Summary
Vi beskriver en metod för att inducera håriga rötter av Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling i Tartary bovete (Fagopyrum tataricum). Detta kan användas för att undersöka genfunktioner och produktion av sekundära metaboliter i Tartary bovete, antas för någon genetisk omvandling, eller användas för andra medicinalväxter efter förbättring.
Abstract
Tartary bovete (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] har olika biologiska och farmakologiska aktiviteter eftersom den innehåller rikliga sekundära metaboliter såsom flavonoider, särskilt rutin. Agrobacterium rhizogenes har gradvis använts över hela världen för att inducera håriga rötter i medicinalväxter för att undersöka genfunktioner och öka avkastningen av sekundära metaboliter. I denna studie har vi beskrivit en detaljerad metod för att generera A. rhizogenes-medierad håriga rötter i TB. Cotyledons och hypocotyledonary axel på 7-10 dagar valdes som explants och infekterade med A. rhizogenes bär en binär vektor, som inducerade oavsiktliga håriga rötter som dök upp efter 1 vecka. Den genererade håriga rotomvandlingen identifierades baserat på morfologi, resistensval (kanamycin) och reportergenuttryck (grönt fluorescerande protein). Därefter var de förvandlade håriga rötterna självförökade efter behov. Under tiden förvandlades en myeloblastos (MYB) transkriptionsfaktor, FtMYB116, till TB-genomet med hjälp av A. rhizogenes-medieradehåriga rötter för att verifiera ftMYB116s roll i syntetiserande flavonoider. Resultaten visade att uttrycket av flavonoid-relaterade gener och avkastningen av flavonoidföreningar (rutin och quercetin) var betydligt (p < 0,01) främjas av FtMYB116, vilket tyder på att A. rhizogenes-medieradhåriga rötter kan användas som ett effektivt alternativt verktyg för att undersöka genfunktioner och produktion av sekundära metaboliter. Det detaljerade steg-för-steg-protokollet som beskrivs i denna studie för att generera håriga rötter kan antas för all genetisk omvandling eller andra medicinalväxter efter justering.
Introduction
Tartary bovete (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) är en typ av dicotyledon som tillhör släktet Fagopyrum och familjen Polygonaceae1. Som en typ av kinesisk medicin homolog mat, tb har fått stort intresse på grund av dess särskiljande kemisk sammansättning och olika bioaktiviteter mot sjukdomar. TB är främst rik på kolhydrater, proteiner, vitaminer och karotenoider samt i polyfenoler såsom fenoler och flavonoider1. Olika biologiska och farmakologiska aktiviteter av flavonoider, inklusive antioxidativa, blodtryckssänkande2, och antiinflammatoriska samt anticancer och antidiabetiska egenskaper, har visats3.
Agrobacterium rhizogenes är en jordbakterie som bidrar till utvecklingen av hårig rotsjukdom i flera högre växter, särskilt dicotyledons, genom att infektera sårplatser4,5. Denna process initieras av överföringen av T-DNA i rotinducerande (Ri) plasmid5,6 och åtföljs ofta av integration och uttryck av en exogen gen från Ri plasmid och de efterföljande stegen för att generera hårig rot fenotyp7. A. rhizogenes-medieradetransgena hårrötter, som ett kraftfullt verktyg inom växtbioteknik, har använts mest på grund av deras stabila och höga produktivitet och enkel ervisande på kort tid. Dessutom är håriga rötter framkallas av A. rhizogenes effektivt kännetecknas av deras plagiotropa rotutveckling och mycket förgrening tillväxt i ett hormonfritt medium8. De kan användas inom flera forskningsområden, inklusive artificiell utsädeproduktion, rothärdforskning och för att studera interaktioner med andra organismer som mykorrhizalsvampar, nematoder och rotpatogener7,9. Dessutom har håriga rotomvandlingskulturer använts i stor utsträckning som ett experimentellt system för att undersöka de biokemiska vägarna och kemisk signalering och för att producera växtsekundära metaboliter som används som läkemedel, kosmetika och livsmedelstillsatser8,10. De värdefulla sekundära metaboliterna, inklusive indole alkaloider, akoniter, tropane alkaloider, terpenoider och flavonoider, syntetiserade i vildtyp håriga rötter har undersökts i flera decennier i många arter, såsom ginsenoside i Panax ginseng11, coumarine i Ammi majus12, och fenolic föreningar i TB2,13.
Håriga rötter har producerats med A. rhizogenes i 79 växtarter från 27 familjer14. Till exempel, A. rhizogenes-medieradhårig rot omvandling har rapporterats i sojaböna15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, och cikoria (Cichorium intybus L.) 20.TB hårig rotomvandling har också undersökts2. Få detaljerade protokoll finns tillgängliga om utvecklingen av håriga rötter medierad av A. rhizogenes antingen bär en binär vektor eller inte. Till exempel införde Sandra et al.21 en metod för att producera transgena potatis håriga rötter i vilda skott. De fullt utvecklade håriga rötterna kan visualiseras 5-6 veckor efter injektionen av A. rhizogenes som transporterar gus reportergenen i stammen internoder av potatisväxter. En annan studie hade också rapporterat en transgena hårig rotsystem framkallas av A. rhizogenes hysa gusA reporter genen i jute (Corchorus capsularis L.) 22.Dessutom erhöll Supaart et al.23 transgena tobakshåriga rötter med hjälp av A. rhizogenes omvandlas med uttrycksvektorn pBI121 som transporterar genen av Δ 1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) syntas för att producera THCA.1
En steg-för-steg-process för en effektiv generation av hårig rotomvandling, särskilt i tuberkulos, har dock varit relativt mindre påvisad. I denna studie har vi beskrivit ett detaljerat protokoll med Hjälp av A. rhizogenes som bär reportergenen (GFP),en selektiv markör (Kan), och en gen av intresse (b4, en identifierad från vår grupp men opublicerad gen från grundläggande helix-loop-helix(bHLH)familj) för att generera hårig rotgenetisk omvandling i tb. Experimentet varade i 5-6 veckor, från inokulering av frön till generering av håriga rötter, med explant beredning, infektion, kokulering, subculturing, och efterföljande förökning. Dessutom användes A. rhizogenes som innehåller en binär plasmid som transporterar tb-transgenen av myeloblastostranskriptionsfaktor 116 (FtMYB116) för att avgöra om FtMYB116 kan främja ackumulering av flavonoider, särskilt rutin, i tbc på gen- och metabolisk nivå genom TB hårig rotomvandling. FtMYB116, som är en ljusinducerad transkriptionsfaktor, reglerar syntesen av rutin under olika ljusförhållanden5. Chalcone syntas (CHS),flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3'-hydroxylase (F3'H), och flavonol syntas (FLS)24 är viktiga enzymer som är involverade i den metaboliska vägen för rutin biosyntes. Därför visar denna studie överuttryck av FtMYB116 i TB håriga rötter och uttryck för viktiga enzymgener samt innehållet i rutin och andra flavonoider såsom quercetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tb som används i denna studie namngavs som BT18, som härstammar från rasen av "JinQiao No.2" odlas av Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science. De primära stegen i det här protokollet illustreras i figur 1.
OBS: Använd explants-relaterade manipulation snabbt, och om möjligt, hålla Petri rätter stängda för att undvika vissning och kontaminering. Om inget annat anges utfördes alla explant-inkuber under förutsättning att det var 14 h ljus och en 10 h mörk fotoperiod vid 25 °C. Om inget annat anges utfördes alla explants- eller bakterierelaterade operationer under aseptiska förhållanden i en laminär flödeshuva. Alla medieingredienser för A. rhizogenes och in vitro-växtkulturer finns i tabell 1. Efter justering av pH, var alla medier autoklaveras vid 120 °C i 20 min. Stelnat media bereds genom att fylla 25 ml medium i en Petri skål med 9-cm diameter och gör det möjligt att stelna.
VARNING: Sätt in alla genetiskt modifierade bakterier och växter i lämplig avfallsbehållare. Använd alla farliga kemikalier i ett rökskåp och lägg dem i behållaren för farligt avfall.
1. Beredning av tbc-explants
- Beredning av tb frön
- Välj fylliga och oskadade TB-frön(figur 1A1)som har bevarats vid en temperatur som är lägre än −20 °C i högst 2 år.
- Blötlägg fröna i vatten vid 28 °C i ca 20 min så att fröpälsen lätt kan skalas av (figur 1A2). Om det behövs, använd sax för att skära en plats på fröna för att underlätta peeling.
- Sterilisering av tb-frön
- Placera 100–200 skalade frön i en 100 ml steriliserad konisk kolv.
- Desinficera fröna med 75% etanol för 30 s.
- Byt ut etanolen med 5% natriumhypoklorit och desinficera i 15 min.
OBS: Desinfektion med kvicksilverbiklorid vid en koncentration av 1 g/L i 8 min kan användas som en alternativ autoklav för att ersätta natriumhypoklorit i alla fall av otillräcklig sterilisering.
VARNING: Kvicksilverbiklorid är farligt och inte ett miljövänligt material. Använd den i rökskåpet och lägg den i behållaren för farligt avfall, om kvicksilverbiklorid i vilket fall som helst används. - Häll ut natriumhypokloritet.
- Tvätta fröna med sterilt deioniserat vatten 5 gånger.
- Blot fröna torkar med ett sterilt bibulous papper.
- Beredning av tbc-plantor
- Förbered 50 mL Murashige och Skoog (MS) basalmedium (1962) kompletterat med 30 g/L sackaros och 7 g/L agarpulver (MSSA) (Tabell 1) i en 300 ml växtvävnadsodlingsflaska.
- Justera pH-värdet till 5,8 innan autoklavering.
- Fördela 10 frön jämnt per flaska MSSA medium.
- Gro fröna i ett odlingsrum vid 25 °C ± 1 °C under ljuskonditioni 7–10 dagar.
- Beredning av sterila explants
- Välj robusta plantor av TB(figur 1C),när de 2 bitar av cotyledons är ovikta.
- Klipp av plantorna från rötterna(figur 1C rödstreckspilspetsar)och undvik kontakt med mediet.
- Placera dem i en steril Petri skål.
- Skär hypocotyls i 0,8–1 cm segment och klipp kotyledonerna i cirka 0,5 cm bitar.
- Förkultur dessa explants på MSSA medium under ljusskick för 24 h.
- Överför dem till en 100 ml steriliserad konisk kolv, som nu är redo för infektion.
2. Beredning av A. rhizogenes för omvandling
OBS: A. rhizogenes stam ACCC10060 var vänligt tillhandahålls av Institutet för utveckling av medicinalväxter och bevaras vid −80 °C. A. rhizogenes förvandlades med den binära vektorn pK7GWIWG2D (II) som hyser ett T-DNA som transporterar b4-genen som åtföljer en GFP som indikatorgen och Kan-resistensgenen som en valbar markör. Genen b4 är medlem i transkriptionsfaktorn bHLH-familjen, som ännu inte har publicerats. För att utvärdera potentialen hos tbc-hårrötter förvandlades A. rhizogenes med den binära vektorn pK7WG2D som innehåller GENEN MYB116 för att undersöka dess effekt på produktionen av sekundära metaboliter såsom flavonoider på gennivå uttryck och metaboliska analyser. Aktiverade A. rhizogenes bör vara väl förberedda samtidigt med explants.
- Aktivering av A. rhizogenes
- Tina A. rhizogenes på is
- Doppa bakterierna och linje dem jämnt på jäst mannitol medium (YEB) kompletteras med 15 g/L agar pulver, 50 mg/L rifampicin, och 50 mg/L spectinomycin (YEBARS, pH 7.0).
- Inkubera bakterierna vid 28 °C i 12–16 h.
- Välj en monoklonal koloni och odla den i en annan Petri-skål på samma ovan beskrivna sätt.
- Välj monoklonala kolonier och odla dem i en 100 ml steriliserad konisk kolv som innehåller 20 ml YEB-medium kompletterat med 50 mg/L rifampicin och 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) vid 28 °C och 200 rpm för 16–18 h tills OD600-värdet når 2,0.
- Inkubera 2%–4 % av ovannämnda odling i en annan konisk kolv på 100 ml som innehåller 20 ml YEBRS-medium vid 28 °C och 200 rpm för 4–5 timmar tills OD600-värdet når cirka 0,5 (figur 1D).
3. Infektion och screening av tbc-explantor
OBS: Syftet med detta protokoll är att få genetiskt förvandlade håriga rötter. De vilda rötterna användes som negativ kontroll för att bedöma det transgena uttrycket. I detta protokoll omvandlades A. rhizogenes med binär vektor antingen pK7WG2D som transporterar genen av FtMYB116 eller pK7GWIWG2D (II) som bär genen av b4 i förväg.
- Resuspension av A. rhizogenes
- Överför den kultur som erhålls i steg 2.1.6 till ett 50 ml steriliserat centrifugalrör.
- Snurra vid 4 000 x g i 10 min vid 20 °C.
- Ta bort supernatanten och återsuspendbakteriepelleten med MS-medium kompletterat med 30 g/L sackaros och 300 μM acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5.8) till OD600 ≈ 0.2.
- Infektion av explants
- Ingjuta den bakteriesuspension som erhålls i steg 3.1.3 i en konisk kolv som innehåller de explantor som bereds i steg 1.4.6 i 10 min (figur 1E).
- Ta ut explants, och torka dem med hjälp av en steril bibulous papper.
4. Samodling av explants med A. rhizogenes
- Placera ett sterilt filterpapper i diametern 9 cm på MS-mediet, som stelnat med 7 g/L agarpulver kompletterat med 30 g/L sackaros och 100 μM AS (MSSAAS medium, pH 5.2).
- Överlagra explantorna på filterpapperet vid 25 °C i 3 dagar i mörker (bild 1F).
5. Induktion och selektiv kultur
- Placera cirka 20 infekterade explantor på MSSA-mediet kompletterat med 500 mg/L cefotaxime och 50 mg/L kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (figur 1G).
- Inkubera dem vertikalt under ljustillståndet vid 25 °C ± 1 °C. De håriga rötterna förekommer cirka 1 vecka efter inkubation (Figur 1H svart-dash pilspetsar indikerar förekomst av håriga rötter).
OBS: Byt ut MSSACK-medium var 15:e dag om det behövs.
6. Subkulera TB håriga rötter
OBS: Detta förfarande syftar till att skörda kraftfulla håriga rötter. Observera regelbundet tillväxten av håriga rötter under förökning, och ta bort de förorenade och inaktiverade i tid. Upprepa vid behov följande steg för att sprida mer håriga rötter. Det tar cirka 10–14 dagar från subkulering till skörd.
- Välj de håriga rötterna som visar vitt utseende och snabb tillväxt.
- Skär dem i bitar av 2-3 cm.
- Tydligt numrera dem på en ren bänk.
- Subkultur dem i en 100 ml steriliserad konisk kolv som innehåller 5 ml MS-medium kompletterat med 30 g/L sackaros och 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) med en rotationshastighet på 80 varv/min vid 25 °C i mörker tills de sprider sig över till kolvens botten (figur 1I).
7. Identifiering av förvandlade håriga rötter och bevarande
OBS: Förvandlade håriga rötter kan identifieras baserat på aspekter av morfologi och gennivå. Identifiering kan också utföras enligt håriga rotgenom och motstånd, som inte omfattas av detta protokoll. Detta förfarande fokuserar främst på reportergen och målgenidentifiering.
- Ta tawny och förorenade håriga rötter och välj de med vitt utseende.
- Utvärdera om det finns grön fluorescens under en blå/ljus dubbel ultraviolett transilluminator.
- Välj de håriga rötterna som uppvisar en stark fluorescenssignal i de numrerade rören eller insvept med en markerad aluminiumfolie efter torkning av dem med ett absorberande papper.
- Lyophilize dem i flytande kväve, följt av lagring av all skörd vid −80 °C för vidare undersökning.
- Identifiering av gener
- Triturate 0,1 g av håriga rötter i fint pulver i flytande kväve.
- Förbered genomic DNA av oberoende transgena tbc-linjer med hjälp av den modifierade cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) metod25 enligt instruktioner från tillverkaren av anläggningen genomisk DNA-kit.
- Utför polymeras kedjereaktion (PCR) med 100 ng av genomisk DNA-mall och primers som anges i tabell 2.
- Utför förstärkningscykeln enligt följande: predenaturation vid 94 °C i 5 min, denaturering vid 94 °C för 30 s, primerglödering vid 55 °C för 30 s och primerförlängning vid 72 °C för 30 s. Efter 36 cykler och ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 10 min, analysera förstärkningsprodukterna på 1% agarose geler.
- Färga gelerna med nukleinsyra färgning och visualisera dem under UV-ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-medieradTB hårig rotomvandling
Denna studie beskriver steg-för-steg protokoll som inrättades för att få genetiskt transformerade håriga rötter med Hjälp av A. rhizogenes. Det tog ungefär 5-6 veckor från inokulering av tbc frön till skörden av identifierade håriga rötter, och några viktiga steg avbildas i figur 1 (A-H). Kortfattat vaccinerade smorde frön vaccinerades (figur 1B) för att uppnå snabbare steril grobarhet. A. rhizogenes (figur 1D)och sterila explantor bör aktiveras och beredas i förväg. Detta följs av några viktiga steg, inklusive infektion av explants med aktiverade A. rhizogenes (figur 1E),coculture (figur 1F), och selektiv kultur (figur 1G). De infekterade explantorna bör placeras jämnt på det stelnade MS-mediet och utrymmet måste hållas mellan dem för att lätt separera de olika transgena linjerna. Håriga rötter visas med en fluffig vit färg på ett plagiotropt sätt i explants sårplatser (figur 1H). De håriga rötterna bildar en mycket förgrenad och en sammanlänkad matris och kan spridas efter behov (figur 1I). De skördade håriga rötterna kan användas för att undersöka genfunktionen eller gen- eller proteinproteininteraktionen. Alternativt kan TB håriga rötter kraftigt spridas för att ge sekundära metaboliter såsom rutin i utsedda bioreaktorer.
Metoden för att inducera transgena hårrötter i tbc har styrkts med hjälp av en binär vektor (pK7GWIWG2D (II)) som bär generna GFP och b4 (en medlem av transkriptionsfaktorn bHLH-familjen, ännu inte publicerad). Reportergenen GFP användes för att enkelt skilja de transgena hårrötterna från de icke transgena rötterna genom att visualisera signalen under en blå/ljus dubbel ultraviolett transilluminator (figur 2) eller genom att identifiera målgenen ( figur3). De förvandlade håriga rötterna uppvisade grön fluorescens när de belystes under blått eller ultraviolett ljus (representerat med hjälp av svarta pilspetsar i figur 2A),medan de oförvandlade håriga rötterna inte uppvisade den gröna fluorescensen (figur 2B). De håriga rötterna med en hög GFP-signal förökades i två veckor, vilket illustrerades i figur 2C.
För att ytterligare identifiera om den binära vektorn framgångsrikt har omvandlats till TB-genomet genomfördes genidentifieringar. Kortfattat, växt genomisk DNA av TB håriga rötter var beredd för PCR analys baserad på den modifierade CTAB metod25. PCR utfördes genom att förstärka generna (Kan, GFPoch b4), som fanns i figur 3, respektive. Grundfärger listas i tabell 2. Förekomsten av de 3 generna i alla transgena linjer(figur 3, körfält 5–11) visade att den binära vektorn framgångsrikt har förvandlats till tb genomet. Kan och GFP var frånvarande i de vilda rötterna (figur 3, körfält 3) och experimentell negativ kontroll ( figur3,körfält 4), medan b4 upptäcktes i de vilda rötterna. Dessa 3 gener presenterades utan tvekan i den positiva kontrollen (figur 3,körfält 2) men var tydligen frånvarande i den negativa kontrollen ( figur3,körfält 4).
Utvärdering av den ljusinducerade transkriptionsfaktorn FtMYB116 i tbc med hjälp av det ovan nämnda hårhåriga rotsystemet
FtMYB116 uttrycktes genom att använda ovannämnda protokoll om hårig rotinduktion. Detta åstadkoms genom att försätta genen FtMYB116 i den binära vektorn pK7WG2D och sedan infektera med A. rhizogenes för att uppnå genöveruttryck. Kort var håriga rötter på 0,1 g triturated i fint pulver med hjälp av flytande kväve. Totalt RNA extraherades genom att följa instruktionerna från tillverkaren av anläggningen RNA isolering kit26. Sedan omvänd transkription PCR och realtid PCR utfördes för att förstärka FtMYB116 och rutin syntetisera väg relaterade gener. Därefter kontrollerades ftMYB116s regleringseffekter på rutinsyntesrelaterade genuttryck och rutinens avkastning.
Figur 4A visar ftMYB116s relativa uttryck i de transgena linjerna i tbc-hårrötterna. Jämfört med kontrollgruppen uppvisade det relativa uttrycket för FtMYB116 en avsevärd ökning av alla 3 oberoende transgena linjer. Figur 4B och figur 4C illustrerar främjandet av biosyntesen av rutin och quercetin på metabolisk nivå genom FtMYB116 överuttryck. Innehållet i rutin och quercetin i transgena var signifikant(p < 0,01) ökade jämfört med de i vildtyp, når 40 och 0,5 mg/g FW, respektive, som var 8 gånger de i vild-typ. De relativa genuttrycken för CHS, F3H, F3'Hoch FLS i alla 3 transgena linjer var anmärkningsvärt högre än i kontrollgruppen (figur 4D). Tillsammans bekräftade dessa resultat att den strategi som beskrivs i denna studie framgångsrikt skulle kunna användas för att generera hårig rotomvandling i tbc och undersöka genuttryck och metabolisk avkastning av sekundära metaboliter.
Figur 1: Processer för att inducera A. rhizogenes-medieradtransgena hårrötter i tbc. Representativa bilder av kritiska stadier visas: (A1) och(A2) representerar före och efter peeling av frörockarna; b)representerar varje 10 frön som inokuleras i en vävnadsflaska som innehåller MSSA-medium, C)betecknar tbc:s plantor 7–10 dagar efter inokulering, och pilspetsarna med röd-streck visar skärpunkterna. D)och(E)anger beredningen av A. rhizogenes (OD600 = 0,5) respektive infektion en explants. (F)och(G)symboliserar kokulering med aktiverade A. rhizogenes på MSSAAS medium och selektiv odling på MSSACK medium, respektive, håriga rötter kommer ut ur (H), som visas av svart-dash pilspetsar; och(I)visar förökning av hårig rotbildning; de svartstreckspilspetsar indikerar de inducerade håriga rötterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Omvandling av den binära vektorn som bär GFP-reportergenen. (A)betecknar de inducerade håriga rötterna efter selektiv kultur som undersökts under den blå/ljusa dubbla ultravioletta transilluminatorn. (B)och(C)representerar rot av vild typ och förökning av förvandlade håriga rötter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: PCR-förstärkning av gener (Kan, GFPoch b4) från genomiskt DNA isolerat från vild-typ rot och håriga rötter tb i 7 oberoende transgena linjer. AA: Kan,b): GFP,c): b4. Körfält 1: molekylstorlekmarkörer (vit pilspets indikerar 750 bp), körfält 2: plasmid (binär vektor pK7GWIWG2D (II) som transporterar Kan, GFPoch b4-gener) som den positiva kontrollen, körfält 3:vildrot, körfält 4: renad H2O som negativ kontroll och körfält 5–11: de 7 oberoende transgena linjerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Relativt uttryck för FtMYB116 i de transgena linjerna i TBC-håriga rötter. (A)och den känsloladdade effekten av ftMYB116s överuttryck på biosyntesen av(B)rutin och(C)quercetin (Denna siffra har ändrats från Dong et al.5). Experiment utfördes i tre exemplar och genomfördes 3 gånger. "**" indikerar en signifikant skillnad på p < 0,01 med students t-test. (D)Uttryck för gener relaterade till flavonoidsyntesvägar i transgena linjer. Den relativa uttrycksnivån normaliserades till handlingens kontroll. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Media | Medelstora ingredienser | ||
| MSSA (mssa) | Murashige och Skoog (MS) medium som innehåller sackaros i 30 g/L, och agarpulver i 7 g/L, pH 5.8 | ||
| YeBARS (på samma sätt som du kan) | Jäst Mannitol Medium (YEB) som innehåller agarpulver vid 15 g/L, rifampicin vid 50 mg/L och spectinomycin vid 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| YeBRS (på 80) | YEB innehåller rifampicin vid 50 mg/L och spectinomycin vid 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| MSSAS (MSSAS) | MS-medium som innehåller sackaros vid 30 g/L och acetosyringone (AS) vid 300 μM, pH 5.8 | ||
| MSSAA | MS-medium som innehåller sackaros vid 30 g/L, agarpulver vid 7g/L och AS vid 100μM, pH 5.2 | ||
| MSSACK (MSSACK) | MS-medium som innehåller sackaros vid 30 g/L, agarpulver vid 7 g/L, cefotaxime vid 500 mg/L och kanamycin (kan) vid 50 mg/L, pH 5.8 | ||
| MSSK (MSSK) | MS-medium som innehåller sackaros vid 30 g/L och kan vid 50 mg/L, pH 5.8 | ||
Tabell 1: Media och deras ingredienser.
| Primer | Sekvens (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAAAGCGGCCA | |
Tabell 2: Primer sekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TBC har använts i flera studier relaterade till sekundära metaboliter vid genetiska och metaboliska nivåer1,2,,5,27,28. Hårig rotkultur, som en unik källa för metabolitproduktion, spelar en central roll i metabolisk teknik29 och kan användas för att förändra metaboliska vägar genom att infoga relaterade gener. Kim et al.2 introducerade ursprungligen inrättandet av TB håriga rotkulturer av A. rhizogenes-medieradomvandling för att uppnå produktion av fenolicföreningar. Innehållet i rutin som de fick i TB håriga rötter var mer än 10 gånger högre än i den vilda typ rötter. I den aktuella studien ledde införandet av FtMYB116 till ett högre uttryck för rutinrelaterade gener och ökade produktionen av rutin i TB håriga rötter. Denna teknik har bekräftats vara apt för fenotypisk karakterisering och uttryck för fenylpropanoid-relaterade gener som FtF3H och FtFLS i TB håriga rötter5,30,31. Zhang et al.32 använde tbc håriga rötter för att undersöka produktionen av rutin genom att överuttrycka en serie FtMYB transkriptionella faktorer. Zhou et al.33 observerade en minskning av innehållet i rutin på grund av överuttryck av FtMYB11 i TB håriga rötter. Dessa resultat visar tillsammans med våra resultat de genomförbara effekterna av hårig rotomvandling på interaktionen mellan FtMYB transkriptionella faktorer och rutinbiosyntesrelaterade gener.
Även om det finns begränsade data om ett steg-för-steg-protokoll för induktion av TB håriga rötter, beskriver vi häri steg-för-steg-protokollet för första gången för att få transgena TB håriga rötter på ett effektivt och stabilt sätt med Hjälp av A. rhizogenes som bär en binär vektor. Under dessa experimentella processer måste många faktorer noga övervägas för att få optimala inducerade håriga rötter. För det första är valet av explants en avgörande faktor. TB sorter är kända för att påverka morfologi av håriga rötter och produktion av fenolföreningar. Thwe et al.30 illustrerade att genuttryck i den fenylpropanoidbiosyntetiska vägen och innehållet i fenolföreningar varierade mellan TB sorter. De fann också håriga rötter i en sort, som var djup rödlila på grund av dess antocyanin innehåll13. I vår studie, 2 bara utspelade cotyledons och hypocotyls valdes som explants. Detta beror på att unga och anbud lämnar gynnar en hög hårig rot induktion hastighet2,30, medan mycket differentierade och gamla växtceller negativt påverka håriga rot induktion. För det andra har stammen av A. rhizogenes en betydande inverkan på hårig rotinduktion. Olika bakteriestammar uppvisar olika transformerande förmågor när det gäller morfoologier och induktionseffektivitet hos håriga rötter, som kan belysas av de olika plasmiderna som hystes av stammarna34. Aye et al.35 jämförde effekterna av flera A. rhizogenes stammar (R1000, R1200, 15834, LBA9402 och A4) på TB hårig rotinduktion och fenylpropanoid biosyntes och fann att den mest lovande stam för hårig rotproduktion i TB var R1000. Denna slutsats har fått stöd av Kim et al.2 Ändå, stammen ACCC10060 som uteslöts i studien av Aye et al. men används i vår studie uppvisade tillfredsställande infektion effektivitet. Den fluffiga vita utseende håriga rötter som erhållits med vårt protokoll är överens med håriga rötter som genereras i Salvia miltiorrhiza36, där samma stam ACCC10060 bär binär vektor pK7GWIWG2D (II) användes för att tysta målet genen. För det tredje, degerming inklusive förbehandling av material och en koncentration av cefotaxime i selektiv kultur spelar också viktiga roller i hårig rot induktion. Ofullständig desinfektion i alla steg kan leda till misslyckandet med hårig rotomvandling. Dessutom har bakteriekoncentrationen en betydande inverkan på produktionen av transformerade rötter. Höga koncentrationer kan minska växtcellerna genom konkurrenshämmande, medan låga koncentrationer kan orsaka låg tillgänglighet4.
Dessutom, kultur förhållanden såsom tillväxt medium, lämplig preculturing och samordna tid, och andra biotiska eller abiotiska faktorer spelar en viktig roll i håriga rot indukton. Huang et al.37 rekommenderade 1/2 MS medium som innehåller sackaros vid en koncentration av 30 g/L för samodling för att uppnå maximal TB håriga rötter. Detta kan förklaras av det höga saltmediet som är lämpligt för hårig rotbildning, medan ett lågt saltmedium gynnar överdriven bakteriell multiplikation34. AS är en typ av fenolic förening som kan underlätta A. rhizogenes-medieradomvandling i ett antal växtarter genom transkription av vir regionen Agrobacterium34,38, och vir kan effektivt induceras i ett medium med ett pH -värde < 5,739,40. Därför rekommenderar vi ett coculturemedium med pH 5.2 kompletterat med 100 μM AS. Huang et al.37 rapporterade att TB håriga rötter vände sig till brunt efter dag 24 från vit och ljusgul. Därför subodlade de håriga rötter var 24:e dag; Vi rekommenderar dock att du underkupar varfjortonde dag för att undvika browning av håriga rötter. Dessutom verkar miljöförhållanden som ljus, hormoner, temperatur och UV-strålning påverka uttrycket av flavonoidbiosyntesrelaterade gener genom mycket stimulerande eller deprimerande signaltransduktion41,42. Den tidigare studien har visat betydelsen av långt rött ljus i övervakningen av rutinrelaterade genuttryck i TB håriga rötter5.
A. rhizogenes-medieradomvandling har fördelen att alla exogena gen av intresse som sätts in i en binär vektor kan överföras till den omvandlade hårigarotklonen 34 för att uppnå överuttryck, funktionsförlust via RNA-ljuddämpning43, eller upptäckt av nya metaboliska gener genom transkriptomanalyser5. Håriga rötter har stor potential att producera sekundära metaboliter, rekombinanta proteiner och evenantibodies44. Detta beror främst på deras enkla och snabba tillväxt i hormonfritt medium, är billigare, inget krav på förnyelse till kompletta växter21, och den relativt höga avkastningen av sekundära metaboliter jämfört med den från startväxtmaterial31. Dessa rötter kan också separeras från den ursprungliga explant för att etablera långsiktiga, stabila och kännetecknas rot kloner upprätthålla deras biosyntetiska kapacitet och fenotyper. Sammantaget, baserat på dessa resultat, ger detta protokoll en snabb, distinkt och effektiv metod för att producera förvandlade håriga rötter för att undersöka produktionen av sekundära metaboliter och lägger fram en referens för hårig rotinduktion i andra växter. Potentialen att utforska håriga rotkulturer för att generera massiva avkastning av bioaktiva föreningar beror dock på det lämpliga bioreaktorsystemet där vissa parametrar såsom tillförsel av syre måste beröras4,8. Detta protokoll är begränsat till produktion av sekundära metaboliter som härrör i håriga rötter och att undersöka den visualiserade fenotyp av funktionella gener såsom variansen av färg och innehållet i sekundära metaboliter; Dock kunde fenotypiska förändringar i hela anläggningen oavsett erhållen av regenererade växter från håriga rötter inte utvärderas i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av fonderna för grundforskning för de centrala offentliga välfärdsforskningsinstituten ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
