Summary
Описываем метод индуцирования волосатых корней агробактериями ризогенов-опосредованногопреобразования в тартарной гречке(Fagopyrum tataricum). Это может быть использовано для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов в тартарной гречихе, быть принятым для любой генетической трансформации, или использоваться для других лекарственных растений после улучшения.
Abstract
Тартарная гречка (ТБ) -Фагопирум татарикум (L.) Gaertn) обладает различными биологическими и фармакологическими видами деятельности, поскольку содержит обильные вторичные метаболиты, такие как флавоноиды, особенно рутетин. Агробактерии rhizogenes постепенно используются во всем мире, чтобы вызвать волосатые корни в лекарственных растений для исследования функций генов и повышения урожайности вторичных метаболитов. В этом исследовании мы описали подробный метод для создания A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни при туберкулезе. Cotyledons и hypocotyledonary соты на 7-10 дней были выбраны в качестве explants и инфицированных A. rhizogenes проведения бинарного вектора, который индуцированных приключений волосатые корни, которые появились после 1 недели. Генерируемая трансформация волосатых корней была определена на основе морфологии, отбора резистентности (канамицин) и экспрессии генов репортера (зеленый флуоресцентный белок). Впоследствии, преобразованные волосатые корни были самораспространены по мере необходимости. Между тем, миелобластоз (MYB) транскрипционный фактор, FtMYB116, был преобразован в геном тб с помощью A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни для проверки роли FtMYB116 в синтезации флавоноидов. Результаты показали, что экспрессия генов, связанных с флавоноидами, и урожайность флавоноидных соединений (рутина и кверцетина) были значительно (p qlt; 0.01) способствовали FtMYB116, что свидетельствует о том, что A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корни могут быть использованы в качестве эффективного альтернативного инструмента для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов. Подробный пошаговый протокол, описанный в данном исследовании для генерации волосатых корней, может быть принят для любой генетической трансформации или других лекарственных растений после корректировки.
Introduction
Тартарная гречка (ТБ)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) является одним из видов дикотипидона, относящихся к роду Фагопирум и семейство Polygonaceae1. Как вид гомологионной пищи китайской медицины, ТБ получает значительный интерес благодаря своему характерю химического состава и разнообразной биоактивности против болезней. Туберкулез в основном богат углеводами, белками, витаминами и каротиноидами, а также полифенолами, такими как фенольные кислоты и флавоноиды1. Продемонстрировано различные биологические и фармакологические свойства флавоноидов, в том числе антиоксидативные, антигипертензивные2и противовоспалительные, а также противораковые и антидиабетическиесвойства.
Agrobacterium rhizogenes является бактериейпочвы,которая способствует развитию волосатых корнеплодов в нескольких высших растений, особенно dicotyledons, путем заражения раны сайтов4,5. Этот процесс инициируется передачей T-ДНК в корневой плазмид(Ri) плазмид 5,,6 и обычно сопровождается интеграцией и экспрессией экзогенного гена из плазмида Ri и последующими шагами генерации волосатого фенотипа корня7. A.rhizogenes-опосредованные трансгенные волосатые корни, как мощный инструмент в области биотехнологии растений, наиболее широко используются благодаря их стабильной и высокой производительности и легкому получению в короткий период. Кроме того, волосатые корни, индуцированные A. rhizogenes эффективно отличаются их плагиотропного развития корня и высоко ветвления роста в гормон-свободной среде8. Они могут быть использованы в нескольких областях исследований, в том числе искусственного производства семян, исследования корневых узелков, а также при изучении взаимодействия с другими организмами, такими как микоризные грибы, нематод, и корнеплоды7,9. Кроме того, волосатые культуры преобразования корней широко используются в качестве экспериментальной системы для исследования биохимических путей и химической сигнализации и для производства вторичных метаболитов растений, которые используются в качестве фармацевтических препаратов, косметики и пищевых добавок8,10. Ценные вторичные метаболиты, в том числе индоле алкалоиды, акониты, тропановые алкалоиды, терпеноиды и флавоноиды, синтезированные в волосатых корнях дикого типа, были исследованы в течение нескольких десятилетий у многочисленных2,видов, таких как ginsenoside в panax ginseng11, кумарин в Am majmius12, и phenolic compounds.
Волосатые корни были произведены с использованием A. rhizogenes в 79 видов растений из 27 семейства14. Например, A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корня преобразование было сообщено в сое15,16, Сальвиа17, Пламбаго Indica18, Lotus japonicus19, и цикорий (Cichorium intybus Л.) 20. ТБ волосатые преобразования корня также были исследованы2. Немногие подробные протоколы доступны в отношении развития волосатые корни при посредничестве A. rhizogenes либо проведение бинарный вектор или нет. Например, Sandra et al.21 внедрили метод производства трансгенных картофельных волосатых корней, выдержанный в побегах дикого типа. Полностью развитые волосатые корни могут быть визуализированы через 5-6 недель после инъекции А. ризогенов, несущих ген gus reporter в стволовые межузлы картофельных растений. Другое исследование также сообщило трансгенной волосатой корневой системы, индуцированной A. rhizogenes укрывательство гена репортера gusA в джуте (Corchorus capsularis L.) 22. Кроме того, Supaart et al.23 получили трансгенные табачные волосатые корни с использованием A. rhizogenes, преобразованного с помощью экспрессионного вектора pBI121, несущего ген синтазы 11-тетрагидроканнабиноловой кислоты (ТГКА) для производства ТГКА.
Однако поэтапный процесс эффективного поколения трансформации волосатых корней, особенно при тб-тбе, был относительно менее продемонстрирован. В этом исследовании, мы описали подробный протокол с использованием A. rhizogenes проведения репортер гена (GFP), селективный маркер (Кан), и ген интереса (b4, определены из нашей группы, но неопубликованный ген из основных селип-петля-сhelix (bHLH) семьи) для создания волосатых корней генетической трансформации при туберкулезе. Эксперимент длился 5-6 недель, от прививки семян до генерации волосатых корней, включая препарат эксплантации, инфекцию, сокультивирование, субкультирование и последующее распространение. Кроме того, A. rhizogenes, содержащий бинарную плазмиду, несущую тб-трансген транскрипционного фактора миелобластоза 116 (FtMYB116),был использован для определения того, может ли FtMYB116 способствовать накоплению флавоноидов, особенно рутения, в туберкулезе на гене и метаболическом уровне через тб-волосатую трансформацию корня. FtMYB116, который является светоиндуцированным транскрипционным фактором, регулирует синтез рутения при различных условиях света5. Синкон синтаза (CHS), флаванон-3-гидроксилаза (F3H),флавоноид-3'-гидроксилаза (F3'H), и флавонол синтаза (FLS)24 являются ключевыми ферментами, участвующими в метаболический путь биосинтеза рутина. Таким образом, это исследование демонстрирует переэкспрессию FtMYB116 в ТБ волосатые корни и экспрессия ключевых генов фермента, а также содержание рутения и других флавоноидов, таких как кверцетин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Туберкулез, используемый в этом исследовании, был назван BT18, который возник из породы "Цзиньцзяо No 2", культивируемой Исследовательским центром малого разного зерна Академии сельскохозяйственной науки Шаньси. Основные этапы этого протокола иллюстрируются на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа explants связанных манипуляций быстро, и, когда это возможно, держать Петри блюда закрыты, чтобы избежать увядания и загрязнения. Если не указано иное, все эксплантные инкубации проводились при состоянии 14-х света и 10-х темного фотопериода при 25 градусах Цельсия. Если иное не указано, все explants- или бактерий, связанных операций были выполнены в асептических условиях в ламинарный капот потока. Все средства массовой информации ингредиенты для A. rhizogenes и in vitro культур растений предоставляются в таблице 1. После регулировки рН, все носители были автоматически заведомо при 120 градусах по Цельсию в течение 20 мин. Твердые носители были подготовлены путем заполнения 25 мл среднего в чашку Петри диаметром 9 см и позволяющие ему затвердеть.
ВНИМАНИЕ: Депозит все генетически модифицированные бактерии и растения в соответствующий контейнер отходов. Эксплуатировать все опасные химические вещества в дымовом шкафу и откладывать их в контейнер для опасных отходов.
1. Подготовка противотуберкулезных установок
- Подготовка семян туберкулеза
- Выберите пухлые и неповрежденные семена туберкулеза(рисунок 1A1),которые сохраняются при температуре менее 20 градусов по Цельсию в течение не более 2 лет.
- Замочите семена в воде при 28 градусах по Цельсию в течение примерно 20 минут, чтобы семя слоя можно было легко снять(рисунок 1A2). При необходимости используйте ножницы, чтобы вырезать слот на семена для облегчения пилинг.
- Стерилизация семян туберкулеза
- Поместите 100-200 очищенных семян в стерилизненую конильную колбу 100 мл.
- Дезинфицировать семена с помощью 75% этанола в течение 30 с.
- Замените этанол 5% гипохлорит натрия и дезинфицировать в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфекция с использованием бихлорида ртути в концентрации 1 г/л в течение 8 минут может быть использована в качестве альтернативного стерилизатора для замены гипохлорита натрия в любом случае недостаточной стерилизации.
ВНИМАНИЕ: Меркурий бихлорид является опасным, а не экологически чистый материал. Эксплуатировать его в дымящийся шкаф и сажать в контейнер для опасных отходов, если в любом случае используется ртуть бихлорид. - Вылейте гипохлорит натрия.
- Вымойте семена с помощью стерильной деионизированной воды 5 раз.
- Прожтели семена сухими стерильной бибулульной бумагой.
- Подготовка саженцев туберкулеза
- Подготовка 50 мл Мурашиге и Skoog (MS) базальной среде (1962) дополнены 30 г / л сахарозы и 7 г / l агар порошок (MSSA) (Таблица 1) в 300 мл растительной ткани бутылки.
- Отрегулируйте рН до 5.8 перед autoclaving.
- Распределите 10 семян равномерно на бутылку среды MSSA.
- Пронзите семена в культурном зале при 25 градусах Цельсия и 1 кв с при условии света в течение 7-10 дней.
- Приготовление стерильных эксплуатсов
- Выберите надежные саженцы туберкулеза(рисунок 1C), когда 2 части котиледона развернуты.
- Отрежьте саженцы от корней(Рисунок 1C красно-даковых наконечников стрел),избегая контакта со средой.
- Поместите их в стерильное блюдо Петри.
- Нарежьте гипокотилы на 0,8-1 см сегментами и стриги котиддоны примерно на 0,5 см.
- Прекультуры этих экскультуры на MSSA среды при условии света для 24 ч.
- Перенесите их в стерилизненую конильную колбу 100 мл, которая теперь готова к заражению.
2. Подготовка А. ризогенов для преобразования
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм A. rhizogenes ACCC10060 любезно предоставлен Институтом развития лекарственных растений и сохранен при 80 градусах Цельсия. A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором pK7GWIWG2D (II), который укрывает T-ДНК, несущий ген b4, сопровождающий ген GFP в качестве гена индикатора и ген ажиотажа сопротивления Кана в качестве выбираемого маркера. Ген b4 является членом семейства транскрипционных факторов bHLH, который еще не опубликован. Для оценки потенциала тб волосатых корней, A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором pK7WG2D, содержащим ген MYB116, чтобы исследовать его влияние на производство вторичных метаболитов, таких как флавоноиды на уровне экспрессии генов и путем метаболического анализа. Активированный A. rhizogenes должен быть хорошо подготовлен в то же время с explants.
- Активация а. ризогенов
- Оттепель А. rhizogenes на льду
- Опустите бактерии и выровняйте их равномерно на дрожжевой маннитол среды (YEB) дополнены 15 г / л агар порошок, 50 мг / л рифампицин, и 50 мг / л спектриномицин (YEBARS, рН 7.0).
- Инкубировать бактерии при 28 градусах по Цельсию в течение 12-16 ч.
- Выберите моноклональную колонию и культивайте ее в другом блюде Петри в том же вышеописанном ключе.
- Выберите моноклональные колонии и культуры их в 100 мл стерилизованной конической колбы, содержащей 20 мл среды YEB дополнены 50 мг / л рифампицин и 50 мг / л спектриномицин (YEBRS, pH 7.0) при 28 кс и 200 об/ и 200 об/ чем на 16-18 л, пока значение OD600 не достигнет 2.0.
- Инкубировать 2%-4% вышеупомянутой культуры в другой конической колбе калибра 100 мл, содержащей 20 мл среды YEBRS при 28 градусах Цельсия и 200 об/мин при 4-5 ч, пока значение OD600 не достигнет примерно 0,5(рисунок 1D).
3. Инфекция и скрининг на оргии
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого протокола состоит в том, чтобы получить генетически преобразованные волосатые корни. Корни дикого типа использовались в качестве отрицательного контроля для оценки трансгенного выражения. В этом протоколе, A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором либо pK7WG2D проведения гена FtMYB116 или pK7GWIWG2D (II) проведение гена b4 заранее.
- Отсрочка А. ризогенов
- Передача культуры, полученной в шаге 2.1.6, в стерилизную центробежную трубку мощностью 50 мл.
- Спин при 4000 х г в течение 10 мин при 20 градусах Цельсия.
- Удалите супернатант и повторно бактериальные гранулы с MS среды дополняется 30 г / l сахарозы и 300 мкм ацетосирингон (AS) (MSSAS, рН 5,8) до OD600 '0.2.
- Инфекция эксплантов
- Наполнить бактериальной подвеской, полученной в шаге 3.1.3 в коническую колбу, содержащую вылазывания, подготовленные в шаге 1.4.6 за 10 мин(Рисунок 1E).
- Выняйте экспланты и сужайте их с помощью стерильной бибулульной бумаги.
4. Культура экскультуры с A. rhizogenes
- Поместите стерильную фильтровальную бумагу диаметром 9 см на среде MS, которая затвердевает с помощью 7 г/л агар-порошка, дополненного сахарозой 30 г/л и 100 мкм AS (MSSAAS medium, pH 5.2).
- Наложение эксрастенив на фильтровальную бумагу при 25 градусах По Цельсия в течение 3 дней в темноте(рисунок 1F).
5. Индукционная и селективная культура
- Поместите приблизительно 20 инфицированных эксрастений на среду MSSA, дополненную 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина (Кан) (MSSACK, pH 5.8)(Рисунок 1G).
- Инкубировать их вертикально при состоянии света при 25 градусах Цельсия и 1 кв. м. Волосатые корни возникают примерно через 1 неделю после инкубации(рисунок 1H черно-дэшнс наконечники стрел указывают на появление волосатых корней).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заменить msSACK среды каждые 15 дней, если это необходимо.
6. Субкультирование ТБ волосатые корни
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура направлена на сбор энергичных волосатых корней. Регулярно наблюдайте за ростом волосатых корней во время распространения и своевременно удаляйте загрязненные и инактивированные корни. При необходимости повторите следующие шаги, чтобы распространить более волосатые корни. От субкультивирования до сбора урожая уходит примерно 10-14 дней.
- Выберите волосатые корни, показывающие белый вид и быстрый рост.
- Нарежьте их на кусочки 2-3 см.
- Очевидно, число их на чистой скамейке.
- Субкультура их в 100 мл стерилизованной конической колбы, содержащей 5 мл MS среды дополнены 30 г / л сахарозы и 50 мг / л Кан (MSSK, рН 5,8) на роторной скорости 80 об/ ч при 25 градусов по Цельсию в темноте, пока они не распространились на дно колбы (Рисунок 1I).
7. Определение трансформированных волосатых корней и сохранение
ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразованные волосатые корни могут быть определены на основе аспектов морфологии и уровня генов. Идентификация также может проводиться в соответствии с волосатым геномом корня и сопротивлением, которые не охвачены в этом протоколе. Эта процедура в первую очередь фокусируется на гене репортера и идентификации гена.
- Удалите рыжие и загрязненные волосатые корни и выберите те, с белой внешностью.
- Оцените, есть ли зеленая флуоресценция под синим/светлым двойным ультрафиолетовым трансиллюминолором.
- Выберите волосатые корни, демонстрирующие сильный сигнал флуоресценции в пронумерованных трубках или завернутые с помощью отмеченной фольги после высыхания их с абсорбирующей бумагой.
- Лиофилизируют их в жидком азоте, а затем хранили весь урожай при 80 градусах По Цельсию для дальнейшего исследования.
- Идентификация гена
- Тритуруировать 0,1 г волосатых корней в мелкий порошок в жидком азоте.
- Подготовьте геномную ДНК независимых трансгенных линий туберкулеза с использованием модифицированного метода бромистого цетилтриметилламмония (CTAB)25 в соответствии с инструкцией производителя набора геномной ДНК растений.
- Выполните полимеразы цепной реакции (PCR) с использованием 100 нг геномных шаблонов ДНК и праймеров, перечисленных в таблице 2.
- Выполните цикл усиления следующим образом: предденатурация при 94 градусах по Цельсию в течение 5 мин, денатурация при 94 градусах по Цельсию на 30 с, грунтовка при 55 градусах По Цельсию на 30 с и грунтовка при 72 градусах по Цельсию на 30 с. После 36 циклов и заключительного шага расширения на 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут, проанализируйте продукты усиления на 1% гелей агарозы.
- Пятно гели с нуклеиновой кислотой окрашивания и визуализировать их под ультрафиолетовым светом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-опосредованный ТБ волосатые корня преобразования
Это исследование описывает пошаговое протокол, который был создан для получения генетически преобразованных волосатых корней с использованием A. rhizogenes. Потребовалось около 5-6 недель от прививки семян туберкулеза до сбора выявленных волосатых корней, и некоторые ключевые шаги изображены на рисунке 1 (A-H). Кратко, стерилизованные shellized семена были привиты(рисунок 1B)для достижения более быстрого стерильного врастворения. A. rhizogenes (рисунок 1D)и стерильные экспланты должны быть активированы и подготовлены заранее, соответственно. За этим следуют некоторые ключевые шаги, в том числе заражение эксрастенив активированными А. ризогенами (рисунок 1E),кокультурой(рисунок 1F),и селективной культурой(рисунок 1G). Зараженные экспланты должны быть равномерно размещены на затвердевшей среде MS и пространство должно быть сохранено между ними, чтобы легко отделить различные трансгенные линии. Волосатые корни появляются с пушистым белым цветом в плагиотропной манере в местах раны explants(Рисунок 1H). Волосатые корни образуют высоко разветвленную и взаимосвязанные матрицы и могут распространяться по мере необходимости(рисунок 1I). Собранные волосатые корни могут быть использованы для исследования функции гена или гена или взаимодействия белка-белка. Кроме того, ТБ волосатые корни могут быть массово распространены для получения вторичных метаболитов, таких как рутева в назначенных биореакторов.
Метод индуцирования трансгенных волосатых корней при туберкулезе был обоснован с помощью бинарного вектора(pK7GWIWGG2D (II)с генами GFP и b4 (член транскрипционного фактора bHLH семьи, еще не опубликованный). Репортер ген GFP был использован, чтобы легко отличить трансгенные волосатые корни от нетрансгенных, визуализируя сигнал под синим / светом двойной ультрафиолетовый транслиминатор (Рисунок 2) или путем определения целевого гена (Рисунок 3). Преобразованные волосатые корни продемонстрировали зеленую флуоресценцию при освещении под синим или ультрафиолетовым светом (представлены с помощью черных наконечников стрел на рисунке 2А),в то время как непреобразованные волосатые корни не демонстрировали зеленую флуоресценцию(рисунок 2B). Волосатые корни с высоким сигналом GFP распространяются в течение двух недель, как показано на рисунке 2C.
Для дальнейшего определения того, успешно ли бинарный вектор трансформировался в геном туберкулеза, были проведены идентификационные данные генов. Короче говоря, геномная ДНК тб волосатых корней была подготовлена для ПЦР-анализа на основе модифицированного метода CTAB25. ПЦР был выполнен путем усиления генов(Kan, GFPи b4), который присутствовал на рисунке 3,соответственно. Праймеры перечислены в таблице 2. Присутствие трех генов во всех трансгенных линиях(рисунок 3,полосы 5-11)показало, что бинарный вектор был успешно преобразован в геном туберкулеза. Кан и GFP отсутствовали в корнях дикого типа(рисунок 3, переулок3)и экспериментальном отрицательном контроле(рисунок 3,переулок 4),в то время как b4 был обнаружен в корнях дикого типа. Эти 3 гена, несомненно, были представлены в положительном контроле(Рисунок 3,полоса 2), но, по-видимому, отсутствует в отрицательном контроле(рисунок 3, полоса4).
Оценка светоиндутого транскрипции фактора FtMYB116 при ТБ с использованием вышеупомянутой волосатой корневой системы
FtMYB116 был выражен с использованием вышеупомянутого протокола волосатые индукции корня. Это было достигнуто путем предварительной вставки гена FtMYB116 в двоичный вектор pK7WG2D, а затем заражая A. rhizogenes для достижения генной переэкспрессии. Вкратце, волосатые корни 0.1 g были triturated в мелкий порошок с помощью жидкого азота. Всего РНК была извлечена в соответствии с инструкциями производителя завода РНК изоляции комплектазолп 26. Затем были выполнены Обратный транскрипции ПЦР и ПЦР в реальном времени для усиления FtMYB116 и синтеза пути, связанного с генами. Впоследствии были проверены регулятивные эффекты FtMYB116 на экспрессию генов, связанных с синтезом рутена, и выход рутения.
На рисунке 4А показано относительное выражение FtMYB116 в трансгенных линиях тб волосатых корней. По сравнению с контрольной группой, относительное выражение FtMYB116 продемонстрировало значительное увеличение всех трех независимых трансгенных линий. Рисунок 4B и Рисунок 4C иллюстрируют продвижение биосинтеза рутения и кверцетина на метаболическом уровне через переэкспрессию FtMYB116. Содержание рутения и кверцетина в трансгенных были значительно(p qlt; 0.01) увеличилось по сравнению с теми, в диком типе, достигнув 40 и 0,5 мг/г FW, соответственно, которые были в 8 раз больше, чем в диком типе. Относительные экспрессии генов CHS, F3H, F3'Hи FLS во всех 3 трансгенных линиях были на удивление выше, чем в контрольной группе(рисунок 4D). Вместе эти результаты подтвердили, что стратегия, описанная в данном исследовании, может быть успешно использована для генерации волосатых корневых преобразований при туберкулезе и исследования экспрессии генов и метаболической урожайности вторичных метаболитов.
Рисунок 1: Процессы по индуцированию А. ризогенов-опосредованного трансгенных волосатых корней при туберкулезе. A. rhizogenes Отображаются репрезентативные изображения критических этапов: (A1)и (A2)представляют до и после отслаивания семян пальто; (B) представляет каждые 10 семян, привитых в бутылке ткани, содержащей msSA среды; (C) обозначает саженцы туберкулеза на 7-10 дней после прививки, и красно-дневки стрелки показывают точки резки; (D)и (E) указывают на препарат A. rhizogenes (OD600 и 0.5) и инфекцию эксплантированных растений, соответственно; (F)и (G) символизируют coculturing с активированными A. rhizogenes на msSAAS средств и селективного культивирования на среде MSSACK, соответственно; волосатые корни возникают из (H) , как показано на черно-тире стрелы; и(Я) показывает распространение волосатого образования корня; черно-тире стрелы указывают на индуцированные волосатые корни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Преобразование бинарного вектора, несущего ген репортера GFP. (A) обозначает индуцированные волосатые корни после селективной культуры рассматривается под синий / свет двойной ультрафиолетовый трансиллюминатор. (B)и (C) представляют корень дикого типа и распространение преобразованных волосатых корней, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: ПЦР усиление генов(Kan, GFPи b4) из геномной ДНК, выделенной из корней дикого типа и волосатых корней туберкулеза в 7 независимых трансгенных линиях. (A): Кан, (B): GFP, (C): b4. Полоса 1: молекулярный размер маркеров (белая стрелка указывает 750 bp), полоса 2: плазмид (двоичный вектор pK7GWIWG2D (II) проведение Кан, GFP, и b4 генов) в качестве положительного контроля, полоса 3: дикий корень типа, полоса 4: очищенный H2O как отрицательный контроль, и полосы 5-11: 7 независимых трансгенных линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Относительное выражение FtMYB116 в трансгенных линиях ТБ волосатые корни. ()и стимуляторэффект переэкспрессии FtMYB116 на биосинтез (B) рутетки и (C) кверцетин (Эта цифра была изменена из Донг и др.5). Эксперименты проводились в тройном и проводились 3 раза. "Я" указывает на существенную разницу в p lt; t0.01 с помощью студенческая t-test. (D) Выражение генов, связанных с флавоноидным синтезом путей в трансгенных линий. Относительный уровень выражения был нормализован до уровня контроля актина. Данные представлены в виде среднего стандартного отклонения (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Носителя | Средние ингредиенты | ||
| MSSA | Мурашиге и Skoog (MS) среда, содержащая сахарозу в 30 г/ л, и агар порошок в 7 г/ л, рН 5,8 | ||
| ЕБАРС | Дрожжи Маннитол Средний (YEB), содержащий порошок агара на 15 г/л, рифампицин на 50 мг/л, и спектромицин при 50 мг/л, рН 7.0 | ||
| YEBRS | YEB, содержащий рифампицин при 50 мг/л и спектромицин при 50 мг/л, рН 7,0 | ||
| MSSAS | МС-среда, содержащая сахарозу на уровне 30 г/л, и ацетосирингон (AS) при 300 мкм, рН 5,8 | ||
| MSSAA | МС-среда, содержащая сахарозу на уровне 30 г/л, агар-порошок при 7 г/л и AS при 100 мкм, рН 5,2 | ||
| МССАК | MS среда, содержащая сахарозу на 30 г/ л, агар порошок на 7 г / л, цефотаксима на 500 мг / л, и канамицин (кан) на 50 мг/ л, рН 5,8 | ||
| МССК | MS среда, содержащая сахарозу на 30 г / л, и кан на 50 мг / л, рН 5,8 | ||
Таблица 1: Средства массовой информации и их ингредиенты.
| Грунтовка | Последовательность (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Кан-Ф | ATTCCTATTACTGGGGGGGCAC | |
| Кан-Р | ТГААТКАГААААГКГККККА | |
Таблица 2: Последовательность праймеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Туберкулез был использован в нескольких исследованиях, связанных со вторичными метаболитами на генетическом и метаболических уровнях1,,2,,5,,27,,28. Волосатые корневой культуры, как уникальный источник для производства метаболита, играет ключевую роль в метаболической инженерии29 и может быть использован для изменения метаболических путей путем вставки связанных генов. Ким и др.2 первоначально ввели создание ТБ волосатые корневые культуры A. rhizogenes-опосредованноепреобразование для достижения производства фенольных соединений. Содержание колютина, полученного в волосатых корнях туберкулеза, было более чем в 10 раз выше, чем у корней дикого типа. В настоящем исследовании, введение FtMYB116 привело к более высокой экспрессии генов, связанных с рутетом и резкое производство рутения в ТБ волосатые корни. Этот метод был подтвержден, чтобы быть склонны к фенотипической характеристики и экспрессии генилпропанидов связанных генов, таких как FtF3H и FtFLS в ТБ волосатые корни5,30,31. Чжан и др.32 использовали ТБ волосатые корни для исследования производства рутения путем чрезмерного выражения ряда транскрипционных факторов FtMYB. Чжоу и др.33 наблюдается снижение содержания рутения из-за переэкспрессии FtMYB11 в ТБ волосатые корни. Эти результаты вместе с нашими выводами указывают на возможное влияние волосатых корней трансформации на взаимодействие между Транскрипционными факторами FtMYB и генами, связанными с биосинтезом рутевого биосинтеза.
Хотя имеются ограниченные данные о поэтапном протоколе индукции тб волосатых корней, мы впервые описываем в этом пошаговом протоколе для получения трансгенных тбволосых корней эффективным и стабильным образом с помощью A. rhizogenes, несущего бинарный вектор. Во время этих экспериментальных процессов, многочисленные факторы должны быть тщательно рассмотрены, чтобы получить оптимальные индуцированные волосатые корни. Во-первых, выбор эксплантирующих растений является определяющим фактором. Известно, что сорта туберкулеза влияют на морфологию волосатых корней и выработку фенольных соединений. Thwe et al.30 проиллюстрировали, что экспрессия генов в фенилпропаноидном биосинтетическом пути и содержании фенольных соединений варьировалась между сортами туберкулеза. Они также нашли волосатые корни в одном сорте, который был темно-красно-фиолетовый из-за его содержания антоциана13. В нашем исследовании, 2 только что развернулся cotyledons и hypocotyls были выбраны в качестве explants. Это потому, что молодые и нежные листья пользу высокой волосатые корня индукции скорость2,30, в то время как высоко дифференцированные и старые клетки растений отрицательно влияют на волосатые индукции корня. Во-вторых, штамм А. rhizogenes оказывает значительное влияние на индукцию волосатого корня. Различные бактериальные штаммы обладают различными преобразующими способностями с точки зрения морфологии и индукционной эффективности волосатых корней, которые могут быть освещены различными плазмидами, укрытыми штаммами34. Aye et al.35 сравнили воздействие нескольких штаммов A. rhizogenes (R1000, R1200, 15834, LBA9402 и A4) на индукцию волосатого корня и фенилпропаноидный биосинтез и обнаружили, что наиболее перспективным для производства волосатого корня при туберкулезе является R1000. Этот вывод был поддержан Ким и др.2 Тем не менее, штамм ACCC10060, который был исключен в исследовании Aye et al., но используется в нашем исследовании, показал удовлетворительную эффективность инфекции. Пушистый белый внешний вид волосатых корней, полученных с помощью нашего протокола в согласии с волосатые корни, порожденные в Сальвиа miltiorrhiza36, в котором тот же штамм ACCC10060 проведения бинарного вектора pK7GWIWGG2D (II) был использован, чтобы заставить замолчать целевой ген. В-третьих, degerming втомяя pretreatment материалов и концентрация cefotaxime в селективной культуре также играет существенную роль в волосатых индукции корня. Неполная дезинфекция на любом шаге может привести к провалу волосатого преобразования корня. Кроме того, концентрация бактерий оказывает значительное влияние на выработку transformed корней. Высокие концентрации могут уменьшить растительные клетки путем конкурентного ингибирования, в то время как низкие концентрации могут вызвать низкую доступность4.
Кроме того, культурные условия, такие как среда роста, соответствующее время preculturing и coculturing, и другие биотические или абиотические факторы играют важную роль в волосатый индуктон корня. Хуан и др.37 рекомендуется 1/2 MS среды, содержащей сахарозу в концентрации 30 г / л для кокультивации для достижения максимального Туберкулеза волосатые корни. Это можно объяснить высокой соляной средой, которая подходит для формирования волосатых корней, в то время как низкая соляная среда способствует чрезмерному бактериальному умножению34. AS является одним из видов фенольных соединений, которые могут облегчить A. rhizogenes-опосредованныепреобразования в ряде видов растений транскрипции вир области Агробактерии34,38, и вир может быть эффективно индуцированных в среде с рН ют; 5,739,40. Поэтому мы рекомендуем среду кокультуры с рН 5.2, дополненную 100 мкм AS. Хуан и др.37 сообщили, что ТБ волосатые корни превратились в коричневый цвет после 24-го дня из белого и бледно-желтого. Таким образом, они субкультурные волосатые корни каждые 24 дня; однако, мы рекомендуем субкультивировать каждые две недели, чтобы избежать подрумянивания волосатых корней. Кроме того, условия окружающей среды, такие как свет, гормоны, температура и УФ-излучение, как представляется, влияют на экспрессию флавоноидов биосинтеза, связанных с генами, сильно стимулирующим и угнетающим сигнал трансдукции41,42. Предыдущее исследование продемонстрировало значение дальнего красного света в мониторинге экспрессии генов, связанных с рутетом, в тб волосатых корнях5.
A. rhizogenes-опосредованныепреобразования имеет то преимущество, что любой экзогенный ген интереса вставляется в двоичный вектор может быть передана преобразованный волосатые корневой клон34 для достижения переэкспрессии, потеря функции через РНК заглушая43, или открытие новых метаболических генов транскриптом анализы5. Волосатые корни имеют большой потенциал для производства вторичных метаболитов, рекомбинантных белков и дажеантител44. Это в первую очередь из-за их легкого и быстрого роста в гормональной среде, будучи менее дорогим, нет необходимости для регенерации в полные растения21, и относительно высокий урожай вторичных метаболитов по сравнению с тем, что от исходного растительного материала31. Эти корни также могут быть отделены от первоначального explant для создания долгосрочных, стабильных и характеризуемых корневых клонов, поддерживающих их биосинтетические способности и фенотипы. В целом, на основе этих выводов, этот протокол обеспечивает быстрый, четкий и эффективный метод для производства преобразованных волосатых корней для исследования производства вторичных метаболитов и выдвигает ссылку на волосатые индукции корня в других растениях. Тем не менее, потенциал для изучения волосатые корневые культуры для получения массивных урожаев биологически активных соединений зависит от соответствующей биореакторной системы, в которой определенные параметры, такие как поставка кислорода должны быть обеспокоены4,8. Этот протокол ограничивается производством вторичных метаболитов, полученных в волосатых корнях, и для исследования визуализированного фенотипа функциональных генов, таких как дисперсия цвета и содержание вторичных метаболитов; однако, фенотипические изменения во всем заводе независимо от получения регенерированных растений из волосатых корней не могут быть оценены в этом исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фундаментальными научно-исследовательскими фондами для Центральных научно-исследовательских институтов социального обеспечения (XKT17002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
