Summary
Biz Agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen bir yöntem tarif -Tartary karabuğday aracılı dönüşüm (Fagopyrum tataricum). Bu gen fonksiyonları ve Tartary karabuğday ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için kullanılabilir, herhangi bir genetik dönüşüm için kabul edilebilir, ya da iyileştirme den sonra diğer tıbbi bitkiler için kullanılır.
Abstract
Tartary karabuğday (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] flavonoidler gibi bol ikincil metabolitleri içerdiğinden çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetlere sahip, özellikle rutin. Agrobacterium rhizogenes yavaş yavaş gen fonksiyonlarını araştırmak ve ikincil metabolitlerin verimini artırmak için tıbbi bitkilerde kıllı kökleri ikna etmek için dünya çapında kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Tüberkülozda A. rhizogenesaracılı kıllı kökler oluşturmak için ayrıntılı bir yöntem tanımlanmıştır. 7-10 günde cotyledons ve hipokotendoner eksen eksektive 1 hafta sonra ortaya çıkan adventif tüylü kökleri indükleyen ikili vektör taşıyan A. rhizogenes ile enfekte edildi. Oluşturulan kıllı kök dönüşümü morfolojisi, direnç seçimi (kanamisin) ve muhabir gen ekspresyonu (yeşil floresan protein) temelinde tanımlanmıştı. Daha sonra, dönüştürülmüş kıllı kökleri gerektiği gibi kendini yayılım edildi. Bu arada, bir myeloblastoz (MYB) transkripsiyon faktörü, FtMYB116, A. rhizogeneskullanarak TB genomuna dönüştürüldü -flavonoidlerin sentezinde FtMYB116 rolünü doğrulamak için aracılı tüylü kökler. Sonuçlar flavonoid ile ilgili genlerin ekspresyonu ve flavonoid bileşiklerin verimi (rutin ve quercetin) önemli ölçüde (p < 0.01) FtMYB116tarafından teşvik olduğunu gösterdi , A. rhizogenes-aracılıtüylü kökleri gen fonksiyonları ve ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için etkili bir alternatif araç olarak kullanılabilir gösteren. Bu çalışmada kıllı kökler üretmek için açıklanan ayrıntılı adım adım protokol, ayarlamadan sonra herhangi bir genetik dönüşüm veya diğer tıbbi bitkiler için kabul edilebilir.
Introduction
Tartary karabuğday (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) Fagopyrum ve familya polygonaceae1familyasına ait bir dicotyledon türüdür. Çin tıbbı homolog gıda bir tür olarak, Tüberküloz kendine özgü kimyasal bileşimi ve hastalıklara karşı çeşitli biyofaaliyetleri nedeniyle önemli ilgi almaktadır. Tüberküloz öncelikle karbonhidratlar, proteinler, vitaminler ve karotenoidler yanı sıra fenolik asitler ve flavonoidler 11gibi polifenoller açısından zengindir. Antioksidatif, antihipertansif2ve anti-inflamatuar yanı sıra antikanser ve antidiyabetik özellikleri de dahil olmak üzere flavonoidlerin çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetleri,gösterilmiştir 3.
Agrobacterium rhizogenes yara siteleri 4 enfekte tarafından birkaç yüksek bitkilerde kıllı kök hastalığı gelişimine katkıda bulunan bir toprak bakterisidir, özellikle dicotyledons,.,5 Bu süreç kök indükleyici T-DNA transferi ile başlatılan (Ri) plazmid5,6 ve genellikle entegrasyonu ve Ri plazmid bir eksojen genin ekspresyonu ve tüylü kök fenotip üreten sonraki adımları eşlik eder7. A. rhizogenes-aracılıtransgenik tüylü kökleri, bitki biyoteknolojisi alanında güçlü bir araç olarak, en yaygın olarak istikrarlı ve yüksek verimlilik ve kısa bir süre içinde kolay elde edilmesi nedeniyle kullanılmaktadır. Ayrıca, A. rhizogenes tarafından indüklenen kıllı kökleri verimli bir hormonsuz orta8onların plagiotropic kök gelişimi ve yüksek dallanma büyüme ile ayırt edilir. Yapay tohum üretimi, kök nodül araştırmaları ve mikorbozial mantarlar, nematodlar ve kök patojenleri gibi diğer organizmalarla etkileşimleri inceleyerek7,9. Buna ek olarak, tüylü kök dönüşüm kültürleri yaygın biyokimyasal yollar ve kimyasal sinyalaraştırmak ve ilaç, kozmetik ve gıda katkı maddeleri8,,10olarak kullanılan bitki ikincil metabolitleri üretmek için deneysel bir sistem olarak kullanılmıştır. Indole alkaloidler, aconites, tropane alkaloidler, terpenoidler ve flavonoidler de dahil olmak üzere değerli ikincil metabolitleri, yabani tip tüylü kökleri sentezlenen çok sayıda tür için birkaç on yıl için araştırılmıştır, Panax ginseng ginsensidegibi11, Ammi majuscoumarine12, ve TB fenolik bileşikler2,13.
Tüylü kökler 27 aileden 79 bitki türünde A. rhizogenes kullanılarak üretilmiştir14. Örneğin, A. rhizogenes-aracılı kıllı kök dönüşümü soya fasulyesi bildirilmiştir15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, ve hindiba(Cichorium intybus L.) 20. Tüberküloz kıllı kök dönüşümü de araştırılmıştır2. Birkaç ayrıntılı protokoller A. rhizogenes ya bir ikili vektör taşıyan ya da taşıma aracılık kıllı köklerin gelişimi ile ilgili mevcuttur. Örneğin, Sandra ve ark.21 yabani tip sürgünler sürdürülen transgenik patates kıllı kökleri üreten bir yöntem tanıttı. Tamamen gelişmiş kıllı kökler, gus muhabiri genini taşıyan A. rhizogenes'in enjekte edilmesinden 5-6 hafta sonra patates bitkilerinin kök internodlarına görselleştirilebilir. Başka bir çalışmada da jüt gusA muhabiri gen barındıran A. rhizogenes tarafından indüklenen bir transgenik kıllı kök sistemi bildirilmiştir(Corchorus capsularis L.) 22- Ayrıca, Supaart ve ark.23 elde transgenik tütün tüylü kökleri A. rhizogenes ifade vektörü pBI121 δ1-tetrahidrokanabinolik asit (THCA) synthase gentaşıyan ile dönüştürülmüş thca üretmek için dönüştürülmüştür.
Ancak, özellikle Tüberküloz'da etkili bir kıllı kök dönüşümü nesli için adım adım bir süreç nispeten daha az gösterilmiştir. Bu çalışmada, TB'de kıllı kök genetik dönüşümü oluşturmak için muhabiri gen(GFP), seçici bir belirteç(Kan)ve bir ilgi geni(b4), grubumuzdan tanımlanan ancak temel sarlis-döngü-sarlis(bHLH)ailesinden yayınlanmamış gen) taşıyan A. rhizogenes kullanılarak ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Deney, tohumların aşılanmasından, eksplant hazırlama, enfeksiyon, koculturing, subculturing ve daha sonraki yayılmayı içeren kıllı köklerin oluşumuna kadar 5-6 hafta sürdü. Ayrıca, FtMYB116'nın tüberküloz kökü dönüşümü yoluyla tb ve metabolik düzeyde flavonoidlerin, özellikle rutin olarak, flavonoidlerin birikimini teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için myeloblastoz transgene116(FtMYB116)tb transgenesini taşıyan ikili plazmid içeren arhizogenler kullanıldı. FtMYB116, ışık kaynaklı transkripsiyonel bir faktördür, farklı ışık koşullarında rutin sentezini düzenler5. Chalcone synthase(CHS), flavanon-3-hidroksilaz (F3H), flavonoid-3'-hidroksilaz (F3'H), ve flavonol synthase (FLS)24 rutin biyosentezin metabolik yolu ile ilgili anahtar enzimlerdir. Bu nedenle, bu çalışma FtMYB116'nın TB kıllı köklerinde aşırı ekspresyonu ve anahtar enzim genlerinin ekspresyonunu ve quercetin gibi rutin ve diğer flavonoidlerin içeriğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan Tüberküloz BT18 olarak adlandırılmıştır, hangi "JinQiao No.2" Shanxi Tarım Bilimleri Akademisi Küçük Çeşitli Tahıl Araştırma Merkezi tarafından yetiştirilen cins kökenli. Bu protokolün birincil adımları Şekil 1'degösterilmiştir.
NOT: Ekstelasyonla ilgili manipülasyonu hızlı bir şekilde çalıştırın ve mümkün olduğunda solma ve kontaminasyonu önlemek için Petri kaplarını kapalı tutun. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplant kuluçkaları 14 saat ışık ve 25 °C'de 10-h karanlık fotoperiod koşuluyla gerçekleştirilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplants- veya bakteri ile ilgili operasyonlar bir laminar akış kaputunda aseptik koşullar altında yapıldı. A. rhizogenes ve in vitro bitki kültürleri için tüm ortam malzemeleri Tablo 1'deverilmiştir. pH ayarlandıktan sonra, tüm ortam 120 °C'de 20 dk. Katılaşmış ortam, 25 mL'lik ortamın 9 cm çapındaki petri kabına doldurularak ve katılaşmasına izin vererek otoklavhaline getirilmiş.
DİkKAT: Genetiği değiştirilmiş tüm bakteri ve bitkileri uygun atık kabına yatırın. Tüm tehlikeli kimyasalları bir duman dolabında çalıştırın ve bunları tehlikeli atık kabına yatırın.
1. Tüberküloz eksplantlarının hazırlanması
- Tüberküloz tohumlarının hazırlanması
- −20 °C'den daha düşük bir sıcaklıkta 2 yıldan fazla olmayan tombul ve hasarsız TB tohumlarını(Şekil 1A1)seçin.
- Tohumları 28 °C'de yaklaşık 20 dakika suda bekletin, böylece tohum kat kolayca soyulabilir (Şekil 1A2). Gerekirse, soyma kolaylaştırmak için tohumlar üzerinde bir yuva kesmek için makas kullanın.
- Tüberküloz tohumlarının sterilizasyonu
- 100-200 soyulmuş tohumu 100 mL steril konik şişeye yerleştirin.
- 30 s için% 75 etanol kullanarak tohumları dezenfekte.
- % 5 sodyum hipoklorit ve 15 dakika dezenfekte ile etanol değiştirin.
NOT: 8 dk için 1 g/L konsantrasyonda cıva biklorür kullanılarak yapılan dezenfeksiyon, yetersiz sterilizasyon durumunda sodyum hipokloritin yerine alternatif sterilizatör olarak kullanılabilir.
DİkKAT: Cıva biklorür tehlikelidir ve çevre dostu bir malzeme değildir. Cıva biklorür her durumda kullanılırsa, fuming dolap ta çalıştırın ve tehlikeli atık konteyner içine yatırın. - Sodyum hipoklorit dökün.
- Tohumları steril deiyonize su kullanarak 5 kez yıkayın.
- Blot tohumları steril bibulous kağıt ile kuru.
- Tüberküloz fidelerinin hazırlanması
- Hazırlamak 50 mL Murashige ve Skoog (MS) bazal orta (1962) 30 g / L sakkaroz ve 7 g / L agar tozu (MSSA) (Tablo 1) ile takviye 300 mL bitki doku kültür şişesi.
- Otomatik otoklavlamadan önce pH'ı 5,8'e ayarlayın.
- MSSA orta şişe başına eşit olarak 10 tohum dağıtın.
- Tohumları 25 °C ± 1 °C'deki bir kültür odasında 7-10 gün boyunca ışık koşulunda çimleştirin.
- Steril eksplantların hazırlanması
- 2 adet karyola açıldığında, 2 adet karyola açığa çıktığında, Sağlam TB fidelerini(Şekil 1C)seçin.
- Köklerden fideler kesin (Şekil 1C kırmızı çizgi ok başları),orta ile temas kaçınarak.
- Steril petri kabına koyun.
- Hipokotilleri 0,8-1 cm segmentler halinde kesin ve karyolaları yaklaşık 0,5 cm'lik parçalara ayırın.
- Preculture bu explants MSSA ortamda 24 saat hafif koşullar altında.
- 100 mL steril konik şişeiçine aktarın, hangi şimdi enfeksiyon için hazır.
2. Dönüşüm için A. rhizogenes hazırlanması
NOT: A. rhizogenes suşu ACCC10060 Tıbbi Bitki Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanmış ve −80 °C'de korunmuştur. A. rhizogenes, bir gösterge geni olarak GFP'ye eşlik eden b4 geni taşıyan bir T-DNA'yı barındıran ikili pK7GWIWG2D (II) ve seçilebilir bir belirteç olarak Kan direnç geni ile dönüştürüldü. B4 geni henüz yayınlanmamış transkripsiyon faktörü bHLH ailesinin bir üyesidir. Tüberküloz kıllı köklerin potansiyelini değerlendirmek için A. rhizogenes MYB116 geni içeren ikili vektör pK7WG2D ile dönüştürülerek gen ekspresyonu düzeyinde flavonoidler gibi sekonder metabolitlerin üretimi üzerindeki etkisini araştırmak ve metabolik analizlerle dönüştürüldü. Aktive A. rhizogenes eksekslerle aynı anda iyi hazırlanmalıdır.
- A. rhizogenes aktivasyonu
- Buz üzerinde çözülme A. rhizogenes
- Bakterileri batırın ve 15 g/L agar tozu, 50 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spektinomisin (YEBARS, pH 7.0) ile takviye edilmiş maya mannitol ortamına (YEB) eşit olarak yerleştirin.
- Bakterileri 28 °C'de 12-16 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir monoklonal koloni seçin ve aynı yukarıda açıklanan şekilde başka bir Petri çanak kültür.
- 20 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ile takviye edilmiş 20 mL'lik steril konik şişede monoklonal kolonileri seçin ve 16-18 saat od600 değeri 2.0'a ulaşana kadar 200 rpm'de seçin.
- OD600 değeri yaklaşık 0.5'e ulaşana kadar 28 °C'de 20 mL YEBRS orta ve 4-5 saat için 200 rpm içeren başka bir 100 mL konik şişede yukarıda bahsedilen kültürün %2-4'ünü kuluçkaya yatırın(Şekil 1D).
3. Tüberküloz eksektirlerinin enfeksiyonu ve taranması
NOT: Bu protokolün amacı genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökler elde etmektir. Yabani tip kökler transgenik ifadeyi değerlendirmek için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde A. rhizogenes ftmyb116 genini taşıyan pK7WG2D veya önceden b4 genini taşıyan pK7GWIWG2D (II) ikili vektörü ile dönüştürüldü.
- A. rhizogenes resuspension
- Adım 2.1.6'da elde edilen kültürü 50 mL steril santrifüj tüpe aktarın.
- 20 °C'de 10 dakika boyunca 4.000 x g'de spin.
- Supernatant çıkarın ve MS orta 30 g / L sakaroz ve 300 μM asetoziringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) ile OD600 ile takviye ile bakteriyel pelet resuspend .
- Eksbitki enfeksiyonu
- Adım 3.1.3'te elde edilen bakteriyel süspansiyonu, 10 dakika boyunca 1.4.6'da hazırlanan eksplanda hazırlanan eksplorları içeren konik bir şişeye aşılayın(Şekil 1E).
- Ekstesyonları alın ve steril bibulous kağıt kullanarak kuru lekeler.
4. A. rhizogenes ile eksedek yetiştiriciliği
- 30 g/L sakaroz ve 100 μM AS (MSSAAS orta, pH 5.2) ile takviye edilmiş 7 g/L agar tozu kullanılarak katılaştırılan MS ortamına 9 cm çapında steril bir filtre kağıdı yerleştirin.
- 25 °C'de filtre kağıdına eksmeciyi karanlıkta 3 gün boyunca(Şekil 1F)yerle bir edin.
5. İndüksiyon ve seçici kültür
- MSSA ortamına 500 mg/L sefotaksim ve 50 mg/L kanamisin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) ile takviye edilmiş yaklaşık 20 enfekte eksbitki yerleştirin(Şekil 1G).
- 25 °C ± 1 °C'de ışık koşulunda dikey olarak kuluçkaya yatırın. Tüylü kökler kuluçkadan yaklaşık 1 hafta sonra ortaya çıkar (Şekil 1H siyah çizgi ok uçları tüylü köklerin oluşumunu gösterir).
NOT: Gerekirse her 15 günde bir MSSACK ortamını değiştirin.
6. TB kıllı kökleri alt küle
NOT: Bu işlem güçlü kıllı kökleri hasat etmeyi amaçlamaktadır. Düzenli olarak yayılma sırasında kıllı köklerin büyümesini gözlemleyin ve kirlenmiş ve inaktive olanları zamanında çıkarın. Gerekirse, daha kıllı kökleri yaymak için aşağıdaki adımları tekrarlayın. Bu hasat için subculturing yaklaşık 10-14 gün sürer.
- Beyaz görünüm ve hızlı büyüme gösteren tüylü kökleri seçin.
- 2-3 cm parçalar halinde kesin.
- Açıkça temiz bir bankta numaralandırmak.
- 30 g/L sakaroz ve 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ile takviye edilmiş 5 mL MS orta içeren 100 mL steril konik şişede alt kültür, karanlıkta 25 °C'de 80 rpm'lik bir döner hızda şişenin dibine kadar geniş bir alana yayılana kadar(Şekil 1I).
7. Dönüştürülmüş kıllı köklerin belirlenmesi ve korunması
NOT: Dönüştürülmüş kıllı kökler morfoloji ve gen düzeyi ne göre tanımlanabilir. Tanımlama, bu protokolde yer almayan kıllı kök genomu ve direncine göre de yapılabilir. Bu prosedür öncelikle muhabir gen ve hedef gen tanımlama üzerinde duruluyor.
- Tawny ve kontamine kıllı kökleri çıkarın ve beyaz görünüme sahip olanları seçin.
- Mavi/ışık çift ultraviyole transilluminator altında yeşil floresan olup olmadığını değerlendirin.
- Numaralı tüplerde güçlü bir floresan sinyali sergileyen veya emici bir kağıtla kuruttuktan sonra işaretli bir folyo kullanılarak sarılmış tüylü kökleri seçin.
- Lyophilize sıvı azot, daha fazla araştırma için −80 °C tüm hasat depolama takip.
- Gen tanımlama
- Tüylü köklerin 0,1 g'ını sıvı nitrojende ince toz haline getirin.
- Bitki genomik DNA kiti üreticisinin talimatına göre modifiye cetyltrimethylammonium bromür (CTAB) yöntemi25 kullanarak TB bağımsız transgenik hatlarıgenomik DNA hazırlayın.
- Tablo 2'delistelenen 100 ng genomik DNA şablonu ve astar kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
- Amplifikasyon döngüsünü aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 94 °C'de 5 dk için predenatürasyon, 30 s için 94 °C'de denatürasyon, 30 s için 55 °C'de astar lama ve 30 s için 72 °C'de astar uzatma. 36 döngü ve 10 dakika için 72 °C'de son uzatma adımından sonra amplifikasyon ürünlerini %1 agarose jelüzerinde analiz edin.
- Jelleri nükleik asit le bezle boyandın ve UV ışığı altında görselleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-aracılı Tüberküloz kıllı kök dönüşümü
Bu çalışma, A. rhizogeneskullanarak genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökleri elde etmek için kurulan adım adım protokolü açıklar. Tüberküloz tohumlarının aşılanmasından tespit edilen kıllı köklerin hasadına kadar yaklaşık 5-6 hafta sürdü ve bazı önemli adımlar Şekil 1'de (A-H)gösterilmiştir. Kısaca, steril kabuklu tohumlar daha hızlı steril çimlenme elde etmek için aşılanmış(Şekil 1B)edildi. A. rhizogenes (Şekil 1D) ve steril eksülterikler sırasıyla aktive edilmeli ve önceden hazırlanmalıdır. Bunu, aktive edilmiş A. rhizogenes (Şekil 1E), coculture (Şekil 1F) ve seçici kültür(Şekil 1G)ile eksislerin enfeksiyonu gibi bazı önemli adımlar takip eder. Enfekte eksplants katılaşmış MS orta eşit yerleştirilmelidir ve alan kolayca farklı transgenik hatları ayırmak için aralarında muhafaza edilmelidir. Tüylü kökler eksplants yara bölgelerinde plagiotropic bir şekilde kabarık beyaz bir renk ile görünür (Şekil 1H). Tüylü kökler son derece dallı ve birbirine bağlı bir matris oluşturur ve gerektiği gibi yayılabilir (Şekil 1I). Hasat kıllı kökleri gen fonksiyonu veya gen araştırmak için kullanılabilir- veya protein-protein etkileşimi. Alternatif olarak, Tüberküloz kıllı kökleri, belirlenmiş biyoreaktörlerde rutin gibi ikincil metabolitleri ortaya çıkarmak için kitlesel olarak yayılabilir.
TB'de transgenik kıllı kökleri indükleme yöntemi, GFP ve b4 genlerini taşıyan (henüz yayınlanmamış transgenik faktör bHLH ailesinin bir üyesi) olan ikili vektör(pK7GWIWG2D (II)kullanılarak kanıtlanmıştır. Muhabir gen GFP, mavi/ışık çift ultraviyole transilluminator(Şekil 2) altında sinyali görselleştirerek veya hedef geni tanımlayarak transgenik olmayan kıllı kökleri transgenik olmayan köklerden kolayca ayırt etmek için kullanılmıştır (Şekil 3). Dönüştürülmüş tüylü kökler mavi veya ultraviyole ışık altında aydınlatıldığında yeşil floresan sergiledi (Şekil 2A'dasiyah ok uçları kullanılarak temsil edilir), dönüşümsüz tüylü kökler ise yeşil floresan sergilemedi (Şekil 2B). Yüksek GFP sinyaline sahip kıllı kökler, Şekil 2C'degösterildiği gibi iki hafta boyunca yayıldın.
İkili vektörün tüberküloz genomuna başarılı bir şekilde dönüştürülüp dönüştürülmediğini daha iyi belirlemek için gen tanımlamaları yapılmıştır. Kısaca, TB kıllı köklerin bitki genomik DNA'sı modifiye CTAB yöntemi25'edayalı PCR analizi için hazırlanmıştır. PCR, şekil 3'tebulunan genlerin(Kan, GFPve b4)yükseltilerek gerçekleştirildi. Astarlar Tablo 2'delistelenmiştir. Tüm transgenik hatlarda 3 genin varlığı(Şekil 3, şeritler 5-11)ikili vektörün başarılı bir şekilde Tüberküloz genomuna dönüştürüldüğünü göstermiştir. Kan ve GFP yabani tip köklerde(Şekil 3, şerit 3) ve deneysel negatif kontrolde(Şekil 3, şerit4), b4 ise yabani tip köklerde saptırıldı. Bu 3 gen şüphesiz pozitif kontrolde sunulmuştur (Şekil 3,şerit 2) ancak görünüşe göre negatif kontrolde yoktu ( Şekil3,şerit 4).
Yukarıda bahsedilen kıllı kök sistemi kullanılarak TB'de ışığa bağlı transkripsiyon faktörü FtMYB116'nın değerlendirilmesi
FtMYB116 tüylü kök indüksiyonu yukarıda belirtilen protokol istihdam ile ifade edildi. Bu, FtMYB116 geninin pK7WG2D ikili vektörüne önceden yerleştirilmesi ve gen aşırı ekspresyonunu sağlamak için A. rhizogenes ile bulaşarak gerçekleştirildi. Kısaca, 0.1 g kıllı kökleri sıvı azot kullanılarak ince toz içine triturated edildi. Toplam RNA bitki RNA izolasyon kiti26üreticisinin talimatları izleyerek çıkarıldı. Daha sonra ftMYB116'yı güçlendirmek ve rutin sentez yolu ile ilgili genleri güçlendirmek için ters transkripsiyon PCR ve gerçek zamanlı PCR uygulandı. Daha sonra FtMYB116'nın rutin senteze bağlı gen ekspresyonu ve rutin inkişaat üzerindeki düzenleyici etkileri doğrulandı.
Şekil 4A, TB kıllı köklerin transgenik çizgilerinde FtMYB116'nın göreli ifadesini gösterir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, FtMYB116'nın göreceli ifadesi 3 bağımsız transgenik çizgide de önemli bir artış sergilemiştirilmiştir. Şekil 4B ve Şekil 4C, rutin ve quercetin'in metabolik düzeyde ki biyosentezinin FtMYB116 aşırı ekspresyonu ile teşvik ini göstermektedir. Transjeninde rutin ve quercetin içeriği önemli ölçüde artmıştır(p < 0.01) yabani tiptekilere göre artarak 40 ve 0.5 mg/g FW'ye ulaştı, bunlar yabani tiptekilerin 8 katıydı. ChS, F3H, F3'Hve FLS'nin tüm 3 transgenik hattaki göreceli gen ifadeleri kontrol grubundakilerden oldukça yüksekti (Şekil 4D). Bu sonuçlar birlikte, bu çalışmada açıklanan stratejinin tüberkülozda kıllı kök dönüşümü oluşturmak ve sekonder metabolitlerin gen ekspresyonunu ve metabolik verimini araştırmak için başarıyla kullanılabileceğini doğrulamıştır.
Şekil 1: Tüberkülozda A. rhizogenes-aracılıtransgenik tüylü kökleri indükleyen işlemler. Kritik aşamaların temsili görüntüleri görüntülenir: (A1) ve (A2) tohum kat soyma önce ve sonra temsil; (B) MSSA ortamı içeren bir doku şişesine aşılanmış her 10 tohumu temsil eder; (C) aşıdan 7-10 gün sonra tüberküloz fidelerini gösterir ve kırmızı çizgi ok uçları kesme noktalarını gösterir; (D) ve (E) sırasıyla A. rhizogenes (OD600 = 0.5) ve eksplantenfeksiyonunun hazırlanmasını gösterir; (F) ve (G) mssaas orta ve seçici kültür üzerinde MSSAAS orta ve seçici culturing üzerinde aktif A. rhizogenes ile kokülturing sembolize, sırasıyla; tüylü kökler (H) ortaya, siyah çizgi ok başları gösterildiği gibi; ve (I) kıllı kök oluşumunun yayılmasını gösterir; siyah çizgi ok uçları indüklenen tüylü kökleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GFP muhabiri genini taşıyan ikili vektörün dönüşümü. (A) mavi/ışık çift ultraviyole transilluminator altında incelenen seçici kültür den sonra indüklenen tüylü kökleri gösterir. (B) ve (C) sırasıyla yabani tip kök ve dönüştürülmüş kıllı köklerin yayılmasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 7 bağımsız transgenik hatlarda yabani tip kök ve Tüberküloz un kıllı köklerinden izole genomik DNA'dan(Kan, GFPve b4)genlerin PCR amplifikasyonu. (A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Şerit 1: moleküler boyut belirteçleri (beyaz ok ucu 750 bp gösterir), şerit 2: plazmid (ikili vektör pK7GWIWG2D (II) Kantaşıyan , GFP, ve b4 genleri) pozitif kontrol olarak, şerit 3: vahşi tipi kök, şerit 4: saflaştırılmış H2O negatif kontrol olarak, ve şeritler 5-11: 7 trans-bağımsız hatları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FtMYB116'nın TB kıllı köklerinin transgenik çizgilerinde göreceli ifadesi. (A) ve FtMYB116'nın aşırı ekspresyonunun (B) rutin ve (C) quercetin 'in biyosentezi üzerindeki promotif etkisi (Bu rakam Dong ve ark.5'tendeğiştirilmiştir). Deneyler triplicate yapıldı ve 3 kez yapıldı. "**" p < 0.01'de Öğrencinin tt-testini kullanarak önemli bir fark gösterir. (D) Transgenik hatlarda flavonoid sentez yolları ile ilgili genlerin ekspresyonu. Göreli ifade düzeyi aktin denetimine göre normalleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya | Orta malzemeler | ||
| MSSA | Murashige ve Skoog (MS) orta 30 g /L sakaroz içeren ve 7 g / L, pH 5.8 agar tozu | ||
| YEBARS | Maya Mannitol Orta (YEB) 15 g /L, rifampisin 50 mg /L ve spectinomisin içeren 50 mg /L, pH 7.0 | ||
| YEBRS | 50 mg/L'de rifampisin, 50 mg/L'de spektinomisin içeren YEB, pH 7.0 | ||
| MSSAS | 30 g/L'de sakaroz, 300 μM'de asetoz (AS), pH 5.8 | ||
| MSSAA | 30 g/L'de sakaroz, 7g/L'de agar tozu ve 100μM'de AS içeren MS orta, pH 5.2 | ||
| MSSACK | 30 g/L'de sakaroz, 7 g/L'de agar tozu, 500 mg/L'de sefotaksim ve 50 mg/L'de kanamisin (kan) içeren MS orta | ||
| MSSK | 30 g/L'de sakaroz, 50 mg/L'de kan içeren MS orta, pH 5.8 | ||
Tablo 1: Medya ve bunların malzemeleri.
| Astar | Sıra (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAAGCGGCCA | |
Tablo 2: Astar dizisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüberküloz genetik ve metabolik düzeylerde sekonder metabolitleri ile ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır1,2,5,27,,28. Kıllı kök kültürü, metabolit üretimi için benzersiz bir kaynak olarak, metabolik mühendislik önemli bir rol oynar29 ve ilgili genler ekleyerek metabolik yolları değiştirmek için kullanılabilir. Kim ve ark.2 başlangıçta A. rhizogenes-fenomenbileşiklerin üretimini elde etmek için transformasyon aracılı tarafından Tüberküloz kıllı kök kültürlerin kurulması tanıttı. Tüberküloz kıllı köklerinde elde ettikleri rutin içeriği yabani tip köklerde olduğundan 10 kat daha fazlaydı. Bu çalışmada FtMYB116'nın piyasaya sürülmesi rutine bağlı genlerin daha yüksek bir ekspresyonuna yol açmış ve tüberküloz kıllı köklerinde rutin üretimini artmıştır. Bu teknik, TB kıllı köklerde FtF3H ve FtFLS gibi fenilpropanoid ilişkili genlerin fenilpropanoid ilişkili genlerin fenotipik karakterizasyonu ve ekspresyonu için uygun olduğu doğrulanmıştır5,30,31. Zhang ve ark.32 FtMYB transkripsiyonel faktörlerin bir dizi overexpressing rutin üretimini araştırmak için TB kıllı kökleri kullanılır. Zhou ve ark.33 TB kıllı kökleri FtMYB11 aşırı ifade nedeniyle rutin içeriğinde bir azalma gözlendi. Bu sonuçlar bulgularımızla birlikte tüylü kök transformasyonunun FtMYB transkripsiyonel faktörleri ile rutin biyosentezle ilgili genler arasındaki etkileşim üzerindeki uygulanabilir etkilerini göstermektedir.
Tüberküloz kıllı köklerin indüksiyonu için adım adım protokolile ilgili sınırlı veri olmasına rağmen, transgenik TB kıllı köklerin ikili vektör taşıyan A. rizogenler kullanılarak verimli ve kararlı bir şekilde elde edilmesi için ilk kez adım adım protokolü açıklıyoruz. Bu deneysel süreçler sırasında, çok sayıda faktör dikkatle optimal indüklenen tüylü kökleri elde etmek için dikkate alınması gerekir. İlk olarak, eksbitki seçimi belirleyici bir faktördür. Tüberküloz çeşitlerinin kıllı köklerin morfolojisini ve fenolik bileşiklerin üretimini etkilediği bilinmektedir. Thwe ve ark.30 fenilpropanoid biyosentetik yoldaki gen ekspresyonunun ve fenolik bileşiklerin içeriğinin Tüberküloz çeşitleri arasında farklılık gösterdiğini göstermişti. Onlar da bir çeşit kıllı kökleri bulundu, hangi derin kırmızımsı-mor onun antosiyanin içeriği nedeniyle13. Çalışmamızda eksbitki olarak 2 yeni ortaya çıkan cotyledon ve hypocotyls seçilmiştir. Genç ve ihale yaprakları yüksek tüylü kök indüksiyon oranı2lehine olmasıdır,30, son derece farklılaşmış ve eski bitki hücreleri olumsuz kıllı kök indüksiyon etkiler ise. İkinci olarak, A. rhizogenes suş kıllı kök indüksiyon üzerinde önemli bir etkisi vardır. Farklı bakteriyel suşları morfolojileri ve tüylü köklerin indüksiyon verimliliği açısından farklı dönüşüm yetenekleri sergilemek, hangi suşları tarafından barındırılan farklı plazmidler tarafından aydınlatılabilir34. Aye ve ark.35, çeşitli A. rhizogenes suşlarının (R1000, R1200, 15834, LBA9402 ve A4) TB kıllı kök indüksiyonu ve fenilpropanoid biyosentez üzerindeki etkilerini karşılaştırarak, TB'deki kıllı kök üretimi için en umut verici suşların R1000 olduğunu ortaya koydu. Bu bulgu Kim ve ark.2 yine de Accc10060 tarafından desteklenmiş, ancak çalışmamızda kullanılan accc10060 suş tatmin edici enfeksiyon verimliliği sergilemiştir. Bizim protokol kullanılarak elde edilen tüylü köklerin kabarık beyaz görünümü Salvia miltiorrhiza36üretilen kıllı kökleri ile uyum içinde , aynı gerginlik ACCC10060 ikili vektör pK7GWIWG2D taşıyan (II) hedef gen susturmak için kullanılmıştır. Üçüncü olarak, malzemelerin ön işleme ve seçici kültürde sefotaksim konsantrasyonu da kıllı kök indüksiyon hayati rol oynamaktadır degerming. Herhangi bir adımda eksik dezenfeksiyon kıllı kök dönüşümü başarısızlık yol açabilir. Buna ek olarak, bakteri konsantrasyonu dönüştürülmüş köklerin üretimi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Yüksek konsantrasyonlar rekabetçi inhibisyon ile bitki hücrelerini azaltabilir, düşük konsantrasyonlarda düşük kullanılabilirlik neden olabilir ise4.
Ayrıca, büyüme ortamı gibi kültür koşulları, uygun prekülturing ve kokülturing zaman, ve diğer biyotik veya abiyotik faktörler kıllı kök endükton önemli bir rol oynamaktadır. Huang ve ark.37 maksimum TB kıllı kökleri elde etmek için cocultivation için 30 g / L konsantrasyonda sakaroz içeren 1 / 2 MS orta önerilir. Bu tüylü kök oluşumu için uygun yüksek tuz orta ile açıklanabilir, düşük tuz orta aşırı bakteriyel çarpma lehine ise34. AS Agrobacterium 34 vir bölgenin transkripsiyonu ile bitki türlerinin bir dizi A. rhizogenes-aracılı dönüşümü kolaylaştırabilir fenolik bileşik türüdür34,38, ve vir etkili bir pH ile bir ortamda indüklenebilir < 5.739,40. Bu nedenle, 100 μM AS ile desteklenen pH 5.2 ile bir coculture ortamı öneririz. Huang ve ark.37 tb kıllı kökleri beyaz ve soluk sarı dan gün 24 sonra kahverengi döndü bildirdi. Bu nedenle, her 24 günde bir kıllı kökleri alt kültüre; ancak, kıllı köklerin esmerleşmesini önlemek için her iki haftada bir boyun eğdirmenizi öneririz. Buna ek olarak, ışık gibi çevresel koşullar, hormonlar, sıcaklık, ve UV radyasyonu flavonoid biyosentez ile ilgili genlerin ekspresyonunu son derece uyarıcı veya depresif sinyal transdüksiyon41,42etkiler görünür. Bir önceki çalışma, Tüberküloz kıllı köklerinde rutin ilişkili gen ekspresyonunun izlenmesinde uzak kırmızı ışığın önemini göstermiştir5.
A. rhizogenes-aracılıdönüşüm, bir ikili vektör eklenen ilgi herhangi bir eksojen gen aşırı ekspresyon elde etmek için dönüştürülmüş tüylü kök klon34 transfer edilebilir avantajı vardır, RNA susturma yoluyla fonksiyon kaybı43, veya transkripsiyon analizleri ile yeni metabolik genlerin keşfi5. Tüylü kökleri ikincil metabolitleri üretmek için büyük bir potansiyele sahip, rekombinant proteinler, ve evenantikorlar44. Bu öncelikle hormonsuz ortamda kolay ve hızlı büyüme nedeniyle, daha az pahalı olmak, komple bitkiler içine rejenerasyon için bir gereklilik21, ve ikincil metabolitlerin nispeten yüksek verim bu başlangıç bitki malzeme31göre . Bu kökler aynı zamanda biyosentetik kapasite ve fenotipleri koruyan uzun vadeli, kararlı ve karakterize kök klonları kurmak için orijinal ekstrandan ayrılabilir. Bu bulgulara dayanarak, bu protokol ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için dönüştürülmüş kıllı kökler üretmek için hızlı, farklı ve verimli bir yöntem sağlar ve diğer bitkilerde kıllı kök indüksiyonu için bir referans ortaya koyar. Ancak, biyoaktif bileşiklerin büyük verimleri oluşturmak için tüylü kök kültürleri keşfetmek için potansiyel oksijen kaynağı gibi belirli parametrelerin söz konusu olması gereken uygun biyoreaktör sistemine bağlıdır4,8. Bu protokol tüylü köklerde elde edilen sekonder metabolitlerin üretimi ve renk varyansı ve ikincil metabolitlerin içeriği gibi fonksiyonel genlerin görselleştirilmiş fenotipini araştırmak için sınırlıdır; ancak, kıllı köklerden rejenere bitkilerin elde edilmesine bakılmaksızın tüm bitkideki henotik değişiklikler bu çalışmada değerlendirilememiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Merkezi kamu refahı araştırma enstitüleri ZXKT17002 için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
