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Bioengineering

सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

Published: April 27, 2020 doi: 10.3791/60829
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,3, 1, 1,3, 1, 1, 1
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल आरएनए और सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले प्रोटीन की बॉटम-अप तैयारी के लिए विधि, सामग्री, उपकरण और चरणों का वर्णन करता है। सिंथेटिक कोशिकाओं के आंतरिक जलीय डिब्बे में पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके एक लिपिड बाइलेयर (यानी, स्थिर लिपोसोम) के भीतर S30 बैक्टीरियल लाइसेट को समाहित किया गया था।

Abstract

सिंथेटिक कोशिकाओं के निर्माण के लिए बॉटम-अप असेंबली दृष्टिकोण एक सेल नकल करने वाले वातावरण में सेलुलर प्रक्रियाओं को अलग करने और जांच करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। इसके अलावा, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों के विकास ने सिंथेटिक जीव विज्ञान का उपयोग करते हुए प्रोटीन उत्पादन, प्रतिलेखन और अनुवाद प्रक्रियाओं (डीएनए →आरएनए →प्रोटीन) का पुनर्गठन करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। यहां हम एक सेल-फ्री एक्सप्रेशन सिस्टम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सिंथेटिक कोशिकाओं के गठन के लिए कोलेस्ट्रॉल से भरपूर लिपिड आधारित विशाल यूनिमेलर वेसिकल्स (जीयूवी) (यानी स्थिर लिपोसोम) के अंदर एक शक्तिशाली बैक्टीरियल लाइसेट का उत्पादन और इस लाइकोसेट को encapsulating शामिल है। प्रोटोकॉल सक्रिय बैक्टीरियल lysates के उत्पादन सहित सिंथेटिक कोशिकाओं के घटकों को तैयार करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिसके बाद पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि के आधार पर सिंथेटिक कोशिकाओं की विस्तृत कदम-दर-कदम तैयारी की जाती है। ये विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के उत्पादन के लिए उच्च बहुमुखी प्रतिभा के साथ सरल और किफायती तरीके से लाखों सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन की सुविधा प्रदान करते हैं। प्राप्त सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग एक अलग वातावरण में प्रोटीन/आरएनए उत्पादन और गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है, निर्देशित विकास में, और शरीर के अंदर चिकित्सीय प्रोटीन के ऑन-डिमांड उत्पादन के लिए एक नियंत्रित दवा वितरण मंच के रूप में भी ।

Introduction

सिंथेटिक कोशिकाएं कृत्रिम कोशिका की तरह कण हैं, जो जीवित कोशिका के एक या कई कार्यों की नकल करते हैं, जैसे कि आनुवंशिक कोड1,2,2,3के आधार पर विभाजित करने की क्षमता, झिल्ली इंटरैक्शन और संश्लेषित प्रोटीन। सिंथेटिक कोशिकाएं जो कोशिका-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रणालियों को संलग्न करती हैं, डीएनए टेम्पलेट में परिवर्तन के बाद विभिन्न प्रोटीन और आरएनए दृश्यों का उत्पादन करने की क्षमता के कारण उच्च मॉड्यूलरता होती हैं। प्रोटीन उत्पादन के वर्तमान दृष्टिकोणों के लिए एक आकर्षक विकल्प पेश करते हुए, सीएफपीएस सिस्टम सेल लाइसेट, शुद्ध घटकों या सिंथेटिक घटकों पर आधारित हैं और इसमें प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक सभी प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी शामिल हैं जैसे राइबोसोम्स, आरएनए बहुलक, अमीनो एसिड और ऊर्जा स्रोत (जैसे, 3-फॉस्होग्लेरेट और एडेनिन,7,ट्रिप्होस्फेट)8,944,5,,6, लिपिड वेसिकल्स के अंदर सीएफपीएस प्रणाली का एनकैप्सुलेशन जीवित कोशिका10के आधार पर प्रोटीन के सरल और कुशल उत्पादन को सक्षम बनाता है । इसके अलावा, यह प्लेटफ़ॉर्म पेप्टाइड्स के संश्लेषण की अनुमति देता है जो प्राकृतिक कोशिकाओं के अंदर नीचा हो सकते हैं, प्रोटीन का उत्पादन जो जीवित कोशिकाओं के लिए जहरीले हैं, और गैर-प्राकृतिक अमीनो एसिड11,,12के साथ प्रोटीन को संशोधित करते हैं। सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया है जो सेलुलर जीवन को विकासवादी परिप्रेक्ष्यसे सक्षमबनाने के लिए आवश्यक न्यूनतम कोशिका घटकों की जांच करते हैं 1,13. सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग जेनेटिक सर्किट के निर्माण और कार्यान्वयन के लिए और निर्देशित विकास के लिए मॉडल के रूप में14,15,16के लिए भी किया गया है । अन्य अध्ययनों ने प्राकृतिक कोशिकाओं की जैविक गतिविधि की नकल करने के लिए सिंथेटिक कोशिकाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसका उद्देश्य क्षतिग्रस्त प्राकृतिक कोशिकाओं को बदलना है, जैसे मधुमेह17के रोगियों में बीटा कोशिकाएं। इसके अलावा, इन सीएफपीएस की क्षमता सिंथेटिक कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए संलग्न करती है, जो नैदानिक उपयोग18में शामिल होने की क्षमता को दर्शाती है।

यहां हम एक लिपिड वेसिकल में समझाया एक CFPS प्रणाली के आधार पर आरएनए और प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक नीचे-अप प्रयोगशाला पैमाने पर प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का वर्णन करते हैं । यह वीवो19में चिकित्सीय प्रोटीन दवा के ऑनसाइट उत्पादन के लिए उपन्यास दवा वितरण प्रणालियों के रूप में सिंथेटिक सेल प्लेटफार्मों के संभावित उपयोग को दर्शाता है । पिछले अध्ययनों ने सीएफपीएस प्रतिक्रिया के अनुकूलन और सेल लाइसेट तैयारीप्रक्रिया4,8,20की जांच की है । इसके अलावा, सेल के आकार के लिपोसोम तैयारी के लिए कई तकनीकें लागू की गई हैं, जैसे माइक्रोफ्लूइडिक और बहुलक आधारित ड्रॉपलेट स्थिरीकरण विधियां21,,22,,23,जो लिपोसोम्स लिपिड संरचना24,25,,26में भी भिन्न होती हैं।, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सिंथेटिक कोशिकाओं को पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है और एन्कैप्सुलेशन प्रक्रिया कम तापमान (<4 डिग्री सेल्सियस)5,,10,24,,27,,28पर की जाती है।, ये हल्की परिस्थितियां आणविक मशीनरी की जैव-कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए अनुकूल पाई गई हैं, नामत राइबोसोम और प्रोटीन27,29,30। कणों की लिपिड संरचना में कोलेस्ट्रॉल और 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओसी) दोनों होते हैं। पहला सभी स्तनधारी कोशिका झिल्ली में पाया जाता है और झिल्ली की स्थिरता, कठोरता और परगम्यता में कमी के लिए आवश्यक है, और बाद में स्तनधारी फॉस्फोलिपिड संरचना11,,13की नकल करता है। सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद आणविक मशीनरी BL21 (DE3) एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) तनाव से निकाली जाती है, जो CFPS शक्ति और प्रोटीन संश्लेषण को बढ़ाने के लिए PAR1219 प्लाज्मिड ओवरएक्सप्रेसिंग T7 आरएनए बहुलक के साथ बदल जाती है। इस प्रणाली का उपयोग नैदानिक और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिसमें 66 केडीए इन विट्रो और वीवो19,,31तक का आणविक वजन है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिंथेटिक सेल प्रणाली के उत्पादन के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता है, जो प्रकृति में प्रोटीन संश्लेषण से जुड़े मौलिक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित कर सकता है और दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: पूर्ण सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन प्रोटोकॉल का चित्रण चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है। उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार, प्रोटोकॉल के प्रोटीन अभिव्यक्ति (धारा 3.2) और सिंथेटिक सेल गठन (धारा 4) भागों को भी स्वतंत्र रूप से (कुछ अनुकूलन के साथ) किया जा सकता है।

1. S30-T7 lysate की तैयारी

  1. लकीर की थाली ई. कोलाई BL21 (DE3) बैक्टीरिया T7 आरएनए बहुलक के साथ बदल एक पौंड-आगर प्लेट पर pAR1219 प्लाज्मिड व्यक्त ५० μg/mL ampicillin के साथ पूरक एकल कालोनियों को प्राप्त करने के लिए ।
  2. एक स्टार्टर समाधान तैयार करें: एलबी के 5 मिलील में एक ही कॉलोनी का टीका-मीडिया एक १०० मीटर Erlenmeyer फ्लास्क में ५० μg/mL ampicillin के साथ पूरक और २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मंजिल इनक्यूबेटर शेखर का उपयोग कर रात ोंरात हो जाना । डुप्लीकेट तैयार करें।
  3. टीबी मीडिया के ५०० मीटर में प्रत्येक 5 mL स्टार्टर अलग से टीका एक 2 एल Erlenmeyer चकरा के साथ एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क में ५० μg/mL ampicillin के साथ पूरक है और यह २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मंजिल इनक्यूबेटर शेखर का उपयोग कर जब तक यह 0.8-1 के ओडी६०० तक पहुंचता है । स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके समय-समय पर निगरानी करें।
  4. T7 आरएनए बहुलक अभिव्यक्ति को शामिल करने के लिए आईपीटीजी के 100 एमएम स्टॉक (0.4 - 0.6 mM तक पहुंचने के लिए) के 2-3 एमएएल जोड़ें और संस्कृति को तब तक जारी रखें जब तक कि यह ओडी600तक पहुंच नहीं जाता।
  5. प्रत्येक Erlenmeyer फ्लास्क से समाधान को दो 250 मिलीस स्टरलस्टर्ड अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 7,000 x ग्राम पर प्रत्येक पर सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें।
    नोट: इस स्तर पर, बैक्टीरियल पैलेट को अगले चरणों पर जाने से पहले कुछ दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. प्रत्येक गोली को 250 मिलीग्राम ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) S30 lysate बफर में फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 7,000 x ग्राम पर अपकेंद्री।
    नोट: S30 lysate बफर का उपयोग प्रोटीन स्थिरता बनाए रखने के लिए किया जाता है क्योंकि सेल लाइसिस चरण 1.9 में समरूपता का उपयोग करके किया जाता है। इस कदम से आगे, 1.12 तक सभी कदम लगातार और तेजी से किया जाना चाहिए।
    नोट: अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले, पहले से शांत युक्तियां और १.५ मिलीलीटर शीशियों कि lysate भंडारण के लिए आवश्यक हो जाएगा
  8. ठंड S30 lysate बफर के 15 मिलील में सुपरनेट ेंट को त्यागें और सभी छर्रों को एक साथ फिर से निलंबित करें। धुंध पैड का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टर करें।
    नोट: समाधान के 15ml समरूप मिन मात्रा के कारण है। ध्यान दिया जाना चाहिए कि बैक्टीरिया एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है।
  9. सेल टूटने के लिए 4 बार (दो पास) के हवा के दबाव के साथ, 15,000 साई के काम के दबाव पर समरूपता। अधिक केंद्रित और सक्रिय रूप से हल कमजोर पड़ने से बचें।
  10. समरूप निलंबन के प्रति 10 एम डीटीटी (सावधानी) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  11. सेंट्रलाइज 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 24,700 x ग्राम पर निलंबन।
  12. lysate गतिविधि के संरक्षण के लिए निम्नलिखित चरण जल्दी से प्रदर्शन करें: सुपरनेटेंट को एक-एक करके प्रीकूल्ड 1.5 मिलील शीशियों में 200 माइक्रोन एलिकोट्स में विभाजित करें और तुरंत उन्हें तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज करें। आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: डीटीटी को चिड़चिड़ाहट और हानिकारक के रूप में वर्गीकृत किया गया है और इसलिए देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए।

2. तेल समाधान में लिपिड की तैयारी

  1. क्लोरोफॉर्म (सावधानी) में पीओपी और कोलेस्ट्रॉल को अलग से भंग करें, प्रत्येक को 100 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए। प्रत्येक शीशी को अलग-अलग भंवर।
    1. घटकों को 2mL ग्लास शीशी में मिलाएं: क्लोरोफॉर्म में पीओसी के 50 माइक्रोन, क्लोरोफॉर्म में कोलेस्ट्रॉल के 50 माइक्रोन और खनिज तेल के 500 माइक्रोन जोड़ें। सिंथेटिक कोशिकाओं के 100 माइक्रोन के लिए, तेल में लिपिड की 2 शीशियों की आवश्यकता होती है।
    2. भंवर, और फिर क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करने के लिए रासायनिक हुड में 80 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 घंटे तक गर्म करें। सुनिश्चित करें कि निर्दिष्ट समय/शर्तों का पालन करके और समाधान की मात्रा की निगरानी करके पूर्ण वाष्पीकरण हुआ हो ।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप लिपिड में तेल समाधान दो सप्ताह तक के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है । बेहतर परिणामों के लिए, प्रत्येक प्रयोग से पहले एक नए सिरे से तैयारी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। वांछित झिल्ली संरचना के अनुसार लिपिड और कोलेस्ट्रॉल अनुपात को बदला जा सकता है। कोलेस्ट्रॉल की उच्च एकाग्रता अंतिम सिंथेटिक सेल समाधान में समुचित के गठन का कारण बन सकती है।
      सावधानी: क्लोरोफॉर्म को चिड़चिड़ाहट और हानिकारक के रूप में वर्गीकृत किया गया है और इसलिए देखभाल के साथ और धुएं के निष्कर्षण वाले क्षेत्रों में इलाज किया जाना चाहिए।

3. बाहरी, पूर्व आंतरिक और खिला समाधान की तैयारी

  1. स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. अल्ट्राप्योर वॉटर (यूपीडब्ल्यू) का उपयोग करके तालिका 2 में सूचीबद्ध स्टॉक समाधान तैयार करें।
      नोट: स्टॉक समाधान पहले से तैयार किया जाना चाहिए और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। अभिकर्मक 7 कुल बनाने की आदत है। 37 डिग्री सेल्सियस तक हीटिंग से एकत्रीकरण कम होगा। मामूली एकत्रीकरण प्रतिक्रिया को काफी प्रभावित नहीं करेगा। रिएजेंट 8 सॉल्यूशन दूधिया और टर्बिड है।
  2. बाहरी समाधान
    1. DNase/RNase मुक्त एच2ओ में ग्लूकोज भंग २०० mM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
    2. आंतरिक समाधान के 100 माइक्रोन के लिए, बाहरी समाधान के 1.6 mL तैयार करें।
  3. पूर्व आंतरिक समाधान
    1. तालिका 2में सूचीबद्ध मात्रा और एकाग्रता के अनुसार अभिकर्मक 1-14 जोड़ें। उदाहरण के लिए, 100 माइक्रोन की अंतिम सिंथेटिक सेल मात्रा के लिए, आंतरिक समाधान के 100 माइक्रोन तैयार करें।
      नोट: अंतिम आवश्यक मात्रा को पूरा करने के लिए यूपीडब्ल्यू को जोड़ा जाना चाहिए। इस अवस्था में इस मिश्रण को कुछ घंटों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
  4. फीडिंग सॉल्यूशन
    1. तालिका 3 में सूचीबद्ध मात्रा और एकाग्रता के अनुसार सभी अभिकर्मकजोड़ें।
      नोट: फीडिंग सॉल्यूशन के 1:1 अनुपात का उपयोग करें: आंतरिक समाधान। 100 माइक्रोन की अंतिम सिंथेटिक सेल मात्रा के लिए, 100 माइक्रोन सॉल्यूशन के 100 माइक्रोन तैयार करें। बाहरी, आंतरिक और भोजन समाधान की एक छोटी अतिरिक्त मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

4. सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

नोट: निम्नलिखित खंडों को सिंथेटिक कोशिकाओं के 100 माइक्रोन तैयार करने के लिए समायोजित किया जाता है।

  1. प्रोटीन का उत्पादन करने वाली सिंथेटिक कोशिकाएं
    1. 15 मीटर ट्यूब में, बाहरी समाधान के 12 mL रखें और धीरे-धीरे तेल समाधान में लिपिड के 500 माइक्रोन के शीर्ष पर एक परत जोड़ें। 20 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    2. आंतरिक समाधान तैयारी को अंतिम रूप देने के लिए: कुचल बर्फ पर आंतरिक समाधान सामग्री को विगल द्वारा 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में मिलाएं और संग्रहीत मिश्रण में S30-T7 Lysate (अभिएजेंट 15) और डीएनए प्लाज्मिड (अभिएजेंट 16) जोड़कर।
    3. तेल समाधान में लिपिड के 500 माइक्रोन के साथ दूसरे 2 एमएल ग्लास शीशी के लिए, आंतरिक समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1 मिनट के लिए जोरदार ढंग से पिपेट और पांच स्तर पर एक और मिनट के लिए भंवर ।
      1. कुचल बर्फ पर 10 किमी के लिए इनक्यूबेट और धीरे-धीरे 15 मिलीआर ट्यूब (4.1.1 से) में तेल चरण के शीर्ष पर परिणामी पायस जोड़ें।
    4. 100 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज और फिर 400 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज। केंद्रीकरण के अंत तक, ट्यूब के नीचे एक गोली देखी जानी चाहिए।
      नोट: एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र रोटर का उपयोग यहां पानी में तेल की बूंदों के माध्यम से पारित होने के दौरान लिपिड की एक दूसरी परत का एक बेहतर कवरेज प्राप्त करने के लिए पसंद किया जाता है । यदि कोई नमूदार गोली नहीं है, तो सेंट्रलाइज्ड स्पीड को 1000 x ग्रामतक बढ़ाया जा सकता है। अन्यथा, बाहरी समाधान की विशिष्ट गंभीरता का उल्लेख करते हुए चर्चा अनुभाग देखें।
    5. गोली निकालें।
      1. अतिरिक्त तेल परत निकालें।
      2. गोली निकालने के लिए बाहरी समाधान के लगभग 400 माइक्रोन से भरी हुई छंटनी की गई पिपेट टिप का उपयोग करें। जलीय चरण में केवल गोली इकट्ठा करने के लिए तेल चरण से गुजरते समय बाहरी समाधान जारी करें।
        1. तेल अवशेषों को स्थानांतरित करने से बचने के लिए पैलेट के निष्कर्षण के बाद टिप को पोंछें और पैलेट को एक साफ 1.5 मीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. 1,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनेटेंट को हटा दें और फीडिंग सॉल्यूशन (आंतरिक: फीडिंग समाधानों का 1:1 अनुपात) के 100 माइक्रोन में पैलेट को फिर से निलंबित करें।
      नोट: एक निश्चित कोण अपकेंद्रित्र रोटर यहां के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    7. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, बिना मिलाते 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: इष्टतम ऊष्मायन समय विभिन्न प्रोटीन के बीच भिन्न होता है।
    8. लक्षित प्रोटीन गुणों के अनुसार उपयुक्त विधि का उपयोग करके उत्पादित प्रोटीन राशि का मूल्यांकन करें।
  2. अनुशंसित नियंत्रण समूह
    1. आंतरिक समाधान और lysate गतिविधि की पुष्टि
      1. एक पूर्ण आंतरिक समाधान तैयार करें (डीएनए और S30-T7 lysate के साथ)।
      2. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर, 250 आरपीएम या 1200 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर पर फर्श इनक्यूबेटर शेकर का उपयोग करके तुरंत ऊपर की प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
        नोट: सिंथेटिक कोशिकाओं ऊष्मायन समय मैच के लिए ऊष्मायन समय समायोजित करें।
    2. सिंथेटिक कोशिकाएं
      1. नकारात्मक नियंत्रण समूह: डीएनए के बिना आंतरिक समाधान के साथ 4.1 में प्रस्तुत प्रोटोकॉल तैयार करें।
      2. सकारात्मक नियंत्रण: एक रिपोर्टर जीन के लिए एक T7 प्लाज्मिड एन्कोडिंग युक्त आंतरिक समाधान के साथ ४.१ में प्रस्तुत प्रोटोकॉल तैयार करें ।
        नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण समूह जोड़ें जिसमें एक रिपोर्टर जीन शामिल है, जैसे कि एसएफजीएफपी, परीक्षण समूहों के साथ-साथ एनकैप्सुलेशन दक्षता कदम सुनिश्चित करने के लिए।

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Representative Results

हम लिपिड वेसिकल्स के अंदर BL21 ई. कोलाई के आधार पर S30-T7 CFPS प्रणाली को समाप करसिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। तैयारी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध विवरण जिसमें प्रत्येक चरण की छवि शामिल है, को चित्रा 2में प्रस्तुत किया जाता है। सिंथेटिक सेल तैयारकरने की प्रक्रिया की सफलता प्रत्येक चरण के उचित प्रदर्शन पर निर्भर करती है और विभिन्न मापदंडों से प्रभावित होती है। प्रोटोकॉल को एक विशिष्ट प्रोटीन के उत्पादन को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।

टी7 प्रमोटर के तहत मॉडल प्रोटीन सुपर-फोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एसएफजीएफपी) और रेनिला लूसिफेरेस को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स को सीएफपीएस बल्क रिएक्शन ्स और सिंथेटिक कोशिकाओं में पेश किया गया था, और प्रोटीन उत्पादन का मूल्यांकन पश्चिमी दाग, फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोस्कोपी और स्पेक्ट्रोस्कोपी(चित्र 3)सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया गया था । पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एसएफजीएफपी-उनके6 टैग किए गए प्रोटीन (~ 27 केडीए32)उत्पादन का सत्यापन चित्रा 3एमें प्रस्तुत किया गया है। सिंथेटिक कोशिकाओं के 30 μL का एक नमूना पतला 6 सिलवटों एक आम SDS-पृष्ठ नमूना बफर के 10 μL के साथ मिलाया गया था (डिटर्जेंट सोडियम dodecyl सल्फेट (SDS) और एक-mercaptoethanol युक्त) और 10 मिन (95 oC) के लिए उबला हुआ। हमने पाया कि नमूना बफर में गर्मी और डिटर्जेंट का संयोजन वेसिकल्स को अलग करने और एसडीएस-पेज जेल में प्रोटीन के संचालन को सक्षम करने के लिए पर्याप्त है। प्रोटीन का पता लगाने के विरोधी अपने पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (पतला 1:12,000) का उपयोग कर किया गया था । जैसा कि अपेक्षित था, जबकि एसएफजीएफपी-एन्कोडिंग डीएनए टेम्पलेट्स ("+एसएफजीएफपी डीएनए") वाले नमूनों में प्रोटीन उत्पादन का पता लगाया जाता है, नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में कोई प्रोटीन नहीं देखा जाता है जिसमें डीएनए टेम्पलेट को बाहर रखा गया था ("-डीएनए")। सिंथेटिक कोशिकाओं की झिल्ली (एसएफजीएफपी (sfGFP (sfGFP (समझाया) के भीतर समझाया शुद्ध sfGFP के नमूनों का उपयोग एसएफजीएफपी सीएफपीएस थोक उत्पादन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और सिंथेटिक कोशिकाओं के भीतर इसके संश्लेषण के लिए किया जाता है, respectivley। इस विधि को विभिन्न प्रोटीन प्रकारों पर लागू किया जा सकता है। Krinsky एट अल19के अनुसार, विस्तृत प्रोटोकॉल के तहत प्राप्त sfGFP उत्पादन उपज CFPS समाधान में ३८० μg/mL और ५.३ μg/mL है, जब CFPS समाधान लिपिड vesicles के अंदर समझाया जाता है ।

जब सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर उत्पादित प्रोटीन फ्लोरोसेंट होता है, तो माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री-आधारित तरीकों का उपयोग करके इसके उत्पादन का मूल्यांकन किया जा सकता है। हमने जीएफपी फ्लोरेसेंस(चित्रा 3बी)के लिए फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सिंथेटिक कोशिकाओं का विश्लेषण किया। चूंकि सीएफपीएस घटकों में कुछ ऑटोफ्लोरोसेंट होते हैं, इसलिए छवि अधिग्रहण मापदंडों को उचित नकारात्मक नियंत्रण नमूने (उदाहरण के लिए डीएनए टेम्पलेट के साथ सिंथेटिक कोशिकाओं) के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, हमने एसएफजीएफपी-उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता और सक्रिय सिंथेटिक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग किया, जो उनके भीतर प्रोटीन का उत्पादन कर सकता है(चित्रा 3सी आई एंड II)। प्रत्येक विश्लेषण नमूने के लिए १०,००० घटनाओं को एकत्र किया गया । सिंथेटिक सेल उत्पादन, जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, आमतौर पर १०७ सिंथेटिक कोशिकाओं/mL की एक अनुमानित एकाग्रता के साथ एक समाधान के भीतर 21-25% की एक सक्रिय आबादी पैदावार । चित्रा 3सी II में "डीएनए" नमूनों द्वारा प्रस्तुत मामूली फ्लोरेसेंस तीव्रता S30 lysate जैसे CFPS प्रतिक्रिया में विभिन्न घटकों के स्वत: प्रवाह के कारण है ।

ऊपर वर्णित विधि द्वारा तैयार सिंथेटिक कोशिकाओं के जीएफपी सिग्नल (व्यास में) के आधार पर प्रतिनिधि आकार विश्लेषण 2.4 ± 0.5 माइक्रोन(चित्रा 3डी II)का औसत मूल्य दिखाता है। चूंकि इस विधि में तेल पायस में पानी का गठन यांत्रिक बलों को लागू करने का परिणाम है, इसलिए कणों का आकार वितरण विभिन्न कारकों से प्रभावित हो सकता है, जैसे कि पायस को ऊपर-और नीचे, भंवर मिक्सर मशीन का मॉडल आदि की विधि और गति।

सिंथेटिक कोशिकाओं के प्रोटीन उत्पादन की बहुमुखी प्रतिभा का परीक्षण करने के लिए, सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर रिपोर्टर प्रोटीन रेनिला लूसिफेरेज़ की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया(चित्रा 3E)। परख ने ल्यूसिफ़ेरेज़ और इसके सब्सट्रेट, एच-कोलेरेंटाज़ीन की एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया से उत्पन्न ल्यूमिनेसेंस को मापने के द्वारा रेनिला ल्यूसिफ़ेरेज़ गतिविधि की मात्रा निर्धारित की। एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए, माप से ठीक पहले सिंथेटिक कोशिकाओं (25 माइक्रोन्लेनमून वॉल्यूम) में एच-कोलेटराज़ीन के 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता जोड़ी गई थी। "डीएनए" नमूना, लुसिफ़ेरे-एन्कोडिंग डीएनए टेम्पलेट युक्त नहीं सब्सट्रेट के गैर-एंजाइमेटिक ऑक्सीकरण के कारण ल्यूमिनेसेंस के परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ल्यूमिनेसेंस एक प्लेट रीडर का उपयोग करमापा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ठेठ सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी प्रोटोकॉल के लिए प्रक्रिया का एक उदाहरण। प्रक्रिया को दो चरणों में बांटा गया है। चरण 1: डीएनए प्लाज्मिड शुद्धिकरण, S30-T7 lysate तैयारी, आंतरिक और खिला समाधान, लिपिड में तेल समाधान तैयार करने और बाहरी समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक स्टॉक समाधान तैयारी सहित पूर्व प्रयोग की तैयारी। चरण 2: सिंथेटिक सेल गठन जिसमें भोजन और आंतरिक समाधान तैयार करना, सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी और विश्लेषण शामिल है। सिंथेटिक कोशिकाओं के समाधान के 100 माइक्रोन तैयार करने के लिए प्रत्येक घटक की आवश्यक मात्रा का एक उदाहरण कोष्ठक में नीले रंग में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सिंथेटिक सेल तैयारी प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। एक अच्छी तरह से प्रदर्शन की प्रक्रिया की एक छवि प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को दिखाता है। इस आंकड़े को क्रिंस्की एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर एसएफजीएफपी और रेनिला लूसिफेरेस के उत्पादन के प्रतिनिधि परिणाम। (A)सीएफपीएस थोक प्रतिक्रियाओं और सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर दोनों में एसएफजीएफपी-हिस्6 उत्पादन का एक पश्चिमी दाग विश्लेषण। प्रोटीन का पता लगाने के विरोधी अपने पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (पतला 1:12,000) का उपयोग करके किया गया था। शुद्ध एसएफजीएफपी-हि6 का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (7.8 μg) के रूप में किया गया था। एसएफजीएफपी (समझाया गया) सिंथेटिक कोशिकाओं में समझाया शुद्ध एसएफजीएफपी का सकारात्मक नियंत्रण है। डीएनए टेम्पलेट्स के बिना नमूनों का उपयोग उत्पादन विश्लेषण ("-डीएनए") के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। (ख)एक उज्ज्वल क्षेत्र और एक GFP फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन sfGFP के प्रतिनिधि छवियों । स्केल बार = 50 माइक्रोन (सी)सिंथेटिक कोशिकाओं गतिविधि (डिजिटल, 4-लेजर एनालाइजर का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा) का उत्पादन करने वाले एसएफजीएफपी का आई एंड II फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। 3 एच के इन्क्यूबेशन के बाद नमूनों को मापा गया । प्रत्येक विश्लेषण नमूने के लिए १०,००० घटनाओं को एकत्र किया गया । एफएससी (500 वी) और एसएससी (300 वी) फिल्टर का उपयोग कुल सिंथेटिक सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए किया गया था। फिर, GFP फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए एक एफईसी (600 वी) फिल्टर का उपयोग किया गया था। (I) सक्रिय सिंथेटिक सेल आबादी की गणना [%] GFP फ्लोरेसेंस तीव्रता दहलीज पर आधारित थी, जिसे "डीएनए" नमूने (लाल हिस्टोग्राम) द्वारा परिभाषित किया गया था, जिससे ~ 1% की त्रुटि की अनुमति मिली थी। (II) सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले एसएफजीएफपी की फ्लोयोरसेंस तीव्रता का मतलब है। इस मूल्य की गणना सक्रिय सिंथेटिक सेल आबादी से की गई थी और एसएफजीएफपी-डीएनए के बिना सिंथेटिक कोशिकाओं के मतलब से सक्रिय सिंथेटिक कोशिकाओं के मतलब फ्लोरेसेंस को विभाजित करके "-डीएनए" नमूने को सामान्यीकृत किया गया था। (D)आई एंड II सिंथेटिक सेल साइज एनालिसिस। उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का पता क्रमश ः जीएफपी और ब्राइट फील्ड सिग्नल्स के लिए 505-560 एनएम और 642-745 एनएम से लगाया गया था । (I) विश्लेषण किए गए सिंथेटिक कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि छवि। (II) सिंथेटिक कोशिकाओं के आकार का वितरण। विश्लेषण किया गया था और सक्रिय सिंथेटिक कोशिकाओं के व्यास वितरण जीएफपी सिग्नल के आधार पर गणना की गई थी। (ई)सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर सक्रिय रेनिला लूसिफ़ेरेज़ का उत्पादन। लूसिफ़ेरेस गतिविधि को प्लेट रीडर का उपयोग करके 1 माइक्रोन एच-कोएले्टराज़ीन के अलावा ल्यूमिनेसेंस मापन के साथ निर्धारित किया गया था और प्रकाश तीव्रता [RLU] x 106के रूप में प्रस्तुत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: बफर और स्टॉक समाधान तैयारी।
टिप्पणियाँ
लुरिया बर्टानी (एलबी) आगर (1.5%) प्लेट: तैयार ी करें और निष्फल करें। कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद ही ५० μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर Ampicillin जोड़ें ।
10 ग्राम/एल बैक्टो-ट्राइप्टोन
10 ग्राम/एल सोडियम क्लोराइड (NaCl)
5 g/L Bacto-खमीर निकालने
15 जी/एल आगर शुद्ध
50 μg/mL Ampicillin
पौंड मीडिया (20 mL): न्यूनतम मीडिया। पहले से तैयारी करें और स्टरलाइज करें। बैक्टीरिया को इनोकुल्टिंग करने से ठीक पहले, 50 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर एम्पिसिलिन जोड़ें।
10 ग्राम/एल बैक्टो-ट्राइप्टोन
10 ग्राम/एल सोडियम क्लोराइड (NaCl)
5 g/L Bacto-खमीर निकालने
50 μg/mL Ampicillin
भयानक शोरबा (टीबी) मीडिया (1 एल): अमीर मीडिया। पहले से तैयारी करें और स्टरलाइज करें। बैक्टीरिया को इनोकुल्टिंग करने से ठीक पहले, 50 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर एम्पिसिलिन जोड़ें।
12 ग्राम/एल बैक्टो-ट्राइप्टोन
24 g/L Bacto-खमीर निकालने
4% (v/v) ग्लाइसेरोल निर्जल
2.32 ग्राम/एल K2HPO4
12.54 ग्राम/एल KH2PO4
50 μg/mL Ampicillin
S30 lysate बफर (1.5 एल): पहले से तैयार ी और बंध्याकरण करें (* डीटीटी और 2-मर्काप्तोइथेन को छोड़कर)। -4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
पीएच = 7.4 पर 10 एमएम ट्रिस-एसीटेट ट्रिस्मा-बेस।
एसीटिक एसिड का उपयोग करके पीएच को 7.4 पर तैयार करें और समायोजित करें।
14 एमएम मैग्नीशियम एसीटेट
60 एम एम पोटेशियम एसीटेट
* 1 एमएम डीटीटी उपयोग करने से ठीक पहले जोड़ें
* 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol उपयोग करने से ठीक पहले जोड़ें
1 एम हेप्स-कोह (पीएच = 8): एचईपीई को 1 एम की अंतिम एकाग्रता में घोलें।
हेप्स
पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह)

   

तालिका 2: आंतरिक समाधान संरचना।
अंतिम अनुरोध आंतरिक समाधान मात्रा
संख्या अभिकर्मक स्टॉक कॉन्स। अंतिम कॉन्स। 25 माइक्रोन 50 माइक्रोन 100 माइक्रोन 200 माइक्रोन 300 माइक्रोन 400 μ एल
1 HEPES KOH पीएच = 8 1 एम 55mm 1.375 2.75 5.5 11 16.5 22 पूर्व आंतरिक समाधान
2 मैग्नीशियम एसीटेट 1 एम 14 एमएम 0.35 0.7 1.4 2.8 4.2 5.6
3 पोटेशियम एसीटेट 1 एम 50mm 1.25 2.5 5 10 15 20
4 अमोनियम एसीटेट 5.2 मीटर 155 एमएम 0.75 1.5 3 6 9 12
5 खूंटी 6000 50% 3% 1.5 3 6 12 18 24
6 3-पीजीए 0.5 मीटर 40mm 2 4 8 16 24 32
7 अमीनो एसिड - मिश्रण मैं 50 मीटर 2.5 एमएम 1.25 2.5 5 10 15 20
8 अमीनो एसिड - मिश्रण द्वितीय 50 मीटर 2.5 एमएम 1.25 2.5 5 10 15 20
9 एटीपी 100 एमएम 1.2 एमएम 0.3 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8
10 Gtp 50mm 1 एमएम 0.5 1 2 4 6 8
11 Utp 100 एमएम 0.8 एमएम 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2
12 आईपीटीजी 100 एमएम 1 एमएम 0.25 0.5 1 2 3 4
13 Sucrose 2 एम 200 एमएम 2.5 5 10 20 30 40
14 ** H2O UPW ** ** ** ** ** **
15 S30-T7 Lysate 34% 8.5 17 34 68 102 136
16 * डीएनए प्लाज्मिड 10 μg/mL * * * * * *

   

तालिका 3: फीडिंग समाधान संरचना।
अंतिम अनुरोध किया खिला समाधान मात्रा
संख्या अभिकर्मक स्टॉक कॉन्स। अंतिम कॉन्स। 25 माइक्रोन 50 माइक्रोन 100 माइक्रोन 200 माइक्रोन 300 माइक्रोन 400 माइक्रोन
1 HEPES KOH पीएच = 8 1 एम 83.3 एमएम 2.08 4.17 8.33 16.67 25 33.33
2 मैग्नीशियम एसीटेट 1 एम 21.2 एमएम 0.53 1.06 2.12 4.24 6.36 8.48
3 पोटेशियम एसीटेट 1 एम 75.5 एमएम 1.89 3.78 7.55 15.1 22.66 30.2
4 अमोनियम एसीटेट 5.2 मीटर 236.4 एमएम 1.14 2.27 4.55 9.09 13.64 18.18
5 खूंटी - 6000 50% 4.54% 2.27 4.54 9.08 18.16 27.24 36.32
6 3-पीजीए 0.5 मीटर 60.1 एमएम 3 6.01 12.01 24.02 36.04 48.04
7 अमीनो एसिड - मिश्रण मैं 50mm 3.8 एमएम 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
8 अमीनो एसिड - मिश्रण द्वितीय 50mm 3.8 एमएम 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
9 एटीपी 100 एमएम 1.8 एमएम 0.45 0.91 1.81 3.62 5.43 7.24
10 Gtp 50mm 1.5 एमएम 0.76 1.51 3.02 6.04 9.06 12.08
11 Utp 100 एमएम 1.2 एमएम 0.3 0.61 1.21 2.42 3.63 4.84
12 आईपीटीजी 100 एमएम 1.5 एमएम 0.38 0.76 1.51 3.02 4.53 6.04
13 ग्लूकोज 2 एम 200 एमएम 2.5 5 10 20 30 40
14 H2O UPW 5.92 11.83 23.7 47.38 71.06 94.76

   

तालिका 4: सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी के लिए आवश्यक समाधान।
समाधान और सामग्री की आवश्यकता टिप्पणियाँ
तेल में लिपिड उपयोग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें। धारा 2 के अनुसार तैयार
बाहरी समाधान धारा 3.1 के अनुसार तैयार
आंतरिक समाधान धारा 3.2 के अनुसार तैयार किया गया।
धारा 4.1 के अनुसार परीक्षण + नियंत्रण नमूने तैयार करें।
उपयोग तक कुचल बर्फ पर रखें।
फीडिंग सॉल्यूशन धारा 3.3 के अनुसार तैयार किया गया।
उपयोग तक कुचल बर्फ पर रखें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए एक सरल और सस्ती विधि का परिचय देता है। सक्रिय कोशिकाओं की उपज कई महत्वपूर्ण चरणों पर जोर देने के साथ प्रोटोकॉल के सावधानीपूर्वक और सटीक निष्पादन पर निर्भर है। इस विधि के लिसैट तैयारी अनुभाग में, बैक्टीरियल लाइसेट में पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन प्राप्त करने के लिए कोशिका से पहले उपयुक्त बैक्टीरिया घनत्व तक पहुंचना आवश्यक है। दूसरा, लाइसिस प्रक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए और प्रोटीन गतिविधि को बनाए रखने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ जल्दी से जमे हुए लाइसेट। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में हमने टी7 आरएनए पॉलीमरेज को व्यक्त करते हुए pAR1219 प्लाज्मिड के साथ बदल ई कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं का उपयोग किया। ऐसे मामलों में जहां बैक्टीरिया के एक अलग तनाव का उपयोग किया जाता है, lysate एकाग्रता में परिवर्तन आरएनए बहुलक और राइबोसोम की संतोषजनक मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो सकता है। यहां तक कि जब एक ही बैक्टीरियल तनाव का उपयोग किया जाता है, अलग-अलग उत्कर्दित प्रस्तुतियों में कुछ बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता हो सकती है।

वेसिकल उत्पादन अनुभाग में कुछ महत्वपूर्ण कदम भी शामिल हैं। लिपिड का घुलना और खनिज तेल से क्लोरोफॉर्म को हटाना पानी में तेल पायस स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बाहरी जलीय बफर में पानी में तेल की बूंदों का केंद्रीकरण भी लिपिड बाइलेयर के साथ सिंथेटिक कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। वेसिकल्स और लिपिड संरचना के आंतरिक समाधान में परिवर्तन किसी भी नमूदार गोली के बिना तेल-पानी इंटरफेज में बूंदों की एक परत का कारण बन सकता है। इसे दूर करने के लिए, एक त्वरित समाधान पायस हस्तांतरण चरण में केंद्रीकरण की गति को बढ़ाकर 1,000 x ग्राम करना है। यदि यह समस्या का समाधान नहीं करता है, तो बाहरी जलीय समाधान की विशिष्ट गुरुत्वाकर्षण को यह सुनिश्चित करते हुए बदला जा सकता है कि आंतरिक समाधान में बाहरी समाधान की तुलना में उच्च विशिष्ट गुरुत्वाकर्षण होगा। इसके अलावा, आंतरिक समाधान की ऑस्मोलाई 800-1100 mOsm/kg के बीच अलग-अलग स्रोतों और प्रस्तुतियों के बीच भिन्न हो सकती है। आंतरिक समाधान के ऑस्मोलैटी में परिवर्तनशीलता ज्यादातर अपनी उत्पादन प्रक्रिया के दौरान lysate की सांद्रता बदलने के कारण है । आमतौर पर इससे प्रोटीन उत्पादन में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होता है, फिर भी एक बड़े कमजोर पड़ने से ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद एंजाइमों की कम सांद्रता के कारण कम उपज हो सकती है। प्रत्येक lysate बैच में कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने के आंतरिक समाधान में सांद्रता ट्यूनिंग में सहायता कर सकते है निरंतर मूल्यों को बनाए रखने के लिए (लगभग 22 मिलीग्राम/ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापा mL) ।

फिर भी, इस विधि में कुछ सीमाएं हैं जिनका उल्लेख किया जाना चाहिए। सभी उत्पन्न सिंथेटिक कोशिकाएं सक्रिय नहीं हैं और सभी आवश्यक घटकों के अधूरे एनकैप्सुलेशन के कारण प्रोटीन का उत्पादन करने में सक्षम हैं। हमने प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके सिंथेटिक कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले एसएफजीएफपी का उत्पादन करते समय लगभग 21-25% सक्रिय कोशिकाओं को मापा (सक्रिय और निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण आकार अंतर नहीं देखा गया)। तेल और लिपिड अतिरिक्त अवशेष कभी-कभी जलीय चरण में सिंथेटिक कोशिकाओं के हस्तांतरण के बाद बाइलेयर लिपिड झिल्ली में रहते हैं। तेल चरण में लिपिड और कोलेस्ट्रॉल सांद्रता का अनुकूलन इस मुद्दे में सुधार कर सकते हैं। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राप्त सिंथेटिक कोशिकाओं का आकार वितरण वैकल्पिक माइक्रोफ्लूइडिक तरीकों की तुलना में काफी व्यापक है, जिसमें लगभग 1-50 माइक्रोन से लेकर वेसिकल्स हैं।

पायस हस्तांतरण विधि की उच्च उपज यह विशेष रूप से सिंथेटिक कोशिकाओं के लिए उपयुक्त बनाता है चिकित्सीय प्रोटीन उत्पादन के लिए सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रणाली encapsulating । पायस हस्तांतरण विधि के विभिन्न रूपों का उपयोग सिंथेटिक सेल अध्ययन में किया गया है और इसमें तेल तैयारकरने की प्रक्रिया, झिल्ली संरचना, नमूना मात्रा, तेल अनुपात के आंतरिक समाधान और केंद्रीकरण गति5,,24,,28में परिवर्तन शामिल हैं। सिंथेटिक सेल तैयारकरने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक और बहुलक आधारित बूंद स्थिरीकरण विधियों का भी उपयोग किया गया है, हालांकि, इन तरीकों21,,22,,23के साथ पूरे सीएफपीएस सिस्टम का एनकैप्सुलेशन अभी तक नहीं किया गया है।

इस विधि द्वारा प्राप्त सिंथेटिक कोशिकाओं को प्रोटीन का उत्पादन करने और मूत्र मॉडल19में कैंसर का इलाज करने के लिए वीवो में दिखाया गया था । प्रोटीन अभिव्यक्ति से परे भविष्य में इन कोशिकाओं की क्षमताओं का और विस्तार किया जा सकता है। सिंथेटिक कोशिकाओं में सेलुलर संचार, साइटोस्केलेटन संशोधन और सेल डिवीजन जैसी अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं के एकीकरण को हाल ही में33,,34,,35,,36वर्णित किया गया है। यूकैरियोटिक सेल लाइसेट के साथ बैक्टीरियल लाइसेट का प्रतिस्थापन उच्च जटिलता और ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देगा, और शायद सफाई प्रक्रिया के बिना भी कम इम्यूनोजेनिक होगा, इसलिए अधिक चिकित्सीय सीमाएं37खोलें।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ईआरसी-एसटीजी-2015-680242 ने सपोर्ट किया।

लेखक भी टेक्नियन इंटीग्रेटेड कैंसर सेंटर (टीआईसीसी) के समर्थन को स्वीकार करते हैं; रसेल बेरी नैनोटेक्नोलॉजी संस्थान; लॉरी I. Lokey इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर लाइफ साइंसेज एंड इंजीनियरिंग; एक Kamin अनुदान (52752) के लिए इसराइल अर्थव्यवस्था मंत्रालय; इज़राइल विज्ञान प्रौद्योगिकी और अंतरिक्ष मंत्रालय - मुख्य वैज्ञानिक का कार्यालय (3-11878); इज़राइल साइंस फाउंडेशन (1778/13, 1421/17); इज़राइल कैंसर एसोसिएशन (2015-0116); एक GIF युवा अनुदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन-इजरायल फाउंडेशन (I-2328-1139.10/2012); एक कैरियर एकीकरण अनुदान (908049) के लिए यूरोपीय संघ एफपी-7 IRG कार्यक्रम; फॉस्फोलिपिड रिसर्च सेंटर ग्रांट; कैंसर अनुसंधान के लिए एक Rosenblatt फाउंडेशन, एक मल्लात परिवार फाउंडेशन अनुदान; और Unger परिवार फाउंडेशन । ए श्रोडर एलोन और तौब फैलोशिप को स्वीकार करता है । ओ Adir शर्मन और Gutwirth फैलोशिप स्वीकार करते हैं । जी चेन शर्मन फैलोशिप को स्वीकार करते हैं । एन क्रिंस्की रोथस्चिल्ड सीजेरिया फाउंडेशन से बैरोनेस एरियाने डी रोथस्चिल्ड वुमन डॉक्टोरल प्रोग्राम को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)  NEB C2527 E.coli BL21 (DE3).
pAR1219 Sigma T2076 TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin Sigma A9518 Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
15 g/L Agar agar purified Merck 1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
12 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous Bio-Lab 7120501
2.32 g/L K2HPO4 Spectrum chemical P1383
12.54 g/L KH2PO4 Spectrum chemical P1380
 50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  INALCO INA-1758-1400 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)  TCI D1071 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 Sigma T1503 S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate Merck 1.05819.0250
60 mM potassium acetate Carlo Erba 470147
1 mM DTT TCI D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol Sigma M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks Thermo Scientific 50-154-2846 2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles KIMAX-KIMBLE 25630 2 flasks
Floor incubator shaker MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor.
Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer AVESTIN EmulsiFlex-C3 Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer SO-LOW U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer TECAN IN-MNANO Infinite M200 pro
96-well transparent plate Thermo Scientific 167008
Sterilized graduated cylinder Corning
Sterilized centrifuge tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips Corning Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
Small liquid nitrogen tank NALGENE 4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Lipoid 556400 Powder
Cholesterol Sigma C8667 Powder
Chloroform Bio-Lab 3082301
Mineral oil Sigma M5904 Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Heating block TECHNE FDB03AD Pre-heated to 80 °C.
Should enable controlled temperature. 
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232 For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap CSI Analytical Innovations C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES Spectrum H1089 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer
Potassium hydroxide (KOH) Frutarom 55290
1 M Magnesium acetate Merck 1.05819.0250 Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate Carlo Erba 470147 Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate Merck 1.01116.1000 Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) Merck 8.07491.1000 Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) Sigma P8877 Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP) Sigma A3377 Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) Sigma G8877 Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP) ACROS ORGANICS 226310010 Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) INALCO INA-1758-1400 Genes expression induction.
2 M Sucrose J.T. Baker 1933078 Generating a density gradient.
2 M Glucose Sigma 16301 Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW) Bio-Lab 2321777500 DNase & RNase free
S30-T7 lysate _ _ Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components.
Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. 
Stock of DNA plasmid of choice _ _ Contains the sequence for the requested protein.
Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
PHMT Grant Bio  PSC18 Thermomixer
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor.
Suited for 15 mL sized tubes.
Preferably swinging buckets.
Should enable at least 1000 x g.
Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge Thermo Scientific 75002420 (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal.
Suited for Eppendorf vials.
Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes Thermo Scientific 339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086
Sterilized pipette tips Corning Sterilized by autoclave.

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References

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