± 1 ° צ' במצב האור במשך 7 – 10 ימים.
- הכנת מתקני חיטוי סטריליים
- בחר שתילים חזקים של TB (איור 1ג), כאשר 2 פיסות של פסיגי מפרש.
- חותכים את השתילים מן השורשים (איור 1ג ' ראשי חץ אדום), הימנעות קשר עם המדיום.
- מניחים אותם בצלחת פטרי סטרילית.
- חותכים את ה-hypocotyls לתוך 0.8 – 1 ס מ קטעים, ולהטות את פסיגי לתוך כ 0.5 ס מ חתיכות.
- טרום תרבות אלה explants על מדיום MSSA תחת תנאי האור עבור 24 שעות.
- להעביר אותם לתוך בקבוקון חרוטי 100 mL מעוקר, אשר כעת מוכן זיהום.
2. הכנת הגנים לטרנספורמציה
הערה: המאמץ של א. ריזוגנס ACCC10060 הסופק באדיבות המכון לפיתוח צמחי מרפא ושמור ב--80 ° c. א. ריזוזוגנס השתנה עם וקטור בינארי pK7GWIWG2D (II) כי הנמלים T-DNA נושאת את הגן b4 ליווי gfp כמו גן אינדיקטור ואת הגן ההתנגדות קאן כסמן לבחירה. הגן b4 הוא חבר של משפחת שעתוק משפחה, אשר עדיין לא פורסם. כדי להעריך את הפוטנציאל של שורשים שעירים שחפת, א. ריזוזוגנים הוסב עם וקטור בינארי pK7WG2D המכיל את הגן MYB116 כדי לחקור את השפעתו על ייצור של מטבוליטים משניים כגון פלבנואידים ברמה של ביטוי גנים ועל ידי ניתוחים מטבוליים. הופעל . ריזוזוגנים צריך להיות מוכן היטב באותו הזמן עם explants.
- הפעלה של א. ריזוזוגנס
- הפשרת הגנים על הקרח
- לטבול את החיידקים קו אותם באופן שווה על מדיום ניטול שמרים (אייב) שיושלם עם 15 g/L אגר אבקה, 50 mg/l גריסופלובין, ו 50 mg/l spectinomycin (yebars, pH 7.0).
- מודיית את החיידקים ב 28 ° צ' עבור 12-16 h.
- בחר מושבה חד-שבטיים ותרבות אותו בצלחת פטרי אחרת באותה צורה שתוארה לעיל.
- בחר מושבות חד שבטיים ותרבות אותם ב-100 mL מעוקר בקבוקון חרוטי המכיל 20 מ ל של מדיום של אייב שיושלם עם 50 mg/L גריסופלובין ו 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ב 28 ° c ו-6 סל ד עבור 16 – 18 h עד הערך של OD200 מגיע 600.
- מיכל התרבות 2% – 4% מהתרבות הנ ל ב-100-mL בקבוקון נוסף המכיל 20 מ ל של YEBRS בינוני ב 28 ° צ' ו 200 rpm עבור 4-5 h עד הערך של OD600 מגיע כ 0.5 (איור 1ד).
3. זיהום והקרנה של הרחבות TB
הערה: מטרת פרוטוקול זה היא להשיג שורשים שעירים גנטית השתנה. השורשים מסוג פראי שימשו כפקד שלילי כדי להעריך את הביטוי הטרנסגניים. בפרוטוקול זה, א. ריזוגנס השתנה עם וקטור בינארי או pK7WG2D נושאת את הגן של FtMYB116 או pK7GWIWG2D (II) נושאת את הגן של b4 מראש.
- השעיית מחדש של א. ריזוגנס
- להעביר את התרבות המתקבלת בשלב 2.1.6 לתוך צינור צנטריפוגלי 50-mL מעוקר.
- ספין ב 4,000 x g עבור 10 דקות ב 20 ° c.
- הסר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה החיידקית עם MS בינונית בתוספת עם 30 g/L סוכרוז ו 300 μM acetosyringone (AS) (ב-MSSAS, pH 5.8) כדי OD600 ≈ 0.2.
- זיהום של הרחבות
- להחדיר את ההשעיה חיידקים שהושג צעד 3.1.3 לתוך בקבוקון חרוט המכיל את explants מוכן בשלב 1.4.6 עבור 10 דקות (איור 1E).
- להוציא את האקסוצמחים, ולמחוק אותם יבש באמצעות נייר bibulous סטרילי.
4. התרבות של האקסוצמחים עם . ריזוגנס
- מניחים נייר סטרילי 9 ס מ בקוטר מסנן על מדיום MS, אשר מתחזק באמצעות 7 g/L אגר אבקה בתוספת עם 30 g/L סוכרוז ו-100 μM AS (MSSAAS בינונית, pH 5.2).
- שכבת החפירה על נייר הסינון ב -25 ° c למשך 3 ימים בחשיכה (איור 1F).
5. השראה ותרבות סלקטיבית
- מקום כ 20 explants נגועים על בינוני MSSA בתוספת עם 500 mg/L cefoסעה ו 50 mg/L kanamycin (הקאנון) (MSSACK, pH 5.8) (איור 1G).
- מודחלת אותם באופן אנכי תחת תנאי האור ב 25 ° c ± 1 ° צ'. השורשים שעירים מתרחשים בערך 1 שבוע לאחר הדגירה (איור 1שחור חצים ראשי להצביע על התרחשות של שורשים שעירים).
הערה: החלף מדיום MSSACK כל 15 יום במידת הצורך.
6. השורשים השעירים של TB
הערה: הליך זה נועד לקצור את השורשים השעירים נמרץ. באופן קבוע להתבונן בצמיחה של שורשים שעירים במהלך ההפצה, ולהסיר את אלה מזוהמים ובלתי פעיל בזמן. במקרה הצורך, חזרו על השלבים הבאים כדי להפיץ שורשים שעירים יותר. זה לוקח בערך 10 – 14 ימים מ subculturing לקצור.
- בחר את השורשים שעירים מראה המראה הלבן וצמיחה מהירה.
- חותכים אותם לחתיכות של 2-3 ס מ.
- . ברור שמספר אותם על ספסל נקי
- תת-תרבות אותם ב-100 mL מעוקר בקבוקון חרוטי המכיל 5 מ ל של MS בינוני בתוספת 30 g/L סוכות ו 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) במהירות רוטרי של 80 rpm ב 25 ° c בחשכה עד שהם מתפשטים לתחתית הבקבוקון (איור 1I).
7. הזדהות עם שורשים שעירים משתנים ושימור
הערה: ניתן לזהות שורשים שעירים בהתאם להיבטים של מורפולוגיה ורמת הגנים. זיהוי יכול להתבצע גם על פי הגנום שורש התנגדות, אשר אינם מכוסים בפרוטוקול זה. הליך זה מתמקד בעיקר בגנים כתבת וזיהוי גנים מטרה.
- להסיר שורשים שעירים מזוהמים ולבחור את אלה עם המראה הלבן.
- הערכה אם יש זריחה ירוקה תחת כחול/אור אולטרה סגול כפול ממאיר.
- בחר את השורשים השעירים מציג אות זריחה חזקה בצינורות ממוספרים או עטוף באמצעות נייר כסף מסומן לאחר ייבוש אותם עם מסמך סופג.
- ליאופליז בחנקן נוזלי, ולאחריה מאחסנים את כל היבול ב-80 ° c לחקירה נוספת.
- זיהוי גנטי
- Triturate 0.1 גרם של שורשים שעירים לאבקה משובחת בחנקן נוזלי.
- הכינו את ה-DNA גנומית של קווי טרנסגניים עצמאיים של TB באמצעות cetyltrimethylammonium ברומיד שונה (CTAB) שיטה25 על פי ההוראה של היצרן של ערכת ה-dna צמח גנומית.
- לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות 100 ng של תבנית ה-DNA גנומית ומפורטות בטבלה 2.
- בצע את מחזור הגברה כדלקמן: predenaturation ב 94 ° צ' עבור 5 דקות, הדנטורציה ב 94 ° c עבור 30 s, פריימר ריפוי ב 55 ° צ' עבור 30 s, והארכה פריימר ב 72 ° c עבור 30 s. לאחר 36 מחזורים וצעד הארכה הסופי ב 72 ° צ' עבור 10 דקות, לנתח את מוצרי הגברה על 1% agarose ג ' לים.
- כתם את ג'לים עם חומצת גרעין כתמי ולדמיין אותם תחת אור UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אגרואכטריום-מתווכת שורש של TB שעיר המרה
מחקר זה מתאר את הפרוטוקול צעד אחר צעד אשר הוקמה כדי להשיג שורשים מהונדסים גנטית שינה באמצעות . ריזוגנים. זה לקח כ 5-6 שבועות מן החיסונים של שחפת הזרעים לקציר של שורשים שעירים מזוהה, וכמה צעדים מרכזיים מתוארים באיור 1 (A-H). בקצרה, זרעים מעוקר הפגיז חוסנו (איור 1B) כדי להשיג נביטה סטרילי מהירה יותר. (איור 1ד) ו -exzoגנים יש להפעיל ומוכן מראש, בהתאמה. זה מלווה כמה שלבים מרכזיים, כולל זיהום של explants עם הופעל. ריזוזוגנים (איור 1E), coculture (איור 1F), ותרבות סלקטיבית (איור 1G). Explants נגועים צריך להיות ממוקם באופן שווה על המדיום MS בינונית ומרחב חייב להישמר ביניהם כדי להפריד בקלות את קווי הטרנסגניים שונים. שורשים שעירים מופיעים עם צבע לבן רך באופן plagiotropic באתרי הפצע של explants (איור 1H). השורשים השעירים בצורה מאוד מסומסת ומטריצה משולבת וניתן להפיץ כנדרש (איור 1I). שורשים שעירים שנקטפו ניתן להשתמש כדי לחקור את הפונקציה גנים או גנים-או חלבון-האינטראקציה חלבון. לחילופין, שורשים שעירים TB יכול להיות מופץ באופן מאסיבי כדי להניב מטבוליטים משניים כגון רוטין ב bioreactors חקנים ייעודיים.
השיטה כדי לגרום שורשים שעירים טרנסגניים ב-TB כבר תימוכין באמצעות וקטור בינארי (pK7GWIWG2D (II)) נושאת את הגנים gfp ו b4 (חבר של הגורם הטרנסקריפטלי משפחה bhlh , טרם פורסם). הגן העיתונאי Gfp שימש בקלות להבחין השורשים השעירים שעירות מן האלה שאינם טרנסגניים על ידי להמחיש את האות תחת כחול/אור אולטרה סגול כפול טרנסמאיר (איור 2) או על ידי זיהוי הגן היעד (איור 3). השורשים השעירים שהפכו הציגו זריחה ירוקה כאשר מואר תחת אור כחול או אולטרה סגול (מיוצג באמצעות ראשי חץ שחורים באיור 2א), ואילו שורשי שעירים לא השתנה לא הציג את הזריחה הירוקה (איור 2ב). שורשים שעירים עם אות GFP גבוה הופץ למשך שבועיים, כפי שמודגם באיור 2ג.
כדי לזהות אם הווקטור הבינארי השתנה בהצלחה לגנום השחפת, מזהי הגנים נערכו. בקצרה, הצמח DNA גנומית של שורשים שעירים TB היה מוכן ניתוח PCR המבוסס על שיטת CTAB שונה25. ה-PCR התבצע על ידי הגברה של הגנים (Kan, gfpו- b4), שהיה נוכח באיור 3, בהתאמה. . התחל מופיע בשולחן 2 הנוכחות של 3 גנים בכל הקווים הטרנסגניים (איור 3, נתיבים 5 – 11) הראו כי וקטור בינארי כבר הפכה בהצלחה הגנום TB. קן ו- gfp היו נעדרים בשורשים מסוג פראי (איור 3, ליין 3) ושליטה שלילית ניסויית (איור 3, ליין 4), בעוד b4 זוהה בשורשים סוג פראי. אלה 3 גנים היו ללא ספק הוצגו בשליטה חיובית (איור 3, ליין 2) אבל היו כנראה נעדרים בשליטה שלילית (איור 3, ליין 4).
הערכה של שעתוק המושרה גורם FtMYB116 בשחפת באמצעות מערכת השורש האמור השעיר
FtMYB116 התבטא על ידי שימוש בפרוטוקול הנ ל של אינדוקציה שעירה. זה הושג על ידי מראש להכניס את הגן FtMYB116 לתוך וקטור בינארי pK7WG2D ולאחר מכן מדביק עם . ריזוזוגנים כדי להשיג ביטוי גנטי היתר. בקצרה, שורשים שעירים של 0.1 g הפכו לאבקה עדינה באמצעות חנקן נוזלי. סך RNA הופק על ידי ביצוע הוראות היצרן של הצמח RNA בידוד ערכת26. לאחר מכן שעתוק הפוכה pcr ו-pcr בזמן אמת בוצעו כדי להגביר FtMYB116 ו רוטין סינתזה מסלול הגנים הקשורים. לאחר מכן את ההשפעות הרגולטוריות של FtMYB116 על רוטין סינתזה הקשורים ביטוי גנים והתשואה של רוטין אומתו.
איור 4A מראה את הביטוי היחסי של FtMYB116 בשורות הטרנסגניים של שורשים שעירים TB. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הביטוי היחסי של FtMYB116 הציג גידול ניכר בכל 3 הקווים הטרנסגניים העצמאיים. איור 4B ואיור 4ג להמחיש את הקידום של ביוסינתזה של רוטין ו קוורצטין ברמת מטבולית באמצעות FtMYB116 overexpression. התוכן של רוטין ו קוורצטין ב טרנסגניים היו באופן משמעותי (p < 0.01) גדל לעומת אלה בסוג פראי, להגיע 40 ו 0.5 mg/g FW, בהתאמה, אשר היו 8 פעמים אלה בסוג פראי. הביטויים הגנים היחסיים של CHS, F3H, F3'Hו- fls בכל 3 הקווים הטרנסגניים היו גבוהים במידה ניכרת מאלה בקבוצת הביקורת (איור 4ד). יחד, תוצאות אלה אישרו כי האסטרטגיה המתוארת במחקר זה יכול לשמש בהצלחה כדי ליצור טרנספורמציה שעירה שעיר בשחפת ולחקור את ביטוי הגנים ואת התשואה המטבולית של מטבוליטים משני.
איור 1: תהליכים כדי לזרז את השורשים-מתווךשורשים שעירים בשחפת. תמונות מייצגות של שלבים קריטיים מוצגות: (A1) ו-(A2) מייצגים לפני ואחרי קילוף מעילי הזרעים; (ב) מייצג כל 10 זרעים מחוסן בבקבוק רקמה המכיל mssa בינונית; (ג) מציין את שתילי השחפת ב -7 – 10 ימים לאחר החיסון, וראשי החצים האדומים מראים את נקודות החיתוך; (ד) ו-(ה) מציינים את הכנת ה . ריזוזוגנים (OD600 = 0.5) והדלקת של האקסוצמחים, בהתאמה; (ו) ו-(ז) מסמלים Coculturing עם הופעל. ריזוגנס על mssaas בינוני ו בררני culturing על מדיום mssack, בהתאמה; שורשים שעירים מגיחים (H), כפי שמוצג על ידי ראשי החצים שחורים; ו-(I) מציג את התפשטות המבנה השורש השעיר; ראשי החצים השחורים מצביעים על השורשים השעירים המושרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טרנספורמציה של הווקטור הבינארי הנושאת את הגן העיתונאי Gfp . (א) מציין את השורשים השעירים המושרה לאחר תרבות סלקטיבית שנבדקה תחת כחול/אור אולטרה סגול כפול ממאיר. (ב) ו-(ג) לייצג השורש סוג פראי והתפשטות של שורשים שעירים השתנה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ה-PCR הגברה של גנים (קן, gfp, b4) מ-DNA גנומית מבודדים משורש סוג פראי שורשים שעירים של TB ב 7 קווים טרנסגניים עצמאיים. (א): קן, (ב): gfp, (ג): b4. ליין 1: סמנים בגודל מולקולרי (ראש חץ לבן מציין 750 bp), ליין 2: פלאמיד (וקטור בינארי PK7GWIWG2D (II) נושאת קן, gfp, ו b4 גנים) כמו שליטה חיובית, ליין 3: פראי סוג השורש, נתיב 4: מטוהרים H2O כפקד שלילי, ונתיבים 5 – 11: 7 הקווים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הביטוי היחסי של FtMYB116 בקווים הטרנסגניים של שורשים שעירים TB. (א) והאפקט הקדם-מקדם של ביטוי היתר של FtMYB116 על ביוסינתזה של (ב) רוטין ו (ג) קוורצטין (איור זה שונה מדונג et al.5). ניסויים נערכו בטריליטה ונערכו 3 פעמים. "* *" מציין הבדל משמעותי ב-p < 0.01 שימוש ב- t-Test של סטודנט. (ד) ביטוי של גנים הקשורים למסלולי סינתזה פלונואיד בקווים טרנסגניים. רמת הביטוי היחסי היתה מנורמלת לזה של פקד אקטין. נתונים מוצגים כ-± סטיית תקן (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דיה | מרכיבים בינוניים | ||
| MSSA | מורראשיג ו Skoog (MS) בינונית המכילה סוכות ב 30 g/L, ואת האבקה אגר ב 7 g/L, pH 5.8 | ||
| ברים | שמרים Mannitol בינונית (אייב) המכיל אבקה אגר ב 15 g/L, גריסופלובין ב 50 mg/L, ו spectinomycin ב 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| מיכל ביבריס | המכיל גריסופלובין ב 50 mg/L, ו spectinomycin ב 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| מזהה הקובץ | MS בינונית המכילה סוכרוז ב 30 g/L, ו acetosyringone (AS) ב 300 μM, pH 5.8 | ||
| MSSAA | MS בינונית המכילה סוכות ב 30 g/L, אבקה אגר ב 7g/L, כמו ב 100 μM, pH 5.2 | ||
| מיכל שווק | MS בינונית המכילה סוכות ב 30 g/L, אבקה אגר ב 7 g/L, cefoסעה ב 500 mg/L, ו kanamycin (kan) ב 50 mg/L, pH 5.8 | ||
| המשך הקובץ | MS בינונית המכילה סוכרוז ב 30 g/L, ו-kan ב 50 mg/L, pH 5.8 | ||
שולחן 1: מדיה ומרכיבים שלהם.
| פריימר | רצף (5 '-3 ') | |
| מבעלי מגנפ | מדריך הגנה | |
| מחקר ופיתוח | ליאת מאור | |
| b4-F | לינה לוי | |
| b4-R | מיכל כנעני | |
| קאן-F | מיכל כנעני | |
| קן-אר | TGAATCCAGAAAAGCGGCCA | |
שולחן 2: רצף פריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TB נעשה שימוש בכמה מחקרים הקשורים מטבוליטים משני ברמות גנטיות ומטבולית1,2,5,27,28. תרבות שורש שעירים, כמקור ייחודי עבור ייצור מטבוליזם, ממלא תפקיד מרכזי בהנדסה מטבולית29 והוא יכול לשמש כדי לשנות מסלולים מטבוליים על ידי החדרת הגנים הקשורים. קים ואח '2 הציגה בתחילה את הקמת תרבויות שורש של שחפת על ידי. ריזוגנס-בתיווך השינוי כדי להשיג את הייצור של תרכובות פנופילית. התוכן של רוטין שהם השיגו בשורשים שעירים TB היה גבוה פי 10 יותר מזה בשורשים סוג פראי. במחקר הנוכחי, המבוא של FtMYB116 הובילו לביטוי גבוה יותר של גנים הקשורים רוטין והוביל את הייצור של רוטין בשורשים שעירים TB. טכניקה זו אושרה להיות מתאים לאפיון פנוטימית וביטוי של גנים הקשורים פנילפרואיד כגון FtF3H ו ftfls ב שורש השורשים שעירים5,30,31. ג'אנג ואח '32 בשימוש שורשים שעירים בשחפת לחקור את הייצור של רוטין על ידי הבעת יתר של סדרת ftmyb גורמים הטרנססקריפט. ג'ואו et al.33 נצפתה ירידה בתוכן של רוטין בשל הבעות יתר של FtMYB11 ב שורשים שעירים TB. תוצאות אלה יחד עם הממצאים שלנו מצביעים על ההשפעות הריאלי של השינוי השורש השעיר על האינטראקציה בין ftmyb הטרנססקריפט הגורמים ו רוטין הקשורים בביוסינתזה גנים.
למרות שיש נתונים מוגבלים לגבי פרוטוקול צעד אחר צעד עבור אינדוקציה של שורשים שעירים של שחפת, אנו מתארים זאת בפרוטוקול צעד אחר צעד בפעם הראשונה כדי לקבל שורשים השעירים של TB באופן יעיל ויציב באמצעות . ריזוגנים נושא וקטור בינארי. במהלך תהליכים ניסיוניים אלה, גורמים רבים צריכים להיחשב בזהירות כדי להשיג את השורשים השעירים האופטימלי המושרה. ראשית, הבחירה של explants היא גורם מקובע. זנים של TB ידועים להשפיע על המבנה של שורשים שעירים וייצור תרכובות פנופילית. Thwe ואח '30 מומחש הביטוי הגנטי במסלול הביוסינתטי פנילפרואיד והתוכן של תרכובות פנוטיות מגוונות בין זנים שחפת. הם מצאו גם שורשים שעירים בזנים אחד, אשר היה עמוק אדמדם סגול בשל אנאוקיאנין התוכן13. במחקר שלנו, 2 רק פסיגי והיפוקוטילס נבחרו כמו explants. הסיבה לכך היא צעיר ועדין עוזב את הטובה הגבוהה אינדוקציה שורש גבוה שיעור2,30, בעוד מאוד הבדיל בתאי צמח הישן להשפיע לרעה את השורש השעיר. שנית, הנבג של הגנים יש השפעה משמעותית על אינדוקציה השורש השעיר. זנים חיידקיים שונים התערוכה יכולות שונות שינוי במונחים של מורפולוגיות ויעילות אינדוקציה של שורשים שעירים, אשר יכול להיות מואר על ידי הפלמידים שונים הרעממו על ידי זנים34. איי ואח '.35 לעומת ההשפעות של מספר זנים. ריזוגנים (R1000, R1200, 15834, LBA9402, ו-A4) על שחפת השראה השורש והביוסינתזה phenylpropanoid ומצא כי המאמץ המבטיח ביותר לייצור שורש שעיר בשחפת היה R1000. ממצא זה נתמך על ידי קים et al.2 עם זאת, המתח ACCC10060 כי היה נשלל במחקר של איי ואח '. אבל בשימוש במחקר שלנו הציגו יעילות זיהום משביע רצון. המראה הלבן פלאפי של שורשים שעירים השיג באמצעות הפרוטוקול שלנו הוא בהסכמה עם שורשי שעירים שנוצר מרווה miltiorrhiza36, שבו אותו זן ACCC10060 נושאת pK7GWIWG2D וקטור בינארי (II) שימש כדי להשתיק את הגן היעד. שלישית, degerming כולל טיפול מקדים של חומרים וריכוז של cefoסעה בתרבות סלקטיבית גם לשחק תפקידים חיוניים בעלי השורש השעיר. חיטוי לא שלם בכל שלב יכול להוביל לכישלון של שינוי שורש שעיר. בנוסף, לריכוז החיידקי יש השפעה משמעותית על הפקת שורשים משתנים. ריכוז גבוה עשוי להפחית את התאים הצמחיים על ידי עיכוב תחרותי, בעוד ריכוזים נמוכים עלול לגרום לזמינות נמוכה4.
יתר על כן, מצבי התרבות כגון בינוני הגדילה, המתאים הזמן לקדם וה, וגורמים ביוטיים או אביוטיים אחרים לשחק תפקיד חשוב ב השראה השורש השעיר. Huang et al.37 מומלץ 1/2 MS בינונית המכילה סוכות בריכוז של 30 g/L עבור טיפוח להשיג שורשים מקסימלית שעיר TB. זה יכול להיות מוסבר על ידי המדיום מלח גבוה כי הוא מתאים היווצרות שורש שעיר, ואילו נמוך מלח בינוני מעדיף כפל מופרז בקטריאלי34. כפי שהוא סוג של תרכובת פנופילית שיכולה להקל על הטרנספורמציהבתיווך במספר מינים צמחיים על ידי תמלול של האזור הביר של agrobacterium34,38, ו vir יכול להיגרם באופן יעיל במדיום עם pH של < 5.739,40. לכן, אנו ממליצים מדיום coculture עם pH 5.2 שיושלם עם 100 μM של AS. Huang et al.37 דיווח כי שורשי שחפת השעיר הפכו לחומים אחרי יום 24 מלבן וצהוב בהיר. לכן, הם משנה שורשים שעירים כל 24 ימים; עם זאת, אנו ממליצים על הרכבת כל שבועיים כדי להימנע בראונינג שורשים שעירים. בנוסף, תנאים סביבתיים כגון אור, הורמונים, טמפרטורה, קרינה UV מופיעים להשפיע על הביטוי של הגנים ביוסינתזה ביולוגי הקשורים על ידי מאוד מעורר או41מדכא אותות התמרה 41,42. המחקר הקודם הוכיחה את המשמעות של האור האדום הרחוק ניטור rutin הקשורים ביטוי גן ב שורשים שעירים של שחפת5.
The . ריזוזוגנים-מתווכתהטרנספורמציה יש את היתרון כי כל גן אקסוסוגני של עניין הוכנס וקטור בינארי ניתן להעביר את שיבוט שיער שעיר שינוי34 כדי להשיג ביטוי יתר, אובדן של פונקציה באמצעות RNA השתקה43, או גילוי של גנים מטבוליים חדשים על ידי ניתוח הטרנססקריפט5. שורשים שעירים יש פוטנציאל גדול לייצר מטבוליטים משניים, רקומביננטי חלבונים, ואפילו הנוגדנים44. זה בעיקר בשל הצמיחה הקלה והמהירה שלהם במדיום ללא הורמון, להיות יקר פחות, אין דרישה להתחדשות לתוך צמחים מלאים21, ואת התשואה הגבוהה יחסית של מטבוליטים משניים לעומת זאת מן הצמח מתחיל חומר31. שורשים אלה יכולים גם להיות מופרדים מן ההסבר המקורי כדי ליצור לטווח ארוך, יציב, ומאופיין שיבוטים שמירה על הקיבולת הביוסינתטית שלהם פנוטיפים. בסך הכל, בהתבסס על ממצאים אלה, פרוטוקול זה מספק מהירה, ברורה, שיטה יעילה כדי לייצר שורשים שעירים שונה לחקור את הייצור של מטבוליטים משני ומעביר התייחסות השורשים שעירים בצמחים אחרים. עם זאת, הפוטנציאל לחקור תרבויות שורש שעירים כדי ליצור תשואות מסיבי של תרכובות אקטיביים תלוי במערכת מתאימה ביוריאקטור חקן שבו פרמטרים מסוימים כגון אספקת החמצן חייב להיות מודאג4,8. פרוטוקול זה מוגבל לייצור מטבוליטים משני נגזר שורשים שעירים לחקור את הפנוטיפ של גנים פונקציונליים כגון שונות של צבע ואת התוכן של מטבוליטים משניים; עם זאת, השינויים פנוטיפקס במפעל כולו ללא תלות בידור של צמחים מחדש מן השורשים שעירים לא ניתן להעריך במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו תמכה בקרנות המחקר הבסיסיות של מכוני מחקר בתחום הרווחה המרכזית ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
