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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

Published: April 27, 2020 doi: 10.3791/60829
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,3, 1, 1,3, 1, 1, 1
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。

Abstract

合成細胞の構築のためのボトムアップアセンブリアプローチは、細胞模倣環境で細胞プロセスを分離し、調査するための効果的なツールです。さらに、無細胞発現系の開発は、タンパク質の産生、転写、翻訳プロセス(DNA→RNA→タンパク質)を制御された方法で再構成する能力を実証し、合成生物学を活用しています。ここでは、コレステロールが豊富な脂質ベースの巨大なユニラメラ小胞(すなわち、安定したリポソーム)の中に強力な細菌リゼートを産生し、カプセル化する、無細胞発現系を調製するためのプロトコル(すなわち、安定リポソーム)を説明する。プロトコルは、活性細菌リセートの生産を含む合成細胞の成分を調製するための方法を説明し、続いて、油中水エマルジョン移動法に基づく合成細胞の詳細なステップバイステップ調製を行う。これらは、タンパク質の異なるタイプを生産するための高い汎用性を持つシンプルで手頃な方法で合成細胞の数百万の生産を容易にします。得られた合成細胞は、単離された環境でのタンパク質/RNA産生および活性を調査し、指示された進化において、また体内での治療タンパク質のオンデマンド生産のための制御薬物送達プラットフォームとして使用することができる。

Introduction

合成細胞は、人工的な細胞様粒子であり、生細胞の1つまたは複数の機能を模倣し、例えば、分裂する能力、膜相互作用を形成し、遺伝コード11、2、32,3に基づいてタンパク質を合成する。無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを包み込んだ合成細胞は、DNAテンプレートの変化に伴い様々なタンパク質やRNA配列を産生する能力により、高いモジュール性を有します。タンパク質産生の現在のアプローチに代わる魅力的な代替手段を提示するCFPSシステムは、細胞リ,セート、精製成分、または合成成分に基づいており、リボソーム、RNAポリメラーゼ、アミノ酸およびエネルギー源(例えば、3-ホスホグリセリン酸およびアデニンリン酸)4、5、6、7、9、9、リソソー4,5ムなどのタンパク質合成に必要なすべての転写および翻訳機械を含む。6,7,8,9脂質小胞内のCFPSシステムのカプセル化は、生細胞10に依存することなく、タンパク質の簡単かつ効率的な生産を可能にする。さらに、このプラットフォームは、天然細胞内で分解し得るペプチドの合成、生きている細胞に毒性のあるタンパク質の産生、および非天然アミノ酸11、12,12を有するタンパク質を改変することを可能にする。合成細胞は、進化的な視点から細胞の生命を可能にするために必要な最小限の細胞成分を調査する研究目的のモデルとして使用されてきた11,13。合成細胞は、遺伝的回路の構築と実装、および指向進化14、15、1615,16のモデルとしても使用されてきた。14他の研究は、天然細胞の生物活性を模倣する合成細胞の能力に焦点を当て、糖尿病患者におけるベータ細胞などの損傷した天然細胞を置き換えることを目指している17。さらに、これらのCFPSカプセル化合成細胞が種々の治療用タンパク質を産生する能力は、臨床使用18に組み込まれる可能性を示している。

ここでは、脂質小胞に封入されたCFPSシステムに基づくRNAおよびタンパク質産生合成細胞の産生のためのボトムアップラボスケールプロトコル(図1)について説明する。これは、生体内での治療タンパク質薬のオンサイト生産のための新規薬物送達システムとしての合成細胞プラットフォームの潜在的な使用を示す19。これまでの研究では、CFPS反応と細胞ライセート調製プロセス44、8、208,20の最適化を調査してきました。また、細胞サイズのリポソーム製剤としては、マイクロ流体およびポリマーベースの液滴安定化法21,22,23など21,22,、リポソームの脂質組成24,25,2625,26にも異なる手法24が適用されている。23提示されたプロトコルにおいて、合成細胞は、油中の水中のエマルジョン移動法を用いて製造され、カプセル化プロセスは低温(<4°C)5、10、24、27、28で行われる。5,10,24,27,28これらの穏やかな条件は、分子機械、すなわちリボソームおよびタンパク質27、29、3029,30の生体機能完全性を保持27するために好ましいことが判明している。粒子の脂質組成は、コレステロールと1-パルミトイル-2-オレロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の両方からなる。第1は、すべての哺乳動物細胞膜に見られ、膜の安定性、剛性および透過性の低下に不可欠であり、後者は哺乳動物リン脂質組成物11、13,13を模倣する。細胞転写および翻訳分子機械はBL21(DE3)大腸菌(大腸菌)株から抽出され、PAR1219プラスミドで過剰発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換され、CFPSの効力とタンパク質合成を増加させる。このシステムは、診断および治療用タンパク質を産生するために使用されており、インビトロおよびインビボ19,31,31の最大66 kDaの分子量を有する。以下のプロトコルは、合成細胞系の生産のための簡単かつ効果的な方法を提供し、タンパク質合成に関連する広範な基本的な問題に本質的に対処することができ、また、薬物送達用途に利用することができる。

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Protocol

注: 完全な合成セルの生産プロトコルの図を図 1に示します。ユーザーのニーズに応じて、プロトコルのタンパク質発現(セクション3.2)および合成細胞形成(セクション4)部分も独立して(いくつかの適応を伴って)行うことができる。

1. S30-T7のリセートの調製

  1. 50 μg/mL アンピシリンを補ったLB-寒天プレート上にpAR1219プラスミドを発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換した大腸菌BL21(DE3)細菌をストリークプレートし、単一コロニーを得る。
  2. スターター溶液を準備する:1コロニーを100mLのエルレンマイヤーフラスコで50μg/mLアンピシリンを補充したLB培地5mLに接種し、250rpmと37°Cの床インキュベーターシェーカーを使用して一晩成長します。重複を準備します。
  3. 各5 mLスターターを、バッフル付き2 L エルレンマイヤーフラスコに50 μg/mLアンピシリンを補った500mLの結核培地に分けて接種し、250 rpmおよび37°Cのフロアインキュベーターシェーカーを使用して0.8-1のOD600に達するまで成長させます。分光光度計を使用して定期的にモニターします。
  4. T7 RNAポリメラーゼ発現の誘導のためにIPTGの100 mMストック(0.4〜0.6mMに達する)の2〜3 mLを加え、OD600≈4に達するまで培養を続けます。
  5. 各エルレンマイヤーフラスコから2つの250 mL滅菌された遠心分離管に溶液を移します。
  6. 遠心分離機は、4°Cで10g分間、それぞれ7,000xgで。上清を捨てます。
    注:この段階では、細菌ペレットは、次のステップに進む前に数日間-20°Cで保存することができます。
  7. 各ペレットを250 mLの冷水(4°C)S30 lysateバッファーと遠心分離機で7,000 x gで4°Cで10分間再懸濁します。
    注:S30リセートバッファーは、ステップ1.9でホモジナイザーを使用して細胞リシスが行われた後のタンパク質安定性を維持するために使用されます。このステップから、1.12までのすべてのステップは、連続して迅速に実行する必要があります。
    注:次のステップに進む前に、リセートを保存するために必要なヒントと1.5ミリリットルバイアルを事前に冷却してください
  8. 上清を捨て、冷たいS30のライセートバッファーの15 mLで全てのペレットを再中断します。ガーゼパッドを使用して懸濁液をフィルターします。
    注:15mlの溶液は、ホモジナイザーの体積によるものです。細菌濃度も重要であるに注意する必要があります。
  9. 細胞破損のための4棒(2つのパス)の空気圧で、15,000 psiの働く圧力で均質化する。より濃縮された活性な溶解物の溶液希釈を避けてください。
  10. 均質化された懸濁液の10 mLあたり0.1 M DTT(注意)の100 μLを加えます。
  11. 4°Cで30分間24,700xgで懸濁液を遠心分離する。 g
  12. ライセート活性を維持するために、次のステップを迅速に実行します:上清を1つずつ200 μLのアリコートに分け、あらかじめ冷却した1.5mLバイアルですぐに液体窒素で凍結します。さらに使用するために-80 °Cで保管してください。
    注意: DTT は刺激性および有害性に分類されるため、注意して扱う必要があります。

2. 油脂溶液中の脂質の調製

  1. POPCとコレステロールをクロロホルム(注意)に分解し、それぞれ100mg/mLの最終濃度にします。各バイアルを別々に渦。
    1. 2mLガラスバイアルに構成部品を組み合わせる:クロロホルムに50μLのPOPC、クロロホルムに50μLのコレステロール、500μLのミネラルオイルを加えます。合成細胞の100μLの場合、油中の脂質のバイアル2バイアルが必要です。
    2. ボルテックスを、クロロホルムを蒸発させるために化学フードで80°Cで約1時間加熱した。指定した時間/条件に従い、ソリューションのボリュームを監視することによって、完全な蒸発が発生したことを確認します。
      注:得られた脂質油中溶液は、室温で最大2週間保存することができます。結果を改善するために、各実験の前に新しい準備を使用することをお勧めします。脂質およびコレステロール比は、所望の膜組成に応じて変化させることができる。コレステロールの高濃度は、最終的な合成細胞溶液中の凝集体の形成につながることができます。
      注意:クロロホルムは刺激性および有害に分類され、したがって注意して、煙抽出のある領域で扱われるべきである。

3. 外、内および供給の解決の準備

  1. ストックソリューションの準備
    1. 表 2に記載されているストック ソリューションを、超純水 (UPW) を使用して準備します。
      注:ストックソリューションは事前に準備し、さらに使用されるまで-20°Cで保管する必要があります。試薬7は凝集体を形成する傾向がある。37°Cに加熱すると凝集が減少します。わずかな凝集は、反応に大きな影響を与えない。試薬8溶液は、乳白色および濁りである。
  2. 外側のソリューション
    1. DNase/RNaseフリーH2Oのグルコースを200mMの最終濃度に溶解します。
    2. 100 μLの内部溶液に対して、1.6 mLの外液を調製します。
  3. プレインナーソリューション
    1. 表2に記載した量と濃度に従って試薬1〜14を加える。例えば、最終合成細胞容積が100 μLの場合、100 μLの内部溶液を調製します。
      注: 最終的に必要なボリュームを完成させるために UPW を追加する必要があります。この段階では、混合物を数時間4°Cで保存することができる。
  4. 給餌ソリューション
    1. 表3に記載した量と濃度に従って、すべての試薬を加えます。
      注:摂食溶液の1:1比を使用してください:内部溶液。最終的な合成細胞容積が100 μLの場合は、100 μLの供給液を調製します。外、内および供給溶液の小さな過剰なボリュームを準備することをお勧めします。

4. 合成細胞の調製

注:合成細胞の100 μLの調製のために、次のボリュームが調整されます。

  1. タンパク質を産生する合成細胞
    1. 15 mLチューブに、外側溶液の12 mLを入れ、油溶液中の500μLの脂質を層の上にゆっくりと加えます。室温で20分間インキュベートします。
    2. 内溶液調製を確定するには:砕氷上の内部溶液成分を解凍して、保存された混合物にS30-T7リサート(試薬15)およびDNAプラスミド(試薬16)を加えることによって、最終体積100μLに混ぜ合わせる。
    3. 油溶液中の脂質500μLを有する2番目の2mLガラスバイアルに、100μLの内部溶液を加えます。ピペットは1分間激しく上下し、レベル5でさらに1分間渦巻き。
      1. 砕氷上で10分間インキュベートし、15 mLチューブの油相の上にゆっくりとエマルジョンを加えます(4.1.1から)。
    4. 遠心分離機は100xgと4°Cgで10分間、遠心分離機は400xgおよび4°Cで10分間、遠心分離機を10分間行う。 g遠心分離の終わりまでに、チューブの底部にペレットが観察されるべきである。
      注:スイングバケット遠心回転子を使用すると、インオイル液滴の間相通過中に脂質の第2層のより良いカバレッジを取得するためにここで好まれます。観察可能なペレットがない場合、遠心速度を1000 x gに上げることができる。それ以外の場合は、外部ソリューションの比重を参照する「ディスカッション」セクションを参照してください。
    5. ペレットを抽出します。
      1. 余分な油層を除去します。
      2. 約400 μLの外側溶液を取り付けたトリミングされたピペットチップを使用してペレットを抽出します。水相のペレットのみを集めるために油相を通過しながら外液を放出する。
        1. ペレットの抽出後にチップを拭き取り、オイル残りを移動させないようにし、ペレットをクリーンな1.5 mLチューブに移します。
    6. 遠心分離機を1,000 x gおよび4°Cで10分間、上清を取り除き、100 μLの供給液(内水溶液の1:1比)でペレットを再懸濁します。
      注:固定角度の遠心回転子もここで使用することができます。
    7. タンパク質発現の場合は、振盪せずに37°Cで2時間インキュベートします。
      注:最適なインキュベーション時間は、異なるタンパク質によって異なります。
    8. 目的タンパク質特性に応じて適当な方法を用いて、産生タンパク質量を評価する。
  2. 推奨制御グループ
    1. 内溶液および溶解活性の確認
      1. 完全なインナー溶液(DNA&S30-T7溶解液)を準備してください。
      2. 250rpmで床インキュベーターシェーカーを使用するか、1200rpmでサーモミキサーを使用して、2時間37°Cの一定温度ですぐに上記の反応をインキュベートする。
        注:合成細胞のインキュベーション時間に合わせてインキュベーション時間を調整します。
    2. 合成細胞
      1. 陰性対照群: DNAを含まない内部溶液で4.1で提示されたプロトコルを準備します。
      2. ポジティブコントロール:レポーター遺伝子のT7プラスミドコードを含むインナー溶液を用いて4.1で提示されるプロトコルを準備します。
        注:sfGFPなどのレポーター遺伝子で構成される陽性対照群をテストグループと一緒に追加し、カプセル化効率ステップを確認します。

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Representative Results

脂質小胞内にBL21大腸菌を用いたS30-T7 CFPSシステムをカプセル化することにより、合成細胞の調製のためのプロトコルを提示する。各段階のイメージを含む準備プロセスの概略説明を図 2に示します。合成細胞調製プロセスの成功は、各段階の適切な性能に依存し、異なるパラメータによって影響を受けます。プロトコルは、特定のタンパク質の生産に対応するように調整する必要があります。

T7プロモーター下のモデルタンパク質スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)とレニラルシファーゼを発現するプラスミドをCFPSバルク反応および合成細胞に導入し、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、顕微鏡検査および分光法を含む異なる方法を用いてタンパク質産生を評価した(図3)。ウェスタンブロット分析によるsfGFP-His6タグ付きタンパク質(〜27kDa32)の生産の検証を図3Aに示す。326倍希釈した合成細胞の30μLのサンプルを、一般的なSDS-PAGEサンプルバッファー(ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とβ-メルカプトエタノールを含む洗剤を含む)の10μLと混合し、10分間煮沸した(95oC)。サンプルバッファー内の熱と洗剤の組み合わせは、小胞を分解し、SDS-PAGEゲル内のタンパク質の実行を可能にするのに十分であることがわかりました。タンパク質検出は、抗Hisポリクローナル一次抗体(希釈1:12,000)を用いて行った。予想通り、タンパク質の産生はsfGFPコードDNAテンプレート(「+sfGFP DNA」)を含むサンプルで検出されるが、DNAテンプレートが除外された陰性対照サンプル(「-DNA」)ではタンパク質は観察されない。精製されたsfGFPおよび精製されたsfGFPのサンプルは、合成細胞の膜内に封入され('sfGFP(カプセル化))、sfGFP CFPSバルク産生および合成細胞内の合成のためのポジティブコントロールとして使用される、 尊敬。この方法は、異なるタンパク質タイプに適用することができる。Krinsky et al.19によると、詳細なプロトコルで得られるsfGFPの生産収率は、CFPS溶液中で380μg/mL、5.3μg/mLであり、CFPS溶液が脂質小胞の中にカプセル化される。

合成細胞内で産生されるタンパク質が蛍光である場合、その産生は顕微鏡検査およびフローサイトメトリーベースの方法を用いて評価することができる。蛍光顕微鏡を用いて合成細胞をGFP蛍光用フィルターで解析した(図3B)。CFPS成分は何らかの自己蛍光を有するため、画像取得パラメータは適切な陰性対照試料(例えばDNA鋳型のない合成細胞)に従って適合させるべきである。

また、フローサイトメトリーを用いて、sfGFP産生合成細胞の平均蛍光強度、およびそれらの中にタンパク質を産生できる活性合成細胞の割合を測定しました(図3C I&II)。分析されたサンプルごとに 10,000 件のイベントが収集されました。このプロトコルに記載されている合成細胞生産は、通常、107個の合成細胞/mLの近似濃度を有する溶液内で21〜25%の活性集団を生み出す。図3CIIの「-DNA」サンプルによって提示されるわずかな蛍光強度は、S30リセートのようなCFPS反応における異なる成分の自己蛍光によるものである。

上記の方法で調製した合成細胞のGFP信号(直径)に基づく代表的なサイズ分析は、2.4±0.5μmの平均値を示す(図3DII)。この方法での油エマルジョン中の水の形成は機械的な力を加えた結果であるため、粒子のサイズ分布は、エマルジョンの上下のピペット処理の方法や速度、渦ミキサー機のモデルなど、さまざまな要因の影響を受ける可能性があります。

合成細胞のタンパク質産生の多様性を試験するために、合成細胞内部のレポータータンパク質レニラルシメラーゼの発現を分析した(図3E)。このアッセイはルシファーゼとその基質であるh-コエンテラジンの酵素反応から生じる発光を測定することにより、レニラルシファーゼ活性を定量した。酵素反応を誘導するために、測定直前に1μMのh-コエンテラジンを合成細胞(25μLサンプル量)に加えた。「-DNA」サンプルは、ルシファーゼコードDNAテンプレートを含まない、基質の非酵素酸化による発光を試験するための陰性対照として使用した。発光は、プレートリーダーを用いて測定した。

Figure 1
図1:典型的な合成細胞調製プロトコルのプロセスの図。プロセスは2つのステップに分かれています。ステップ1:DNAプラスミド精製、S30-T7溶解物製剤、内および供給溶液に必要なストック溶液製剤、脂質油中溶液調製および外液調製を含む実験前製剤。ステップ2:摂食および内部溶液調製、合成細胞の調製および分析を含む合成細胞形成。合成細胞溶液の100 μLを調製するための各成分の必要量の例は、括弧内に青色で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:合成細胞調製プロトコルの模式図。適切に実行されたプロセスのイメージは、プロトコルの各ステージを示しています。この図は、クリンスキーら19から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:合成細胞内部におけるsfGFPおよびレニラルシファーゼの製造の代表的な結果。(A) CFPSバルク反応と合成細胞内部の両方でのsfGFP-His6産生のウェスタンブロット分析。タンパク質検出は、抗Hisポリクローナル一次抗体(希釈1:12,000)を用いて行った。精製されたsfGFP-His6は陽性対照(7.8 μg)として使用した。sfGFP(カプセル化)は、合成細胞にカプセル化された精製sfGFPの陽性対照である。DNAテンプレートを含まないサンプルを、生産分析のための陰性制御("-DNA")として使用した。(B) 明視野とGFPフィルターを用いた蛍光顕微鏡を用いて撮影したsfGFP産生合成細胞の代表的な画像。スケールバー= 50μm(C)合成細胞の合成細胞活性を生成するsfGFPのI&IIフローサイトメトリー分析(デジタル、4レーザーアナライザを使用して収集したデータ)。試料は3時間のインキュベーション後に測定した。分析されたサンプルごとに 10,000 件のイベントが収集されました。FSC(500V)およびSSC(300V)フィルタを使用して、総合成細胞集団を定義した。次いで、FITC(600V)フィルタを用いてGFP蛍光を検出した。(I)活性合成細胞集団の計算[%]は、GFP蛍光強度閾値に基づき、「-DNA」サンプル(赤色ヒストグラム)によって定義され、〜1%の誤差を許容した。(II)sfGFP産生合成細胞の蛍光強度を平均する。この値は、活性合成細胞集団から計算し、sfGFP-DNAを含まない合成細胞の平均で活性合成細胞の平均蛍光を除いて「−DNA」サンプルに正規化した。(D) I&II 合成細胞サイズ分析発光スペクトルは、GFPおよび明視野信号の505-560 nmおよび642-745 nmでそれぞれ検出された。(I)分析した合成細胞の代表的な画像。(II) 合成細胞のサイズ分布解析を行い、活性合成細胞の直径分布をGFP信号に基づいて算出した。(E) 合成細胞内での活性レニラルシファーゼの製造ルシパラーゼ活性を、プレートリーダーを用いて1μMh-コエンテラジンを添加した後の発光測定で定量し、光強度[RLU]x106として提示した。6この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:バッファおよびストックソリューションの準備
コメント
ルリア・ベルタニ (LB) 寒天 (1.5%)プレート： 準備と滅菌。室温まで冷却した後にのみ、50 μg/mLの最終濃度でアンピシリンを加えます。
10 g/L バクトトリプトン
10 g/L 塩化ナトリウム (NaCl)
5 g/L バクト酵母エキス
精製された15g/L寒天寒天
50 μg/mL アンピシリン
LBメディア(20 mL): 最小限のメディア。事前に準備し、殺菌します。細菌を接種する直前に、50 μg/mLの最終濃度でアンピシリンを加えます。
10 g/L バクトトリプトン
10 g/L 塩化ナトリウム (NaCl)
5 g/L バクト酵母エキス
50 μg/mL アンピシリン
素晴らしいブロス(TB)メディア(1 L): リッチメディア。事前に準備し、殺菌します。細菌を接種する直前に、50 μg/mLの最終濃度でアンピシリンを加えます。
12 g/L バクトトリプトン
24 g/L バクト酵母エキス
4% (v/v) 無水グリセロール
2.32 g/L K2HPO4
12.54 g/L KH2PO4
50 μg/mL アンピシリン
S30ライセートバッファー(1.5 L): 事前に準備し、滅菌します(*DTTおよび2-メルカプトエタノールを除く)。-4 °Cで保管する。
10 mM トリス酢酸塩 at pH = 7.4 トリスマベース。
準備し、酢酸を使用して7.4にpHを調整します。
14 mM 酢酸マグネシウム
60 mM 酢酸カリウム
*1 mM DTT 使用直前に追加する
*0.5 mL/L 2-メルカプトエタノール 使用直前に追加する
1 M ヘペス-コー (pH = 8): HEPESを1 Mの最終濃度に溶解し、KOH溶液を用いてpH8に調整します。
Hepes
水酸化カリウム(KOH)

   

表2:内部溶液の組成。
最終要求内部ソリューション ボリューム
数 試薬 ストックコンク。 最後の簡潔な. 25 μL 50 μL 100 μL 200 μL 300 μL 400 μL
1 ヘペス・コー pH=8 1 M 55mM 1.375 2.75 5.5 11 16.5 22 プレインナーソリューション
2 酢酸マグネシウム 1 M 14mM 0.35 0.7 1.4 2.8 4.2 5.6
3 酢酸カリウム 1 M 50mM 1.25 2.5 5 10 15 20
4 酢酸アンモニウム 5.2 M 155mM 0.75 1.5 3 6 9 12
5 ペグ 6000 50% 3% 1.5 3 6 12 18 24
6 3-PGA 0.5 M 40mM 2 4 8 16 24 32
7 アミノ酸 - 混合物I 50 M 2.5 mM 1.25 2.5 5 10 15 20
8 アミノ酸 - 混合物II 50 M 2.5 mM 1.25 2.5 5 10 15 20
9 Atp 100mM 1.2 mM 0.3 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8
10 Gtp 50mM 1 mM 0.5 1 2 4 6 8
11 Utp 100mM 0.8 mM 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2
12 Iptg 100mM 1 mM 0.25 0.5 1 2 3 4
13 ショ糖 2 M 200 mM 2.5 5 10 20 30 40
14 ** H2O UPW ** ** ** ** ** **
15 S30-T7 リサテ 34% 8.5 17 34 68 102 136
16 * DNAプラスミド 10 μg/mL * * * * * *

   

表3:供給溶液組成物。
最終的に要求された給餌ソリューションのボリューム
数 試薬 ストックコンク。 最後の簡潔な. 25 μL 50 μL 100 μL 200 μL 300 μL 400 μL
1 ヘペス・コー pH=8 1 M 83.3 mM 2.08 4.17 8.33 16.67 25 33.33
2 酢酸マグネシウム 1 M 21.2 mM 0.53 1.06 2.12 4.24 6.36 8.48
3 酢酸カリウム 1 M 75.5 mM 1.89 3.78 7.55 15.1 22.66 30.2
4 酢酸アンモニウム 5.2 M 236.4 mM 1.14 2.27 4.55 9.09 13.64 18.18
5 ペグ - 6000 50% 4.54% 2.27 4.54 9.08 18.16 27.24 36.32
6 3-PGA 0.5 M 60.1 mM 3 6.01 12.01 24.02 36.04 48.04
7 アミノ酸 - 混合物I 50mM 3.8 mM 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
8 アミノ酸 - 混合物II 50mM 3.8 mM 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
9 Atp 100mM 1.8 mM 0.45 0.91 1.81 3.62 5.43 7.24
10 Gtp 50mM 1.5 mM 0.76 1.51 3.02 6.04 9.06 12.08
11 Utp 100mM 1.2 mM 0.3 0.61 1.21 2.42 3.63 4.84
12 Iptg 100mM 1.5 mM 0.38 0.76 1.51 3.02 4.53 6.04
13 グルコース 2 M 200 mM 2.5 5 10 20 30 40
14 H2O UPW 5.92 11.83 23.7 47.38 71.06 94.76

   

表4:合成細胞調製に必要な溶液。
必要なソリューションと材料 コメント
油中の脂質 使用するまで室温で保管してください。セクション2に従って準備
外側のソリューション セクション3.1に従って準備
インナーソリューション セクション3.2に従って準備します。
セクション 4.1 に従ってテストを準備 + コントロールのサンプル.
使用するまで砕いた氷の上に保管してください。
給餌ソリューション セクション3.3に従って準備します。
使用するまで砕いた氷の上に保管してください。

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Discussion

このプロトコルは、大量のタンパク質産生合成細胞を製造するための簡単で手頃な方法を導入しています。アクティブセルの収量は、いくつかの重要なステップに重点を置いて、プロトコルの慎重かつ正確な実行に依存しています。この方法のライセート調製部では、菌体のリセート中に十分な量のタンパク質を得るためには、細胞のリシス前に適切な細菌密度に到達することが不可欠である。第二に、リシスプロセスは、タンパク質活性を維持するために液体窒素で速やかに凍結し、4°Cで行われるべきである。さらに、このプロトコルでは、T7 RNAポリメラーゼを発現するpAR1219プラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)細胞を用いた。異なる菌株が使用される場合、RNAポリメラーゼおよびリボソームの満足のいく量に達するために、ライセート濃度の変化が必要となる場合があります。同じ細菌株が使用される場合でも、異なるライゼート生産物は、バッチからバッチへの変動性を有し得る。

小胞生産セクションには、いくつかの重要な手順も含まれています。脂質の可溶化と鉱物油からのクロロホルムの除去は、油中水エマルションを確立するために重要である。外水バッファーへの油中水滴の遠心分離は、脂質二重層を有する合成細胞を生成するプロトコルの重要なステップでもあります。小胞の内溶液および脂質組成の変化は、観察可能なペレットなしで油水間相で液滴の層につながる可能性があります。これを克服するために、迅速な解決策は、エマルジョン転送工程で遠心速度を1,000 x gに増加させることである。これが問題を解決しない場合、外部水溶液の比重を変更して、内部溶液が外側の溶液よりも高い比重を持つことを保証することができます。さらに、内部溶液の浸透性は、800〜1100 mOsm/kgの間の範囲の異なる溶解源と生産の間で異なることもできる。内部溶液の浸透圧の変動は、主に、その製造工程中に溶解物の濃度が変化するためである。通常、これはタンパク質産生の有意な変化を招くものではなく、しかも大きな希釈は、溶解物自体の転写および翻訳酵素の低濃度による収量の低下につながる可能性がある。各溶解液バッチの全タンパク質濃度を測定することで、インナー溶液中の溶解物濃度を調整して一定の値(ブラッドフォードアッセイで測定した約22mg/mL)を維持することができます。

それにもかかわらず、この方法には、言及すべきいくつかの制限があります。生成された合成細胞のすべてが活性であり、すべての必要な成分の不完全なカプセル化のためにタンパク質を産生することができるわけではありません。フローサイトメトリーを用いて合成細胞を発現するsfGFPを製造する際に、活性細胞の約21~25%を測定しました(活性細胞と不活性細胞の間に有意なサイズ差は認められなかった)。油脂および脂質過剰残基は、合成細胞を水相に移した後、二重層脂質膜に時折残る。油相の脂質とコレステロール濃度を最適化すると、この問題を改善することができます。.また、得られた合成細胞のサイズ分布は、約1〜50μmの小胞を用いた代替マイクロ流体法と比較して非常に広い点に注意することも重要です。

エマルジョン転写法の高い収率は、治療タンパク質産生のための無細胞タンパク質合成システムをカプセル化する合成細胞に特に適している。エマルジョン転写法の異なるバリエーションは、合成細胞研究で使用されており、油調製手順、膜組成、サンプル体積、内溶液と油の比率および遠心速度55、24、2824,28に対する変化が含まれていた。合成細胞の調製にはマイクロ流体およびポリマーベースの液滴安定化法も用いられているが、CFPS系全体の封入は、これらの方法21、22、2322,23で21まだ行われていない。

この方法で得られた合成細胞を、タンパク質を産生し、マウスモデル19で癌を治療するために生体内で示した。これらの細胞の能力は、タンパク質発現を超えて、将来的にさらに拡大することができます。細胞通信、細胞骨格修飾および合成細胞における細胞分裂などの他の細胞プロセスの統合は、最近33、34、35、36,35,36に記載されている。33,細菌リゼートを真核細胞リセートと置換すると、より高い複雑性および翻訳後修飾を有するタンパク質の発現が可能となり、洗浄手順がなくても免疫原性が低くなり、したがって治療フロンティア37を開く。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この作業は、ERC-STG-2015-680242によってサポートされました。

著者らはまた、テクニオン統合癌センター(TICC)の支援を認める。ラッセル・ベリーナノテクノロジー研究所;ローリーI.ローキー生命科学・工学センター;カミングラントのためのイスラエル経済省(52752);イスラエル科学技術宇宙省 - 主任科学者のオフィス (3-11878);イスラエル科学財団(1778/13,1421/17);イスラエル癌協会(2015-0116);GIFヤング助成金のための科学研究開発のためのドイツ・イスラエル財団(I-2328-1139.10/2012);キャリアインテグレーション補助金のための欧州連合FP-7 IRGプログラム(908049)。リン脂質研究センター助成金;ローゼンブラットがん研究財団、マラットファミリー財団助成金;アンガーファミリー財団。A.シュレーダーはアロンとタウブフェローシップを認めています。O. アディールはシャーマンとグットヴィルトのフェローシップを認める。G.チェンはシャーマン・フェローシップを認める。N.クリンスキーは、ロスチャイルド・カイザリア財団のアリアン・ド・ロスチャイルド女性博士課程を認めています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)  NEB C2527 E.coli BL21 (DE3).
pAR1219 Sigma T2076 TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin Sigma A9518 Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
15 g/L Agar agar purified Merck 1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
12 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous Bio-Lab 7120501
2.32 g/L K2HPO4 Spectrum chemical P1383
12.54 g/L KH2PO4 Spectrum chemical P1380
 50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  INALCO INA-1758-1400 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)  TCI D1071 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 Sigma T1503 S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate Merck 1.05819.0250
60 mM potassium acetate Carlo Erba 470147
1 mM DTT TCI D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol Sigma M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks Thermo Scientific 50-154-2846 2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles KIMAX-KIMBLE 25630 2 flasks
Floor incubator shaker MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor.
Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer AVESTIN EmulsiFlex-C3 Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer SO-LOW U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer TECAN IN-MNANO Infinite M200 pro
96-well transparent plate Thermo Scientific 167008
Sterilized graduated cylinder Corning
Sterilized centrifuge tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips Corning Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
Small liquid nitrogen tank NALGENE 4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Lipoid 556400 Powder
Cholesterol Sigma C8667 Powder
Chloroform Bio-Lab 3082301
Mineral oil Sigma M5904 Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Heating block TECHNE FDB03AD Pre-heated to 80 °C.
Should enable controlled temperature. 
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232 For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap CSI Analytical Innovations C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES Spectrum H1089 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer
Potassium hydroxide (KOH) Frutarom 55290
1 M Magnesium acetate Merck 1.05819.0250 Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate Carlo Erba 470147 Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate Merck 1.01116.1000 Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) Merck 8.07491.1000 Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) Sigma P8877 Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP) Sigma A3377 Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) Sigma G8877 Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP) ACROS ORGANICS 226310010 Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) INALCO INA-1758-1400 Genes expression induction.
2 M Sucrose J.T. Baker 1933078 Generating a density gradient.
2 M Glucose Sigma 16301 Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW) Bio-Lab 2321777500 DNase & RNase free
S30-T7 lysate _ _ Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components.
Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. 
Stock of DNA plasmid of choice _ _ Contains the sequence for the requested protein.
Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
PHMT Grant Bio  PSC18 Thermomixer
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor.
Suited for 15 mL sized tubes.
Preferably swinging buckets.
Should enable at least 1000 x g.
Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge Thermo Scientific 75002420 (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal.
Suited for Eppendorf vials.
Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes Thermo Scientific 339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086
Sterilized pipette tips Corning Sterilized by autoclave.

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References

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