Summary
Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.
Abstract
Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l'asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell'espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l'espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l'adattamento.
Introduction
Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate3.
Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)5,6 ed è comunemente accompagnato dall'integrazione e dall'espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa7. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni8. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside,in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, e i composti fenolici in23.13
Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie14. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e cicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche2. Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.21 ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l'iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) 22. Inoltre, Supaart et al.23 ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido1-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.
Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L'esperimento durò 5-6 settimane, dall'inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell'espianto, l'infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l'accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3'-hydroxylase (F3'H), e flavonol synthase (FLS)24 sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l'espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.
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Protocol
La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di "JinQiao No.2" coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1.
NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni di espiantazioni sono state condotte sotto la condizione di una luce di 14 ore e di un fotoperiodo scuro di 10-h a 25 gradi centigradi. Se non diversamente specificato, tutte le operazioni relative agli espiatori o ai batteri sono state eseguite in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare. Tutti gli ingredienti dei media per A. rhizogenes e colture vegetali in vitro sono forniti nella tabella 1. Dopo aver regolato il pH, tutti i supporti sono stati autoclaventi a 120 gradi centigradi per 20 min.
AVVISO: Depositare tutti i batteri e le piante geneticamente modificati nel contenitore dei rifiuti appropriato. Azionare tutte le sostanze chimiche pericolose in un armadio dei fumi e depositarle nel contenitore dei rifiuti pericolosi.
1. Preparazione di espianti TB
- Preparazione di semi di TB
- Selezionare i semi di TB paffuti e non danneggiati (Figura 1A1) che sono stati conservati ad una temperatura inferiore a 20 gradi centigradi per non più di 2 anni.
- Immergere i semi in acqua a 28 gradi centigradi per circa 20 min in modo che il mantello del seme possa essere facilmente staccato (Figura 1A2). Se necessario, utilizzare le forbici per tagliare una fessura sui semi per facilitare il peeling.
- Sterilizzazione dei semi di TB
- Mettere 100-200 semi sbucciati in un fiascheta conico sterilizzato da 100 mL.
- Disinfettare i semi utilizzando 75% etanolo per 30 s.
- Sostituire l'etanolo con 5% di ipocloreto e disinfettare per 15 min.
NOTA: La disinfezione con bicloruro di mercurio ad una concentrazione di 1 g/L per 8 min può essere utilizzata come sterilizzatore alternativo per sostituire l'ipoclorito di sodio in caso di sterilizzazione inadeguata.
AVVISO: il bicloruro di mercurio è pericoloso e non è un materiale rispettoso dell'ambiente. Azionarlo nell'armadio fumante e depositarlo nel contenitore dei rifiuti pericolosi, se in ogni caso viene utilizzato il bicloruro di mercurio. - Versare l'ipoclorite di sodio.
- Lavare i semi con acqua sterile deionizzata 5 volte.
- Asciugare i semi con una carta bibulosa sterile.
- Preparazione delle piantine della TB
- Preparare 50 mL Murashige e Skoog (MS) basale medium (1962) integrato con 30 g/L di saccarosio e 7 g/L di polvere di agar (MSSA) (Tabella 1) in una bottiglia di coltura di tessuto vegetale da 300 mL.
- Regolare il pH a 5.8 prima di autoclaving.
- Distribuire 10 semi in modo uniforme per bottiglia di mezzo MSSA.
- Germinai i semi in una sala di coltura a 25 gradi centigradi e 1oC alle condizioni di luce per 7-10 giorni.
- Preparazione di espianti sterili
- Selezionare piantine robuste di TB (Figura 1C), quando i 2 pezzi di cotiledoni sono spiegati.
- Tagliare le piantine dalle radici (Figura 1Cfrecce tratteggiate rosse), evitando il contatto con il mezzo.
- Mettetele in una sterile piastra Petri.
- Tagliare gli ipocotilli in segmenti di 0,8-1 cm e tagliare i cotiledoni in pezzi di circa 0,5 cm.
- Precoltura questi esplants su MSSA media sotto la condizione di luce per 24 h.
- Trasferirli in un flacone conico sterilizzato da 100 mL, che ora sono pronti per l'infezione.
2. Preparazione di A. rhizogenes per la trasformazione
NOTA: Il ceppo A. rhizogenes ACCC10060 è stato gentilmente fornito dall'Istituto di sviluppo vegetale medicinale e conservato a 80 gradi centigradi. A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7GWIWG2D (II) che ospita un DNA T che trasporta il gene b4 che accompagna un GFP come gene indicatore e il gene di resistenza Kan come marcatore selezionabile. Il gene b4 è un membro della famiglia bHLH del fattore di trascrizione, che non è ancora stata pubblicata. Per valutare il potenziale delle radici pelose della TB, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7WG2D contenente il gene MYB116 per studiarne l'effetto sulla produzione di metaboliti secondari come i flavonoidi a livello di espressione genica e mediante analisi metaboliche. Attivati A. rizogeni devono essere ben preparati allo stesso tempo con gli espianti.
- Attivazione di A. rizogeni
- Scongelo A. rhizogenes sul ghiaccio
- Immergere i batteri e allinearli uniformemente su lievito mannitolo medio (YEB) integrato con 15 g/L polvere di agar, 50 mg/L rifampicina, e 50 mg/L spettronomina (YEBARS, pH 7.0).
- Incubare i batteri a 28 gradi centigradi per 12-16 h.
- Scegli una colonia monoclonale e coltiva in un altro piatto Petri nello stesso modo sopra descritto.
- Selezionare colonie monoclonali e colture in un fiaschetta conica sterilizzata 100 mL contenente 20 mL di YEB medio integrato con 50 mg/L rifampicina e 50 mg/L spettronomina (YEBRS, pH 7.0) a 28 gradi C e 200 rpm per 16-18 h fino a quando i valori OD600 raggiunge 2,0.
- Incubare il 2%-4% della coltura di cui sopra in un altro flacone conico da 100 mL contenente 20 mL di yEBRS medio a 28 e 200 rpm per 4-5 h fino a quando il valore di OD600 non raggiunge circa 0,5 (Figura 1D).
3. Infezione e screening degli esoti della TB
NOTA: L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottenere radici pelose geneticamente trasformate. Le radici di tipo selvaggio sono state usate come controllo negativo per valutare l'espressione transgenica. In questo protocollo, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario o pK7WG2D che trasporta il gene di FtMYB116 o pK7GWIWG2D (II) portando il gene di b4 in anticipo.
- Sospensione di A. rhizogenes
- Trasferire la coltura ottenuta al punto 2.1.6 in un tubo centrifugo sterilizzato da 50 mL.
- Girare a 4.000 x g per 10 min a 20 gradi centigradi.
- Togliere il supernatante e risospendere il pellet batterico con mezzo MS integrato con 30 g di saccrosio e 300 acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5,8) a OD600 x 0,2.
- Infezione degli espianti
- Infondere la sospensione batterica ottenuta nel passaggio 3.1.3 in un flacone conico contenente gli espianti preparati nel passaggio 1.4.6 per 10 min (Figura 1E).
- Togliere gli espianti e asciugarli con una carta bibulosa sterile.
4. Cocultura di espiante con A. rhizogenes
- Posizionare una carta filtrante sterile di 9 cm di diametro sul mezzo MS, che viene solidificata utilizzando polvere di agar 7 g/L integrata con 30 g/L di saccarosio e 100 - M AS (medium MSSAAS, pH 5.2).
- Sovrapporre gli espianti sulla carta da filtro a 25 gradi centigradi per 3 giorni al buio (Figura 1F).
5. Induzione e cultura selettiva
- Posizionare circa 20 espianti infetti sul mezzo MSSA integrati con 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).
- Incubarli verticalmente a 25 gradi centigradi e 1 gradi centigradi. Le radici pelose si verificano circa 1 settimana dopo l'incubazione(Figura 1H punta di freccia black-dash indicano presenza di radici pelose).
NOTA: Se necessario, sostituire il supporto MSSACK ogni 15 giorni.
6. Subculturing TB radici pelose
NOTA: Questa procedura mira a raccogliere le radici pelose vigorose. Osservare regolarmente la crescita delle radici pelose durante la propagazione e rimuovere quelle contaminate e inattivate in modo tempestivo. Se necessario, ripetere i passaggi seguenti per propagare più radici pelose. Ci vogliono circa 10-14 giorni dalla subcultura alla raccolta.
- Selezionare le radici pelose mostrando l'aspetto bianco e la rapida crescita.
- Tagliarli a pezzi di 2-3 cm.
- Chiaramente numerati su una panchina pulita.
- Sottocolturali in un pasciolo conico sterilizzato da 100 mL contenente 5 mL di mezzo MS integrati con 30 g/L di saccarosio e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ad una velocità rotativa di 80 giri a 25 gradi centigradi al buio fino a quando non si diffondono sul fondo del pallone (Figura 1I).
7. Identificazione delle radici pelose trasformate e conservazione
NOTA: Le radici pelose trasformate possono essere identificate in base agli aspetti della morfologia e del livello genico. L'identificazione può anche essere condotta in base al genoma della radice pelosa e alla resistenza, che non sono coperti in questo protocollo. Questa procedura si concentra principalmente sull'identificazione genica e del gene bersaglio dei reporter.
- Rimuovere le radici pelose e contaminate e selezionare quelle con aspetto bianco.
- Valutare se c'è fluorescenza verde sotto un transilluminatore ultravioletto doppio blu/leggero.
- Selezionare le radici pelose che presentano un forte segnale di fluorescenza nei tubi numerati o avvolte con una tinfoil marcata dopo averle asciugate con una carta assorbente.
- Liofiloli in azoto liquido, seguito dalla conservazione di tutto il raccolto a 80 gradi centigradi per ulteriori indagini.
- Identificazione genica
- Triturare 0,1 g di radici pelose in polvere fine in azoto liquido.
- Preparare il DNA genomico delle linee transgeniche indipendenti della TB utilizzando il metodo modificato del bromuro di cetyltrimethylammonium (CTAB)25 secondo l'istruzione del produttore del kit di DNA genomico vegetale.
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando 100 ng di modello di DNA genomico e primer elencati nella tabella 2.
- Eseguire il ciclo di amplificazione come segue: prenaturazione a 94 gradi centigradi per 5 min, denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, primer annealing a 55 gradi centigradi per 30 s e estensione primer a 72 s per 30 s. Dopo 36 cicli e un passo di estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min, analizzare i prodotti di amplificazione su gel agarose 1%.
- Macchiare i gel con colorazione dell'acido nucleico e visualizzarli sotto la luce UV.
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Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosa
Questo studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall'inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzati sono stati inoculati (Figura 1B) per ottenere una germinazione sterile più veloce. A. rizogene (Figura 1D) ed espianti sterili devono essere attivati e preparati in anticipo, rispettivamente. Segue alcuni passaggi chiave, tra cui l'infezione di espianti con a. a. rhizogenes attivato (Figura 1E), cocultura (Figura 1F) e cultura selettiva (Figura 1G). Gli espianti infetti devono essere posizionati uniformemente sul mezzo MS solidificato e lo spazio deve essere mantenuto tra di loro per separare facilmente le diverse linee transgeniche. Radici pelose appaiono con un colore bianco soffice in modo plagiotropico nei siti di ferita degli espianti (Figura 1H). Le radici pelose formano una matrice altamente ramificata e interbloccata e possono essere propagate come richiesto (Figura 1I). Le radici pelose raccolte possono essere utilizzate per studiare la funzione genica o l'interazione genica o proteina-proteina. In alternativa, le radici pelose della TB possono essere massicciamente propagate per produrre metaboliti secondari come la rutina nei bioreattori designati.
Il metodo per indurre radici pelose transgeniche nella TB è stato dimostrato utilizzando un vettore binario (pK7GWIWG2D (II)) che trasporta i geni GFP e b4 (un membro della famiglia bHLH del fattore trascrizionale, non ancora pubblicato). Il gene reporter GFP è stato utilizzato per distinguere facilmente le radici pelose transgeniche da quelle non transgeniche visualizzando il segnale sotto un transilluminatore ultravioletto blu/leggero (Figura 2) o identificando il gene bersaglio (Figura 3). Le radici pelose trasformate mostravano fluorescenza verde quando illuminate sotto la luce blu o ultravioletta (rappresentate con punte di freccia nere nella Figura 2A), mentre le radici pelose non trasformate non mostravano la fluorescenza verde (Figura 2B). Le radici pelose con un segnale GFP elevato sono state propagate per una quindicina di giorni, come illustrato nella Figura 2C.
Per identificare ulteriormente se il vettore binario è stato trasformato con successo nel genoma della TB, sono state condotte identificazioni geniali. In breve, il DNA genomico vegetale delle radici pelose della TB è stato preparato per l'analisi PCR basata sul metodo CTAB modificato25. La PCR è stata eseguita amplificando i geni (Kan, GFPe b4), che erano presenti rispettivamente nella Figura 3. I primer sono elencati nella tabella 2. La presenza dei 3 geni in tutte le linee transgeniche (Figura 3, corsie 5-11) ha indicato che il vettore binario è stato trasformato con successo nel genoma della TB. Kan e GFP erano assenti nelle radici wild (Figura 3, corsia 3) e controllo negativo sperimentale ( Figura3, corsia 4), mentre b4 è stato rilevato nelle radici di tipo selvatico. Questi 3 geni sono stati indubbiamente presentati nel controllo positivo (Figura 3, corsia 2) ma erano apparentemente assenti nel controllo negativo ( Figura3, corsia 4).
Valutazione del fattore di trascrizione indotta dalla luce FtMYB116 nella TB utilizzando il suddetto sistema di radice pelosa
FtMYB116 è stato espresso impiegando il protocollo di cui sopra di induzione radice pelosa. Ciò è stato ottenuto preinserendo il gene FtMYB116 nel vettore binario pK7WG2D e poi infettando con A. rhizogenes per ottenere la sovraespressione genica. In breve, le radici pelose di 0,1 g sono state triturate in polvere fine utilizzando azoto liquido. L'RNA totale è stato estratto seguendo le istruzioni del produttore del kit di isolamento dell'RNA vegetale26. Poi la codifica inversa PCR e PCR in tempo reale sono stati eseguiti per amplificare ftMYB116 e rutin synthesizing geni correlati alla via. Successivamente sono stati verificati gli effetti regolatori del FtMYB116 sull'espressione genica correlata alla sintesi della rutina e sul rendimento della rutina.
Figura 4A mostra l'espressione relativa di FtMYB116 nelle linee transgeniche di radici pelose TB. Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione relativa del FtMYB116 ha mostrato un notevole aumento in tutte e 3 le linee transgeniche indipendenti. Figura 4B e Figura 4C illustrano la promozione della biosintesi di rutina e quercetina a livello metabolico attraverso la sovraespressione FtMYB116. Il contenuto di rutina e quercetina nel transgenico è stato significativamente aumentato (p < 0.01) è aumentato rispetto a quelli del tipo selvaggio, raggiungendo rispettivamente 40 e 0,5 mg/g di FW, che erano 8 volte quelli nel tipo selvaggio. Le espressioni geniche relative di CHS, F3H, F3'He FLS in tutte e 3 le linee transgeniche erano notevolmente superiori a quelle del gruppo di controllo (Figura 4D). Insieme, questi risultati hanno confermato che la strategia descritta in questo studio potrebbe essere utilizzata con successo per generare la trasformazione della radice pelosa nella TB e studiare l'espressione genica e la resa metabolica dei metaboliti secondari.
Figura 1: Processi per indurre radici pelose transgeniche mediate da A. rhizogenesnella TB. Vengono visualizzate le immagini rappresentative delle fasi critiche: (A1) e (A2) rappresentano prima e dopo aver staccato i cappotti dei semi; (B) rappresenta ogni 10 semi inoculati in una bottiglia di tessuto contenente mezzo MSSA; (C) indica le piantine di TB a 7-10 giorni dopo l'inoculazione, e le punte di freccia rosso-trattino mostrano i punti di taglio; (D) e (E) indicano rispettivamente la preparazione di A. rhizogenes (OD600 x 0,5) e l'infezione degli espianti; (F) e (G) simboleggiano la coculturazione con A. rhizogenes attivati sul mezzo MSSAAS e sulla coltura selettiva sul mezzo MSSACK, rispettivamente; radici pelose emergono da (H), come mostrato dalle punte di freccia nero-trattino; e (I) mostra la propagazione della formazione di radici pelose; le punte di freccia nero-trattino indicano le radici pelose indotte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trasformazione del vettore binario che porta il gene del reporter GFP. (A) denota le radici pelose indotte dopo la cultura selettiva esaminata sotto il transilluminatore ultravioletto blu/leggero doppio. (B) e (C) rappresentano rispettivamente la radice di tipo selvaggio e la propagazione delle radici pelose trasformate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: amplificazione PCR di geni (Kan, GFPe b4) dal DNA genomico isolato dalla radice wild-type e dalle radici pelose di TB in 7 linee transgeniche indipendenti. (A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Corsia 1: marcatori di dimensioni molecolari (freccia bianca indica 750 bp), corsia 2: plasmide (vettore binario pK7GWIW2D (II) che trasportano i geni Kan, GFPe b4) come controllo positivo, corsia 3: radice di tipo selvaggio, corsia 4: purificata H2O come controllo negativo, e corsie 5–11: le 7 linee transgeniche indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espressione relativa di FtMYB116 nelle linee transgeniche delle radici pelose della TB. (A) e l'effetto promotivo della sovraespressione del FtMYB116 sulla biosintesi della solina (B) e della quercetina (C) (Questa cifra è stata modificata da Dong et al.5). Gli esperimenti sono stati effettuati in triplice copia e condotti 3 volte. Il simbolo "" indica una differenza significativa in p < 0.01 utilizzando il test tdi Student. (D) Espressione dei geni correlati ai percorsi di sintesi dei flavonoidi nelle linee transgeniche. Il livello di espressione relativo è stato normalizzato a quello del controllo actin. I dati sono presentati come media : deviazione standard (n - 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Media | Ingredienti medi | ||
| MSSA | Murashige e Skoog (MS) contengono saccarosio in 30 g/L e polvere di agar in 7 g/L, pH 5,8 | ||
| YEBARS (Informazioni in stati inequi) | Lievito Mannitol Medium (YEB) contenente polvere di agar a 15 g/L, rifampicina a 50 mg/L e spettronomina a 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| YEBRS (Informazioni in stati inequi) | YEB contenente rifampicina a 50 mg/L, e spettronomica a 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| MSSAS (informazioni in base alle malattie squi | Mezzo ms contenente saccarosio a 30 g/L, e acetosyringone (AS) a 300 m, pH 5,8 | ||
| MSSAA | Mezzo MS contenente saccarosio a 30 g/L, polvere di agar a 7g/L e AS a 100 m, pH 5,2 | ||
| MSACK | Mezzo MS contenente saccarosio a 30 g/L, polvere di agar a 7 g/L, cefotaxime a 500 mg/l e kanamicina (kan) a 50 mg/L, pH 5,8 | ||
| MSSK | Mezzo MS contenente saccarosio a 30 g/L e kan a 50 mg/L, pH 5,8 | ||
Tabella 1: I media e i loro ingredienti.
| Primer | Sequenza (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTC | |
| b4-F | AAATCTCTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGGGGGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAGCGGCCA | |
Tabella 2: sequenza di primer.
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Discussion
La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni correlati. Kim et al.2 inizialmente introdusse la creazione di colture di radici pelose di TB da parte di A. rhizogenes-ha mediato la trasformazione per ottenere la produzione di composti fenolici. Il contenuto di rutina che hanno ottenuto nella TB radici pelose era più di 10 volte superiore a quello nelle radici wild-type. Nel presente studio, l'introduzione di FtMYB116 ha portato ad una maggiore espressione dei geni correlati alla rutina e ha aumentato la produzione di rutina nelle radici pelose della TB. Questa tecnica è stata confermata per essere adatta per la caratterizzazione fenotipica e l'espressione di geni correlati ai fenilpropanoidi come FtF3H e FtFLS nelle radici pelose della TB5,30,31. 32 TB ha usato radici pelose di TB per studiare la produzione di rutina esesprimendo in modo esagerato una serie di fattori trascrizionali FtMYB. 33 ha osservato una diminuzione del contenuto di rutina a causa della sovraespressione del FtMYB11 nelle radici pelose della TB. Questi risultati insieme ai nostri risultati indicano gli effetti possibili della trasformazione delle radici pelose sull'interazione tra i fattori trascrizionali FtMYB e i geni correlati alla derivazione della rutina.
Anche se ci sono dati limitati riguardanti un protocollo passo-passo per l'induzione di radici pelose di TB, abbiamo descritto qui nel protocollo passo-passo per la prima volta per ottenere radici pelose TB transgeniche in modo efficiente e stabile utilizzando A. rhizogenes recanti un vettore binario. Durante questi processi sperimentali, numerosi fattori devono essere attentamente considerati per ottenere le radici pelose indotte ottimali. In primo luogo, la selezione degli espianti è un fattore determinante. Cultivar tb sono noti per influenzare la morfologia delle radici pelose e la produzione di composti fenolici. Thwe et al.30 ha illustrato che l'espressione genica nel percorso biosintetico fenilpropanoide e il contenuto dei composti fenolici variavano tra le cultivar di TB. Hanno anche trovato radici pelose in una cultivar, che era profonda rosso-viola a causa del suo contenuto di antocianina13. Nel nostro studio, sono stati selezionati come espianti 2 cotiledoni e ipocotilli appena spiegati. Questo perché le foglie giovani e tenere favoriscono un alto tasso di induzione della radice pelosa2,30, mentre le cellule vegetali altamente differenziate e vecchie influenzano negativamente l'induzione della radice pelosa. In secondo luogo, il ceppo di A. rhizogenes ha un impatto significativo sull'induzione della radice pelosa. Diversi ceppi batterici presentano diverse capacità di trasformazione in termini di morfologie ed efficienza di induzione delle radici pelose, che possono essere illuminate dai diversi plasmidi harborta dai ceppi34. 35 aye et al.35 ha confrontato gli effetti di diversi ceppi Di. rhizogenes (R1000, R1200, 15834, LBA9402 e A4) sull'induzione e sulla biosintesi fenilpropanoide della TB e ha scoperto che il ceppo più promettente per la produzione di reti pelose nella TB di tubere di capelli era R1000. Questa constatazione è stata sostenuta da Kim et al.2 Tuttavia, il ceppo ACCC10060 che è stato escluso nello studio di Aye et al. ma utilizzato nel nostro studio ha mostrato soddisfacente efficienza infezione. L'aspetto bianco soffice delle radici pelose ottenuto utilizzando il nostro protocollo è in accordo con le radici pelose generate in Salti miltiorrhiza36, in cui nello stesso ceppo ACCC10060 che trasportava il vettore binario pK7GWIWG2D (II) è stato utilizzato per silenzare il gene bersaglio. In terzo luogo, il degerming, compreso il pretrattamento dei materiali e la concentrazione di cefotaxime nella cultura selettiva, svolgono anche un ruolo vitale nell'induzione delle radici pelose. La disinfezione incompleta in qualsiasi fase potrebbe portare al fallimento della trasformazione della radice pelosa. Inoltre, la concentrazione batterica ha un'influenza significativa sulla produzione di radici trasformate. Alte concentrazioni possono ridurre le cellule vegetali da inibizioni competitive, mentre basse concentrazioni possono causare scarsa disponibilità4.
Inoltre, le condizioni culturali come il mezzo di crescita, il tempo opportuno di precultura e cocultura e altri fattori biotici o abiotici svolgono un ruolo importante nell'induzione delle radici pelose. Huang et al.37 consigliato un mezzo da 1/2 MS contenente saccarosio ad una concentrazione di 30 g/L per la cocoltivazione per ottenere il massimo TB radici pelose. Questo può essere spiegato dal mezzo di sale alto che è adatto per la formazione di radici pelose, mentre un mezzo basso sale favoriscel'eccessivamoltiplicazione batterica 34 . AS è un tipo di composto fenolico che può facilitare la trasformazione mediata da A. rhizogenesin un certo numero di specie vegetali dalla trascrizione della regione vir di Agrobacterium34,38, e vir potrebbe essere efficacemente indotta in un mezzo con un pH di < 5.739,40. Si consiglia pertanto un mezzo di cocoltura con pH 5.2 integrato con 100 M di AS. Huang et al.37 ha riferito che le radici pelose della TB sono diventate marroni dopo il giorno 24 dal bianco e dal giallo pallido. Pertanto, hanno subcolto radici pelose ogni 24 giorni; tuttavia, si consiglia di subculturing ogni due settimane per evitare l'antardatura delle radici pelose. Inoltre, le condizioni ambientali come la luce, gli ormoni, la temperatura e la radiazione UV sembrano influenzare l'espressione dei geni della biosintesi flavonoide stimolando o deprimendo la trasduzione del segnale41,42. Lo studio precedente ha dimostrato l'importanza della luce rossa lontana nel monitoraggio dell'espressione genica correlata alla rutina nelle radici pelose della TB5.
La trasformazione Mediata A. rizogenesha il vantaggio che qualsiasi gene esogeno di interesse inserito in un vettore binario può essere trasferito al clone della radice pelosa trasformata34 per ottenere la sovraespressione, la perdita di funzione tramite il silenziamento dell'RNA43,o la scoperta di nuovi geni metabolici mediante analisi trascrittomi5 . Le radici pelose hanno un grande potenziale per produrre metaboliti secondari, proteine ricombinanti e persinoanticorpi44. Ciò è dovuto principalmente alla loro crescita facile e rapida nel mezzo privo di ormoni, essendo meno costoso, nessun requisito di rigenerazione in piante complete21, e la resa relativamente elevata di metaboliti secondari rispetto a quella del materiale vegetale di partenza31. Queste radici possono anche essere separate dall'espianto originale per stabilire cloni di radici stabili a lungo termine e caratterizzati mantenendo la loro capacità biosintetica e fenotipi. Complessivamente, sulla base di questi risultati, questo protocollo fornisce un metodo rapido, distinto ed efficiente per produrre radici pelose trasformate per studiare la produzione di metaboliti secondari e propone un riferimento per l'induzione delle radici pelose in altre piante. Tuttavia, il potenziale di esplorare colture piaghe delle radici per generare enormi rese di composti bioattivi dipende dal sistema di bioreattore appropriato in cui alcuni parametri come la fornitura di ossigeno devono essere interessati4,8. Questo protocollo è limitato alla produzione di metaboliti secondari derivati nelle radici pelose e per studiare il fenotipo visualizzato dei geni funzionali come la varianza del colore e il contenuto dei metaboliti secondari; tuttavia, i cambiamenti fenotipici nell'intera pianta indipendentemente dall'ottenimento di piante rigenerate dalle radici pelose non potevano essere valutate in questo studio.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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