Summary
Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.
Abstract
L’approche d’assemblage ascendante pour la construction de cellules synthétiques est un outil efficace pour isoler et étudier les processus cellulaires dans un environnement imitant les cellules. En outre, le développement de systèmes d’expression sans cellules a démontré la capacité de reconstituer les processus de production, de transcription et de traduction de protéines (PROTÉINE DNA-ARN) d’une manière contrôlée, en exploitant la biologie synthétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d’un système d’expression sans cellules, y compris la production d’un puissant lysate bactérien et l’encapsulation de ce lysate à l’intérieur des vésicules géantes nonilamellar à base de cholestérol (GUV) (c.-à-d. liposomes stables), pour former des cellules synthétiques. Le protocole décrit les méthodes de préparation des composants des cellules synthétiques, y compris la production de lysates bactériens actifs, suivie d’une préparation détaillée étape par étape des cellules synthétiques basée sur une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile. Ceux-ci facilitent la production de millions de cellules synthétiques d’une manière simple et abordable avec une grande polyvalence pour produire différents types de protéines. Les cellules synthétiques obtenues peuvent être utilisées pour étudier la production et l’activité des protéines/ARN dans un environnement isolé, dans une évolution dirigée, et aussi comme une plate-forme contrôlée de livraison de médicaments pour la production à la demande de protéines thérapeutiques à l’intérieur du corps.
Introduction
Les cellules synthétiques sont des particules artificielles ressemblant à des cellules, imitant une ou plusieurs fonctions d’une cellule vivante, telles que la capacité de diviser, former des interactions membranaires et synthétiser les protéines à partir d’un code génétique1,2,3. Les cellules synthétiques qui enferment les systèmes de synthèse des protéines sans cellules (CFPS) possèdent une modularité élevée en raison de leur capacité à produire diverses protéines et séquences d’ARN suite à des altérations dans le modèle d’ADN. Présentant une alternative attrayante aux approches actuelles de la production de protéines, les systèmes CFPS sont basés sur le lysate cellulaire, les composants purifiés ou les composants synthétiques et comprennent toutes les machines de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines telles que les ribosomes, la polymérase à ARN, les acides aminés et les sources d’énergie (p. ex., 3-phosphoglycerate et triphosphate adénine)4,5,66,7,89.9 L’encapsulation d’un système CFPS à l’intérieur des vésicules lipidiques permet la production simple et efficace de protéines sans dépendre d’une cellule vivante10. En outre, cette plate-forme permet la synthèse des peptides qui peuvent se dégrader à l’intérieur des cellules naturelles, la production de protéines qui sont toxiques pour les cellules vivantes, et de modifier les protéines avec des acides aminés non naturels11,12. Les cellules synthétiques ont été utilisées comme modèle à des fins de recherche sur les composants cellulaires minimaux nécessaires pour permettre la vie cellulaire d’un point de vue évolutif1,13. Les cellules synthétiques ont également été utilisées pour construire et mettre en œuvre le circuit génétique et comme modèles pour l’évolution dirigée14,15,16. D’autres études ont porté sur la capacité des cellules synthétiques à imiter l’activité biologique des cellules naturelles, visant à remplacer les cellules naturelles endommagées, telles que les cellules bêta chez les patients atteints de diabète17. En outre, la capacité de ces CFPS encapsulant des cellules synthétiques à produire une variété de protéines thérapeutiques illustre son potentiel à être incorporé dans l’utilisation clinique18.
Ici, nous décrivons un protocole ascendant à l’échelle de laboratoire(figure 1) pour la production d’ARN et de cellules synthétiques productrices de protéines à partir d’un système CFPS encapsulé dans une vésicule lipidique. Cela montre l’utilisation potentielle de plates-formes cellulaires synthétiques comme nouveaux systèmes de livraison de médicaments pour la production sur place d’un médicament protéique thérapeutique in vivo19. Des études antérieures ont étudié l’optimisation de la réaction du CFPS et des processus de préparation du lysate cellulaire4,8,20. En outre, plusieurs techniques ont été appliquées pour la préparation des liposomes de la taille d’une cellule, telles que les méthodes de stabilisation des gouttelettes microfluidiques et polymères21,22,23, qui diffèrent également dans la composition lipidique des liposomes24,25,26. Dans le protocole présenté, les cellules synthétiques sont produites à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile et le processus d’encapsulation est effectué à basse température (lt;4 'C)5,10,24,27,28. Ces conditions douces se sont avérées favorables pour conserver l’intégrité biofonctionnelle des machines moléculaires, à savoir les ribosomes et les protéines27,29,30. La composition lipidique des particules se compose à la fois de cholestérol et de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Le premier se trouve dans toutes les membranes cellulaires des mammifères et est essentiel pour la stabilité, la rigidité et la réduction de la perméabilité de la membrane, et le second imite la composition des phospholipides mammifères11,13. La base moléculaire de transcription et de traduction cellulaire est extraite de la souche BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), qui est transformée avec la polymérase plasmide pAR1219 pour augmenter la polymérase de l’ARN T7 pour augmenter la puissance du SFC et la synthèse des protéines. Ce système a été utilisé pour produire des protéines diagnostiques et thérapeutiques, avec des poids moléculaires allant jusqu’à 66 kDa in vitro et in vivo19,31. Le protocole suivant fournit une méthode simple et efficace pour la production du système cellulaire synthétique, qui peut répondre à un large éventail de questions fondamentales associées à la synthèse des protéines dans la nature et peut également être utilisé pour les applications d’administration de médicaments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : L’illustration du protocole complet de production des cellules synthétiques est présentée à la figure 1. Selon les besoins de l’utilisateur, l’expression protéique (article 3.2) et les parties de formation de cellules synthétiques (article 4) du protocole peuvent également être effectuées indépendamment (avec quelques adaptations).
1. Préparation de S30-T7 lysate
- Plaque de stase la bactérie E. coli BL21(DE3) transformée avec la polyméase d’ARN T7 exprimant le plasmide pAR1219 sur une plaque de LB-agar complétée par une ampicilline de 50 g/mL pour obtenir des colonies uniques.
- Préparer une solution de démarrage : Inoculer une colonie simple en 5 ml de LB-média complété par une ampicilline de 50 g/mL dans un flacon Erlenmeyer de 100 ml et pousser toute la nuit à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min et 37 oC. Préparez des doublons.
- Inoculer chaque démarreur de 5 ml séparément en 500 ml de support de tb complété par une ampicilline de 50 g/mL dans un flacon 2 L Erlenmeyer avec des déflecteurs et le faire pousser à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min et 37 oC jusqu’à ce qu’il atteigneOD 600 de 0,8-1. Surveillez périodiquement à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Ajouter 2-3 mL de stock de 100 mM d’IPTG (pour atteindre 0,4 à 0,6 mM) pour l’induction de l’expression T7 RNA polymérasase et continuer à cultiver la culture jusqu’à ce qu’elle atteigneOD 600'4.
- Transférer la solution de chaque flacon Erlenmeyer en deux tubes de centrifugeuse stérilisés de 250 ml.
- Centrifugeuse chacune à 7 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
REMARQUE : À ce stade, la granule bactérienne peut être stockée à -20 oC pendant quelques jours avant de passer aux étapes suivantes. - Suspendre à nouveau chaque granule dans 250 ml de tampon froid (4 oC) S30 lysate et centrifugeuse à 7 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
REMARQUE : Le tampon de lysate S30 est utilisé pour maintenir la stabilité des protéines après l’exécution de la lyse cellulaire à l’aide de l’homogénéisant à l’étape 1.9. De ce pas en avant, toutes les étapes jusqu’à 1.12 doivent être effectuées consécutivement et rapidement.
REMARQUE : Avant de passer à l’étape suivante, pré-refroidir les bouts et les flacons de 1,5 millilitur qui seront nécessaires pour stocker le lysate - Jetez le supernatant et suspendez toutes les granulés ensemble dans 15 ml de tampon froid S30 lysate. Filtrer la suspension à l’aide d’un tampon de gaze.
REMARQUE : 15 ml de solution est due au volume d’homogénéisation min. Il faut noter que la concentration de bactéries est également importante. - Homogénéiser à une pression de travail de 15.000 psi, avec une pression d’air de 4 barre (deux passes) pour la rupture cellulaire. Évitez la dilution de solution pour un lysate plus concentré et actif.
- Ajouter 100 L de 0,1 M TNT (CAUTION) par 10 ml de suspension homogénéisée.
- Centrifuge la suspension à 24 700 x g pendant 30 min à 4 oC.
- Effectuez rapidement l’étape suivante pour préserver l’activité lysate : divisez le supernatant un par un en 200 aliquots de L dans des flacons précoltés de 1,5 ml et accrochez-les immédiatement à l’azote liquide. Conserver à -80 oC pour une utilisation ultérieure.
CAUTION: La TNT est classée comme irritante et nocive et doit donc être traitée avec soin.
2. Préparation des lipides dans la solution d’huile
- Dissoudre le POPC et le cholestérol en chloroforme (CAUTION) séparément, chacun à une concentration finale de 100 mg/mL. Vortex chaque flacon séparément.
- Mélanger les composants dans une fiole en verre de 2 mL : ajouter 50 L de POPC en chloroforme, 50 l de cholestérol en chloroforme et 500 l d’huile minérale. Pour 100 L de cellules synthétiques, 2 flacons de lipides dans l’huile sont nécessaires.
- Vortex, puis chauffer pendant environ 1 h à 80 oC dans une hotte chimique pour évaporer le chloroforme. Assurez-vous que l’évaporation complète s’est produite en suivant le temps/conditions spécifiés et en surveillant le volume de la solution.
REMARQUE : La solution lipidique dans l’huile qui en résulte peut être stockée à température ambiante jusqu’à deux semaines. Pour obtenir de meilleurs résultats, il est recommandé d’utiliser une nouvelle préparation avant chaque expérience. Les rapports lipidiques et de cholestérol peuvent être modifiés en fonction de la composition de la membrane désirée. Une forte concentration de cholestérol peut conduire à la formation d’agrégats dans la solution cellulaire synthétique finale.
CAUTION: Le chloroforme est classé comme irritant et nocif et doit donc être traité avec soin et dans les zones avec l’extraction de fumée.
3. Préparation de solutions extérieures, pré-intérieures et d’alimentation
- Préparation de solutions stock
- Préparer les solutions de stock inscrites dans le tableau 2 à l’aide d’eau ultrapure (UPW).
REMARQUE : Les solutions de stock doivent être préparées à l’avance et stockées à -20 oC jusqu’à nouvel ordre. Le réactif 7 a tendance à former des agrégats. Le chauffage à 37 oC réduira l’agrégation. Une légère agrégation n’affectera pas la réaction de manière significative. La solution Reagent 8 est laiteuse et turbide.
- Préparer les solutions de stock inscrites dans le tableau 2 à l’aide d’eau ultrapure (UPW).
- Solution extérieure
- Dissoudre le glucose dans DNase/RNase-libre H2O à une concentration finale de 200 mM.
- Pour 100 L de solution intérieure, préparez 1,6 mL de solution extérieure.
- Solution pré-intérieure
- Ajouter les réactifs 1-14 selon les montants et la concentration énumérés dans le tableau 2. Par exemple, pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution intérieure.
REMARQUE : L’UPW doit être ajoutée pour compléter le volume final requis. À ce stade, le mélange peut être stocké à 4 oC pendant quelques heures.
- Ajouter les réactifs 1-14 selon les montants et la concentration énumérés dans le tableau 2. Par exemple, pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution intérieure.
- Solution d’alimentation
- Ajouter tous les réactifs en fonction des montants et de la concentration énumérés dans le tableau 3.
REMARQUE : Utilisez le rapport 1:1 de la solution d’alimentation : solution intérieure. Pour un volume final de cellules synthétiques de 100 ll, préparez 100 L de solution d’alimentation. Il est recommandé de préparer un petit volume excédentaire de solution extérieure, intérieure et alimentaire.
- Ajouter tous les réactifs en fonction des montants et de la concentration énumérés dans le tableau 3.
4. Préparation des cellules synthétiques
REMARQUE : Les volumes suivants sont ajustés pour la préparation de 100 L de cellules synthétiques.
- Cellules synthétiques produisant des protéines
- Dans un tube de 15 ml, placez 12 ml de la solution extérieure et ajoutez lentement, sur une couche, de 500 L de lipides dans la solution d’huile. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Pour finaliser la préparation de la solution intérieure : mélanger les ingrédients de la solution intérieure sur de la glace concassée à un volume final de 100 l en décongelant et en ajoutant le Lysate S30-T7 (réactif 15) et le plasmide d’ADN (réactif 16) au mélange stocké.
- Pour la deuxième fiole de verre de 2 ml avec 500 l de lipides dans la solution d’huile, ajouter 100 l de la solution intérieure. Pipette de haut en bas vigoureusement pendant 1 minute et vortex pour une autre minute au niveau cinq.
- Incuber pendant 10 min sur de la glace concassée et ajouter lentement l’émulsion résultante au-dessus de la phase d’huile dans le tube de 15 mL (à partir de 4.1.1).
- Centrifugeuse pour 10 min à 100 x g et 4 oC, puis centrifugeuse pendant 10 min à 400 x g et 4 oC. À la fin de la centrifugation, une boulette au fond du tube doit être observée.
REMARQUE : L’utilisation d’un rotor de centrifugeuse à seau oscillant est préférée ici pour acquérir une meilleure couverture d’une deuxième couche de lipides pendant le passage des gouttelettes d’eau dans l’huile à travers l’interphase. Dans le cas où il n’y a pas de granule observable, la vitesse de centrifugation peut être augmentée à 1000 x g. Sinon, voir la section Discussion se référant à la gravité spécifique de la solution extérieure. - Extraire la boulette.
- Enlever l’excès de couche d’huile.
- Utilisez une pointe de pipette taillée chargée d’environ 400 l de solution extérieure pour extraire la pastille. Relâchez la solution extérieure en passant par la phase d’huile afin de recueillir uniquement la pastille dans la phase aqueuse.
- Essuyez la pointe après l’extraction de la granule pour éviter de transférer les restes d’huile et transférez la pastille dans un tube propre de 1,5 mL.
- Centrifugeuse pendant 10 min à 1 000 x g et 4 oC, retirez le supernatant et suspendez à nouveau la granule dans 100 l de la solution d’alimentation (1:1 rapport des solutions intérieures : alimentation).
REMARQUE : Un rotor de centrifugeuse à angle fixe peut également être utilisé ici. - Pour l’expression protéique, incuber pendant 2 heures à 37 oC sans trembler.
REMARQUE : Le temps d’incubation optimal varie d’une protéine à l’autre. - Évaluer la quantité de protéines produites en utilisant une méthode appropriée selon les propriétés protéiques cibles.
- Groupes de contrôle recommandés
- Solution intérieure et confirmation d’activité lysate
- Préparer une solution intérieure complète (avec ADN et S30-T7 lysate).
- Incuber immédiatement la réaction ci-dessus à l’aide d’un shaker d’incubateur de sol à 250 tr/min ou d’un thermomixer à 1200 tr/min, à une température constante de 37 oC pendant 2 h.
REMARQUE : Ajuster le temps d’incubation pour correspondre au temps d’incubation des cellules synthétiques.
- Cellules synthétiques
- Groupe de contrôle négatif : Préparer le protocole présenté en 4.1 avec la solution intérieure sans ADN.
- Contrôle positif : Préparer le protocole présenté en 4.1 avec une solution intérieure contenant un codage plasmide T7 pour un gène reporter.
REMARQUE : Ajoutez un groupe témoin positif composé d’un gène reporter, tel que le sfGFP, aux côtés des groupes de test pour assurer l’étape d’efficacité de l’encapsulation.
- Solution intérieure et confirmation d’activité lysate
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous présentons un protocole pour la préparation des cellules synthétiques en encapsulant un système S30-T7 CFPS basé sur BL21 E. coli à l’intérieur des vésicules lipidiques. Une description schématique du processus de préparation qui comprend une image de chaque étape est présentée à la figure 2. Le succès du processus de préparation des cellules synthétiques dépend de la performance appropriée de chaque étape et effectuée par différents paramètres. Le protocole doit être ajusté pour tenir compte de la production d’une protéine spécifique.
Les plasmides exprimant le modèle de protéine super-folder Green Fluorescent Protein (sfGFP) et Renilla Luciferase sous le promoteur T7 ont été introduits dans les réactions en vrac CFPS et les cellules synthétiques, et la production de protéines a été évaluée à l’aide de différentes méthodes, y compris la tache occidentale, la cytométrie des flux, la microscopie et la spectroscopie(figure 3). Une vérification de la production de protéines étiquetées sfGFP-His6 (27 kDa32) par analyse de tache occidentale est présentée dans la figure 3A. Un échantillon de 30 l de cellules synthétiques diluées 6 plis a été mélangé avec 10 l d’un tampon d’échantillon commun SDS-PAGE (contenant le sulfate de dodéthyle de sodium de sodium (SDS) et le mercaptoethanol) et bouilli pendant 10 min (95 oC). Nous avons constaté que la combinaison de chaleur et de détergents dans le tampon de l’échantillon est suffisante pour démonter les vésicules et permettre le fonctionnement des protéines dans le gel SDS-PAGE. La détection des protéines a été effectuée à l’aide d’anticorps primaires polyclonal anticlonal (dilué 1:12,000). Comme prévu, alors que la production de protéines est détectée dans des échantillons contenant des modèles d’ADN codant sfGFP (« ADN de la PFFGFP »), aucune protéine n’est observée dans les échantillons de contrôle négatifs dans lesquels le modèle d’ADN a été exclu (« ADN »). Des échantillons de sfGFP purifié et de sfGFP purifié encapsulés dans la membrane des cellules synthétiques (encapsulé) sont utilisés comme témoins positifs pour la production en vrac du SfGFP CFPS et pour sa synthèse dans les cellules synthétiques, respectivley. Cette méthode peut être appliquée à différents types de protéines. Selon Krinsky et coll.19, le rendement de production sfGFP obtenu en vertu du protocole détaillé est de 380 g/mL dans la solution CFPS et de 5,3 g/mL, lorsque la solution CFPS est encapsulée à l’intérieur des vésicules lipidiques.
Lorsque la protéine produite à l’intérieur des cellules synthétiques est fluorescente, sa production peut être évaluée à l’aide de microscopie et de cytométrie d’écoulement. Nous avons analysé les cellules synthétiques à l’aide d’un microscope fluorescent avec un filtre pour la fluorescence GFP (figure 3B). Étant donné que les composants du CFPS ont une certaine influence automatique, les paramètres d’acquisition d’images doivent être adaptés selon un échantillon de contrôle négatif approprié (cellules synthétiques sans modèle d’ADN, par exemple).
En outre, nous avons utilisé la cytométrie des débits pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence des cellules synthétiques productrices de sfGFP, et le pourcentage de cellules synthétiques actives, qui peuvent produire des protéines à leur intérieur(figure 3C I et II). 10 000 événements ont été recueillis pour chaque échantillon analysé. La production de cellules synthétiques, qui est décrite dans ce protocole, donne habituellement une population active de 21-25% dans une solution avec une concentration approximative de 107 cellules synthétiques/mL. La légère intensité de fluorescence présentée par les échantillons d'« ADN » dans la figure 3C II est due à l’autofluorescence de différents composants de la réaction du SFCPS comme le S30 lysate.
L’analyse de taille représentative basée sur le signal GFP (diamètre) des cellules synthétiques préparées par la méthode décrite ci-dessus montre une valeur moyenne de 2,4 à 0,5 m(figure 3D II). Comme la formation d’eau dans l’émulsion d’huile dans cette méthode est le résultat de l’application de forces mécaniques, la distribution de taille des particules pourrait être affectée par différents facteurs, tels que la méthode et la vitesse de tuyauterie de l’émulsion de haut en bas, le modèle de la machine à mixer vortex, etc.
Pour tester la polyvalence de la production de protéines des cellules synthétiques, l’expression de la protéine reporter Renilla luciferase à l’intérieur des cellules synthétiques a étéanalysée (figure 3E). L’essai a quantifié l’activité de Renilla luciferase en mesurant la luminescence générée par la réaction enzymatique de la luciferase et de son substrat, h-coelenterazine. Pour induire la réaction enzymatique, une concentration finale de 1 M de h-coelenterazine a été ajoutée aux cellules synthétiques (25 l de volume d’échantillon) juste avant la mesure. L’échantillon «-ADN », qui ne contient pas le modèle d’ADN enrôleur de luciferase, a été utilisé comme contrôle négatif pour tester la luminescence due à l’oxydation non enzymatique du substrat. La luminescence a été mesurée à l’aide d’un lecteur de plaque.
Figure 1 : Illustration du processus pour le protocole typique de préparation des cellules synthétiques. Le processus est divisé en deux étapes. Étape 1 : Préparations pré-expérimentantes, y compris la purification des plasmides d’ADN, la préparation de lysate S30-T7, la préparation des solutions de stock requises pour les solutions intérieures et d’alimentation, la préparation de solutions lipides dans l’huile et la préparation de solutions extérieures. Étape 2 : Formation de cellules synthétiques qui comprend la préparation des solutions d’alimentation et intérieures, la préparation et l’analyse des cellules synthétiques. Un exemple du volume requis de chaque ingrédient pour la préparation de 100 L de solution de cellules synthétiques est présenté en bleu entre parenthèses. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Illustration schématique du protocole de préparation cellulaire synthétique. L’image d’un processus bien exécuté illustre chaque étape du protocole. Ce chiffre a été modifié à partir de Krinsky et al.19. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats représentatifs de la production de sfGFP et de Renilla luciferase à l’intérieur des cellules synthétiques. (A) Une analyse de tache occidentale de la production de sfGFP-His6 dans les réactions en vrac de CFPS et à l’intérieur des cellules synthétiques. La détection des protéines a été effectuée à l’aide d’anticorps primaires polyclonal anti-sa (dilué 1:12,000). Le sfGFP-His6 purifié a été utilisé comme un contrôle positif (7,8 g). sfGFP (encapsulé) est un contrôle positif du sfGFP purifié encapsulé dans les cellules synthétiques. Les échantillons sans modèles d’ADN ont été utilisés comme un contrôle négatif pour l’analyse de production (« ADN »). (B) Images représentatives de sfGFP produisant des cellules synthétiques prises à l’aide d’un microscope fluorescent avec un champ lumineux et un filtre GFP. Barres d’échelle de 50 m. (C) Analyse de cytométrie de flux de sfGFP produisant l’activité des cellules synthétiques (Données recueillies à l’aide d’analyseur numérique à 4 lasers). Des échantillons ont été mesurés après 3 h d’incubation. 10 000 événements ont été recueillis pour chaque échantillon analysé. Les filtres FSC (500 V) et SSC (300 V) ont été utilisés pour définir la population totale de cellules synthétiques. Ensuite, un filtre FITC (600 V) a été utilisé pour détecter la fluorescence GFP. (I) Le calcul de la population active de cellules synthétiques [%] était basé sur le seuil d’intensité de fluorescence du PTF, défini par l’échantillon « ADN » (histogramme rouge), permettant une erreur de 1 %. (II) Moyenne de l’intensité de fluorescence de la production de cellules synthétiques. Cette valeur a été calculée à partir de la population active de cellules synthétiques et normalisée à l’échantillon «-ADN » en divisant la fluorescence moyenne des cellules synthétiques actives par la moyenne des cellules synthétiques sans sfGFP-ADN. (D) I et II Analyse de la taille des cellules synthétiques. Le spectre d’émissions a été détecté par 505-560 nm et 642-745 nm pour le GFP et les signaux de champ lumineux, respectivement. (I) Une image représentative des cellules synthétiques analysées. (II) Distribution de la taille des cellules synthétiques. L’analyse a été effectuée et les distributions de diamètre des cellules synthétiques actives ont été calculées sur la base du signal GFP. (E) Production de Renilla luciferase active à l’intérieur des cellules synthétiques. L’activité de Luciferase a été quantifiée avec des mesures de luminescence après l’ajout de 1 m h-coelenterazine à l’aide d’un lecteur de plaque et présentée comme intensité lumineuse [RLU] x 106. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tableau 1 : Préparation des solutions tampons et de stock. | |
| Commentaires | |
| Luria Bertani (LB) agar (1,5%) Plaque: | Préparer et stériliser. Ajouter l’ampicilline à une concentration finale de 50 g/mL seulement après refroidissement à température ambiante. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L chlorure de sodium (NaCl) | |
| Extrait de Bacto-Yeast de 5 g/L | |
| 15 g/L Agar agar purifié | |
| 50 g/mL Ampicilline | |
| LB media (20 ml) : | Médias minimaux. Préparer et stériliser à l’avance. Juste avant d’inoculer les bactéries, ajouter l’ampicilline à une concentration finale de 50 g/mL. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L chlorure de sodium (NaCl) | |
| Extrait de Bacto-Yeast de 5 g/L | |
| 50 g/mL Ampicilline | |
| Terrific Broth (TB) médias (1 L): | Des médias riches. Préparer et stériliser à l’avance. Juste avant d’inoculer les bactéries, ajouter l’ampicilline à une concentration finale de 50 g/mL. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| Extrait de Bacto-Yeast de 24 g/L | |
| 4% (v/v) Glycérol anhydre | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| 50 g/mL Ampicilline | |
| Tampon S30 lysate (1,5 L): | Préparer et stériliser à l’avance (à l’exclusion de la TNT et du 2-mercaptoethanol). Magasinez à -4 oC. |
| 10 mM Tris-acétate au pH 7,4 | Trisma-base. Préparer et ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’acide acétique. |
| 14 mM d’acétate de magnésium | |
| 60 mm d’acétate de potassium | |
| TNT de 1 mM | Ajouter juste avant l’utilisation |
| 0,5 mL/L 2-mercaptoethanol | Ajouter juste avant l’utilisation |
| 1 M HEPES-KOH (pH 8) : | Dissoudre HEPES à une concentration finale de 1 M. Ajuster au pH 8 à l’aide de la solution KOH. |
| Hepes | |
| Hydroxyde de potassium (KOH) | |
| Tableau 2 : Composition intérieure de solution. | ||||||||||
| Volume de solution intérieure demandé final | ||||||||||
| Nombre | Réactif | Stock conc. | Finale conc. | 25 ll | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400 euros L | |
| 1 | HEPES KOH pH-8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Solution pré-intérieure |
| 2 | Acétate de magnésium | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Acétate de potassium | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Acétate d’ammonium | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Acides aminés - mélange I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Acides aminés - mélange II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Saccharose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | plasmide d’ADN | 10 g/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| Tableau 3 : Composition de la solution d’alimentation. | |||||||||
| Volume final de la solution d’alimentation demandée | |||||||||
| Nombre | Réactif | stock conc. | finale conc. | 25 ll | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400 l |
| 1 | HEPES KOH pH-8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Acétate de magnésium | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Acétate de potassium | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Acétate d’ammonium | 5,2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Acides aminés - mélange I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Acides aminés - mélange II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG IPTG | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glucose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tableau 4 : Solutions requises pour la préparation des cellules synthétiques. | |
| Solution et matériaux requis | Commentaires |
| Lipides dans l’huile | Conserver à température ambiante jusqu’à l’utilisation. Préparé selon l’article 2 |
| Solution extérieure | Préparé selon l’article 3.1 |
| Solution intérieure | Préparé selon l’article 3.2. |
| Préparer les tests et contrôler les échantillons en vertu de la section 4.1. | |
| Conserver sur la glace concassée jusqu’à l’utilisation. | |
| Solution d’alimentation | Préparé selon l’article 3.3. |
| Conserver sur la glace concassée jusqu’à l’utilisation. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole introduit une méthode simple et abordable pour la production de grandes quantités de cellules synthétiques productrices de protéines. Le rendement des cellules actives dépend de l’exécution soigneuse et précise du protocole en mettant l’accent sur plusieurs étapes critiques. Dans la section de préparation lysate de cette méthode, il est essentiel d’atteindre la densité appropriée de bactéries avant la lyse cellulaire pour obtenir une quantité suffisante de protéines dans le lysate bactérien. Deuxièmement, le processus de lyse doit être effectué à 4 oC et le lysate congelé rapidement avec de l’azote liquide pour maintenir l’activité protéique. En outre, dans ce protocole, nous avons utilisé des cellules E. coli BL21(DE3) transformées avec pAR1219 plasmide exprimant la polymérase de l’ARN T7. Dans les cas où une souche différente de bactéries est utilisée, des changements à la concentration de lysate peuvent être nécessaires pour atteindre une quantité satisfaisante de polymérase et de ribosomes d’ARN. Même lorsque la même souche bactérienne est utilisée, différentes productions lysate peuvent avoir une certaine variabilité par lots à lot.
La section de production de vésicule comprend également quelques étapes importantes. La solubilisation des lipides et l’élimination du chloroforme de l’huile minérale sont importantes pour établir l’émulsion de l’eau dans l’huile. La centrifugation des gouttelettes d’eau dans l’huile dans le tampon aqueux externe est également une étape clé dans le protocole pour générer des cellules synthétiques avec un bilayer lipidique. Les changements dans la solution intérieure des vésicules et la composition lipidique pourraient conduire à une couche de gouttelettes à l’interphase huile-eau sans aucune granule observable. Pour surmonter cela, une solution rapide consiste à augmenter la vitesse de centrifugation à 1 000 x g dans l’étape de transfert d’émulsion. Dans le cas où cela ne résoudrait pas le problème, la gravité spécifique de la solution aqueuse extérieure peut être modifiée en veillant à ce que la solution intérieure aura une gravité spécifique plus élevée que la solution extérieure. En outre, l’osmolalité de la solution intérieure peut également varier entre différentes sources et productions lysate, allant entre 800-1100 mOsm/kg. La variabilité de l’osmolalité de la solution intérieure est principalement due à l’évolution des concentrations du lysate au cours de son processus de production. Habituellement, cela ne conduit pas à des changements significatifs dans la production de protéines, mais une grande dilution pourrait conduire à un rendement réduit en raison de faibles concentrations des enzymes de transcription et de traduction dans le lysate lui-même. La mesure de la concentration totale de protéines dans chaque lot de lysate peut aider à régler les concentrations de lysate dans la solution intérieure pour maintenir des valeurs constantes (environ 22 mg/mL mesurés par l’essai de Bradford).
Néanmoins, cette méthode a certaines limites qui devraient être mentionnées. Toutes les cellules synthétiques générées ne sont pas actives et capables de produire des protéines en raison de l’encapsulation incomplète de tous les composants requis. Nous avons mesuré environ 21-25% des cellules actives lors de la production de sfGFP exprimant des cellules synthétiques en utilisant la cytométrie de débit (aucune différence significative de taille n’a été observée entre les cellules actives et inactives). Les résidus d’excès d’huile et de lipide restent parfois dans la membrane de lipide de bilayer après le transfert des cellules synthétiques dans la phase aqueuse. L’optimisation des concentrations de lipides et de cholestérol dans la phase d’huile peut améliorer ce problème. Il est également important de noter que la répartition de la taille des cellules synthétiques obtenues est assez large par rapport aux méthodes microfluidiques alternatives, avec des vésicules allant d’environ 1-50 m.
Le rendement élevé de la méthode de transfert d’émulsion le rend particulièrement approprié pour les cellules synthétiques encapsulant des systèmes de synthèse de protéines sans cellules pour la production thérapeutique de protéines. Différentes variantes de la méthode de transfert d’émulsion ont été utilisées dans les études cellulaires synthétiques et ont inclus des changements dans la procédure de préparation de l’huile, la composition de membrane, le volume de l’échantillon, le rapport solution interne à l’huile et les vitesses de centrifugation5,24,28. Des méthodes de stabilisation des gouttelettes microfluidiques et polymères ont également été utilisées pour la préparation des cellules synthétiques, cependant, l’encapsulation de l’ensemble du système CFPS n’a pas encore été effectuée avec ces méthodes21,22,23.
Les cellules synthétiques obtenues par cette méthode ont été montrées in vivo pour produire des protéines et traiter le cancer dans les modèles murins19. Les capacités de ces cellules peuvent être encore élargies à l’avenir au-delà de l’expression des protéines. L’intégration d’autres processus cellulaires tels que la communication cellulaire, la modification du cytosquelette et la division cellulaire dans les cellules synthétiques ont été récemment décrites33,34,35,36. La substitution du lysate bactérien par un lysate de cellules eucaryotes permettra d’exprimer des protéines avec une complexité plus élevée et des modifications post-traductionnelles, et sera peut-être moins immunogène même sans procédure de nettoyage, ouvrant ainsi des frontières plus thérapeutiques37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par ERC-STG-2015-680242.
Les auteurs reconnaissent également le soutien du Technion Integrated Cancer Center (TICC); l’Institut de nanotechnologie Russell Berrie; le Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences and Engineering; le ministère israélien de l’Economie pour une subvention Kamin (52752); le Ministère israélien de la technologie et de l’espace des sciences - Bureau du scientifique en chef (3-11878); la Fondation des sciences israéliennes (1778/13, 1421/17); l’Association israélienne contre le cancer (2015-0116); la Fondation germano-israélienne pour la recherche scientifique et le développement pour une subvention GIF Young (I-2328-1139.10/2012); le programme FP-7 IRG de l’Union européenne pour une subvention d’intégration professionnelle (908049); la subvention du Centre de recherche Phospholipid; une Fondation Rosenblatt pour la recherche sur le cancer, une subvention de la Fondation de la famille Mallat; et la Fondation de la famille Unger. A. Schroeder reconnaît les bourses Alon et Taub. O. Adir reconnaît les bourses Sherman et Gutwirth. G. Chen reconnaît la bourse Sherman. N. Krinsky reconnaît le programme de doctorat pour femmes Ariane de Rothschild de la Fondation Rothschild Caesarea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
