Summary
이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.
Abstract
합성 세포의 건설을위한 상향식 조립 방법은 세포를 모방 한 환경에서 세포 과정을 격리하고 조사하기위한 효과적인 도구입니다. 더욱이, 세포 없는 발현 시스템의 발달은 합성 생물학을 활용하는 통제된 방식으로 단백질 생산, 전사 및 번역 과정(DNA→RNA→단백질)을 재구성하는 능력을 입증하였다. 여기에서 우리는 강력한 세균 용해물의 생산을 포함하여 세포 자유 발현 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고, 합성 세포를 형성하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 지질 기지를 둔 거대한 unilamellar 소포 (GUV) (즉, 안정한 리포솜) 안쪽에 이 용해물을 캡슐화합니다. 이 프로토콜은 활성 세균 용해물의 생산을 포함하는 합성 세포의 성분을 제조하는 방법을 설명하고, 이어서 수중 오일 에멀젼 전달 방법에 기초하여 합성 세포의 상세한 단계별 제조를 기술한다. 이들은 단백질의 다른 모형을 생산하기 위한 높은 다양성으로 간단하고 적당한 방법으로 합성 세포의 수백만의 생산을 촉진합니다. 얻어진 합성 세포는 고립된 환경에서 단백질/RNA 생산 및 활동을 조사하기 위하여, 지시된 진화에서, 또한 바디 안쪽에 치료 단백질의 온디맨드 생산을 위한 통제된 약 납품 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.
Introduction
합성 세포는 인공 세포와 같은 입자로서, 유전자 코드1,,2,,3에기초하여 단백질을 분열, 포름, 합성하는 능력과 같은 살아있는 세포의 하나 또는 다중 기능을 모방한다. 무세포 단백질 합성 (CFPS) 시스템을 둘러싸는 합성 세포는 DNA 템플릿의 변경 에 따라 다양한 단백질과 RNA 서열을 생산하는 능력으로 인해 높은 모듈성을 가지고 있습니다. 단백질 생산의 현재 접근법에 대한 매력적인 대안을 제시하는 CFPS 시스템은 세포 용해물, 정제 성분 또는 합성 성분을 기반으로 하며 리보솜, RNA 폴리머라제, 아미노산 및 에너지 원(예를 들어, 3-인산성산염 및 아데닌5,6,7,8,트리포스페이트)과 같은 단백질 합성에 필요한 모든 전사 및 번역 기계를4,포함합니다.9 지질 소포 내부의 CFPS 시스템의 캡슐화는 살아있는 세포(10)에의존하지 않고 단백질의 간단하고 효율적인 생산을 가능하게한다. 더욱이, 이 플랫폼은 천연 세포 내부의 분해될 수 있는 펩타이드의 합성을 허용하고, 살아있는 세포에 독성이 있는 단백질의 생산을 허용하며, 비천연 아미노산11,,12로단백질을 수정한다. 합성 세포는 진화적 관점에서 세포 생명을 가능하게 하는 데 필요한 최소한의 세포 성분을 조사하는 연구 목적으로 모델로 사용되어 왔다1,,13. 합성 세포는 또한 유전 회로를 구축하고 구현하는 데 사용되었으며 지시 된 진화14,,15,,16을위한모델로 사용되었습니다. 다른 연구는 당뇨병 환자에서 베타 세포와 같은 손상된 천연 세포를 대체하는 것을 목표로 천연 세포의 생물학적 활성을 모방하는 합성 세포의 능력에 초점을 맞추고있다 17. 더욱이, 다양한 치료 단백질을 생산하는 합성 세포를 캡슐화하는 이러한 CFPS의 능력은 임상 용법18에통합될 수 있는 잠재력을 보여준다.
여기서 우리는 지질 소포에 캡슐화된 CFPS 시스템에 기초한 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 생산을 위한 상향식 실험실 스케일프로토콜(그림 1)을기술한다. 이는 생체내 치료 단백질 약물의 현장 생산을 위한 신규한 약물 전달 시스템으로서 합성 세포 플랫폼의 잠재적 사용을 보여준다19. 이전 연구는 CFPS 반응및 세포 리세이트 제제 과정의 최적화를조사한 4,,8,,20. 더욱이, 미유체 및 중합체 계,물방울 안정화 방법21,22,,23,리포좀 의 지질 조성물24,25,26과 같은 세포 크기의 리포좀 제제에 여러 기술이 적용되었다.,, 제시된 프로토콜에서, 합성 세포는 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하여 제조되고 캡슐화 과정은 저온(&4°C)5,,10,,24,,27,,28에서수행된다. 이러한 온화한 조건은 분자 기계, 즉 리보솜 및 단백질27,,29,,30의생체 기능 적 무결성을 유지하는 데 유리한 것으로 밝혀졌다. 입자의 지질 조성물은 콜레스테롤과 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)으로 구성된다. 첫 번째는 모든 포유류 세포막에서 발견되며 멤브레인의 안정성, 강성 및 투과성 감소에 필수적이며, 후자는 포유류 인지질 조성물11,,13을모방한다. 세포 전사 및 번역 분자 기계는 BL21 (DE3) 대장균 (대장균) 균주에서 추출되며, 이는 pAR1219 플라스미드로 변형되어 T7 RNA 폴리머라제와 함께 변형되어 CFPS 효능 및 단백질 합성을 증가시킵니다. 이 시스템은 생체외 및 생체내19,,31의분자량으로 진단 및 치료 단백질을 생산하는 데 사용되었습니다. 다음 프로토콜은 합성 세포 시스템의 생산을 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 본질적으로 단백질 합성과 관련된 광범위한 근본적인 문제를 해결할 수 있으며 약물 전달 응용 분야에도 활용될 수 있다.
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Protocol
참고: 완전한 합성 세포의 생산 프로토콜의 그림은 그림 1에제시되어 있습니다. 사용자의 필요에 따라, 프로토콜의 단백질 발현(섹션 3.2) 및 합성 세포 형성(섹션 4) 부분도 독립적으로 수행될 수 있다(일부 적응).
1. S30-T7 용해의 준비
- 줄무늬 플레이트는 50 μg/mL ampicillin으로 보충된 LB-한천 플레이트상에서 pAR1219 플라스미드를 발현하는 T7 RNA 폴리머라제로 변형된 대장균 BL21(DE3) 박테리아를 단일 콜로니를 얻었다.
- 스타터 용액 준비: 단일 콜로니를 100 mL Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin으로 보충한 LB-미디어 5 mL에 접종하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 하룻밤 동안 성장합니다. 중복을 준비합니다.
- 각 5 mL 스타터를 500 mL의 TB 매체에 500 mL로 별도로 접종하여 배플이 있는 2 L Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin을 보충하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 성장하여 OD600 0.8-1에 도달할 때까지 키우십시오. 분광광도계를 사용하여 주기적으로 모니터링합니다.
- T7 RNA 폴리머라제 발현의 유도를 위해 IPTG의 100 mM 스톡(0.4-0.6 mM에 도달)의 2-3 mL을 추가하고 OD600□4에 도달할 때까지 배양을 계속 성장시다.
- 각 Erlenmeyer 플라스크에서 2개의 250mL 멸균 원심분리기 튜브로 용액을 옮니다.
- 원심분리기는 각각 7,000 x g에서 4°C에서 10분 동안. 상급제는 버리십시오.
참고 : 이 단계에서, 세균 펠릿은 다음 단계로 이동하기 전에 며칠 동안 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. - 250 mL의 콜드(4°C) S30 용해 완충액 및 원심분리기에서 각 펠릿을 4°C에서 10분 동안 7,000 x g에서 다시 중단합니다.
참고: S30 용해 완충제는 1.9단계에서 균질화기를 사용하여 세포 용해가 수행된 후 단백질 안정성을 유지하기 위해 사용된다. 이 단계부터 1.12까지의 모든 단계를 연속적이고 신속하게 수행해야 합니다.
참고 : 다음 단계로 진행하기 전에, 용해를 저장하는 데 필요한 팁과 1.5 밀리리터 바이알을 미리 냉각 - 상급을 버리고 차가운 S30 용해 완충액 의 15 mL에서 모든 펠릿을 함께 다시 일시 중단하십시오. 거즈 패드를 사용하여 현탁액을 필터링합니다.
참고 : 용액 15ml는 균질화 최소 부피 때문입니다. 박테리아 농도 또한 중요 한 것으로 나타났습니다. - 세포 파손에 대한 4 bar (2 패스)의 공기 압력으로 15,000 psi의 작동 압력에서 균질화하십시오. 더 집중되고 활성 용해를 위해 용액 희석을 피하십시오.
- 균질화된 현탁액의 10 mL당 0.1 M DTT(주의)의 100 μL을 추가합니다.
- 4°C에서 30분 동안 24,700 x g에서 현탁액을 원심분리기.
- 용해 활성을 보존하기 위해 다음 단계를 신속하게 수행하십시오 : 상급 을 1.5 mL 바이알에 200 μL aliquots로 나누고 즉시 액체 질소로 동결하십시오. 추가 사용을 위해 -80 °C에서 보관하십시오.
주의: DTT는 자극성 및 유해한 것으로 분류되므로 주의해서 취급해야 합니다.
2. 오일 용액의 지질 준비
- POPC와 콜레스테롤을 클로로포름(주의)에 별도로 녹여 서 각각 100 mg/mL의 최종 농도로 하십시오. 소용돌이 각 유리병 별도로.
- 2mL 유리 병에 성분을 결합 : 클로로 포름에 POPC의 50 μL, 클로로 포름에 콜레스테롤 의 50 μL과 미네랄 오일 500 μL을 추가합니다. 합성 세포의 100 μL의 경우, 오일에 지질 2 병이 필요합니다.
- 소용돌이, 그리고 약 1시간 동안 가열한 후 80°C에서 화학적 후드로 클로로포름을 증발시다. 지정된 시간/조건을 따르고 솔루션 볼륨을 모니터링하여 완전한 증발이 발생했는지 확인합니다.
참고: 생성된 지질-인-오일 용액은 최대 2주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 향상 된 결과 위해, 각 실험 전에 신선한 준비를 사용 하는 것이 좋습니다. 지질 과 콜레스테롤 비율은 원하는 막 조성물에 따라 변경될 수 있습니다. 콜레스테롤의 높은 농도는 최종 합성 세포 용액에 응집체의 형성으로 이어질 수 있습니다.
주의: 클로로포름은 자극성 및 유해한 물질로 분류되므로 주의깊게, 연기 추출이 가능한 부위에 취급되어야 합니다.
3. 외부, 프리 인내 및 공급 용액의 준비
- 재고 솔루션 준비
- 초순수(UPW)를 사용하여 표 2에 나열된 재고 솔루션을 준비합니다.
참고: 재고 용액은 사전에 준비하고 추가 사용이 될 때까지 -20 °C에 보관해야합니다. 시약 7은 응집체를 형성하는 경향이 있다. 37°C로 가열하면 응집을 감소시킬 것이다. 약간의 응집은 반응에 크게 영향을 미치지 않습니다. 시약 8 용액은 유백색과 탁한 입니다.
- 초순수(UPW)를 사용하여 표 2에 나열된 재고 솔루션을 준비합니다.
- 외부 솔루션
- DNase/RNase 프리H2O에서 포도당을 200 mM의 최종 농도로 용해시다.
- 내부 용액의 100 μL의 경우 외부 용액 1.6 mL을 준비하십시오.
- 프리 이너 솔루션
- 표 2에열거된 양 및 농도에 따라 시약 1-14를 첨가한다. 예를 들어, 100 μL의 최종 합성 세포 부피의 경우, 내부 용액의 100 μL을 준비한다.
참고: 최종 필요한 볼륨을 완료하려면 UPW를 추가해야 합니다. 이 단계에서, 혼합물은 몇 시간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 표 2에열거된 양 및 농도에 따라 시약 1-14를 첨가한다. 예를 들어, 100 μL의 최종 합성 세포 부피의 경우, 내부 용액의 100 μL을 준비한다.
- 공급 솔루션
- 표 3에 열거된 양 및 농도에 따라 모든 시약을 첨가한다.
참고 : 공급 용액 : 내부 용액의 1 : 1 비율을 사용합니다. 100 μL의 최종 합성 세포 부피를 위해 100 μL의 공급 용액을 준비하십시오. 외부, 내부 및 공급 용액의 작은 과잉 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.
- 표 3에 열거된 양 및 농도에 따라 모든 시약을 첨가한다.
4. 합성 세포의 준비
참고: 합성 세포의 100 μL의 제조를 위해 다음 부피가 조정됩니다.
- 단백질을 생산하는 합성 세포
- 15 mL 튜브에 외부 용액의 12 mL를 놓고 오일 용액에 500 μL의 지질을 천천히 추가하십시오. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 내부 용액 준비를 마무리하기 위해: 분쇄된 얼음 상에 내부 용액 성분을 해동하고 S30-T7 Lysate(시약 15) 및 DNA 플라스미드(시약 16)를 첨가하여 최종 부피 100 μL로 혼합하여 저장된 혼합물에 첨가한다.
- 오일 용액에 500 μL의 지질을 가진 두 번째 2 mL 유리 병에 내부 용액의 100 μL을 추가하십시오. 파이펫을 1분 동안 힘차게 위아래로, 레벨 5에서 1분 동안 소용돌이를 피펫으로 바하십시오.
- 분쇄된 얼음에 10분 동안 배양하고 15 mL 튜브(4.1.1부터)에서 오일 상 위에 결과된 에멀젼을 천천히 추가합니다.
- 원심분리기는 100 x g 및 4°C에서 10분 간, 400 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하였다. 원심 분리가 끝나면 튜브 바닥에있는 펠릿이 관찰되어야합니다.
참고: 스윙 버킷 원심분리기 로터를 사용하면 물-인-오일 방울이 중간상을 통과하는 동안 지질의 두 번째 층을 더 잘 커버하는 것이 바람직하다. 관찰 가능한 펠릿이 없는 경우 원심 분리 속도를 1000 x g로늘릴 수 있습니다. 그렇지 않으면 외부 용액의 비중을 참조하는 토론 섹션을 참조하십시오. - 펠릿을 추출합니다.
- 여분의 오일 층을 제거합니다.
- 약 400 μL의 외부 용액이 적재된 트리밍 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 추출합니다. 수성 상에서 펠릿만을 수집하기 위해 오일 상을 통과하면서 외부 용액을 방출한다.
- 펠릿을 추출한 후 팁을 닦아 오일 잔류물 이송을 피하고 펠릿을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮김하십시오.
- 1,000 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거하고 100 μL의 공급 용액 (내부 : 공급 용액의 1 : 1 비율)에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
참고: 고정각도 원심분리기 로터도 여기에서 사용할 수 있습니다. - 단백질 발현을 위해, 흔들리지 않고 37°C에서 2시간 동안 배양한다.
참고: 최적의 배양 시간은 단백질마다 다릅니다. - 표적 단백질 특성에 따라 적합한 방법을 사용하여 생성된 단백질 양을 평가한다.
- 권장 제어 그룹
- 내부 용액 및 용해 활동 확인
- 완벽한 내부 용액을 준비하십시오 (DNA 및 S30-T7 용해).
- 즉시 250 rpm에서 바닥 인큐베이터 셰이커 또는 1200 rpm에서 열믹서를 사용하여 위의 반응을 2 시간 동안 37 °C의 일정한 온도에서 배양합니다.
참고 : 합성 세포 배양 시간과 일치하도록 인큐베이션 시간을 조정합니다.
- 합성 세포
- 음성 대조군: DNA없이 내부 용액으로 4.1에 제시된 프로토콜을 준비한다.
- 양성 대조군: 리포터 유전자에 대한 T7 플라스미드 인코딩을 포함하는 내부 용액으로 4.1에 제시된 프로토콜을 준비한다.
참고: 캡슐화 효율 단계를 보장하기 위해 sfGFP와 같은 리포터 유전자로 구성된 양성 대조군을 테스트 그룹과 함께 추가합니다.
- 내부 용액 및 용해 활동 확인
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Representative Results
우리는 지질 소포 내부의 BL21 대장균에 기초한 S30-T7 CFPS 시스템을 캡슐화하여 합성 세포의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 도 2에각 단계의 이미지를 포함하는 준비 과정에 대한 개략적 설명이 제시된다. 합성 세포 전처리 과정의 성공은 각 단계의 적절한 성능에 의존하고 상이한 파라미터에 의해 영향을 미친다. 프로토콜은 특정 단백질의 생산을 수용하도록 조정되어야 한다.
모델 단백질 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 및 르닐라 루시퍼라아제를 T7 프로모터로 발현한 플라스미드는 CFPS 벌크 반응 및 합성 세포에 도입되었고, 단백질 생산은 서양 블롯, 유세포 분석, 현미경 및 분광법을 포함한 다양한 방법을 사용하여 평가되었다(그림3). sfGFP-그의6 태그 단백질(~27 kDa32)의서방 얼룩 분석에 의한 생산의 검증은 도 3A에제시된다. 6접게 희석된 합성 세포의 30 μL 샘플을 일반적인 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μL(세제 도데실 황산나트륨(SDS) 및 β-메르카페탄올 함유)와 10분(95oC)동안 끓였다. 우리는 견본 완충제에 있는 열과 세제의 조합이 소포를 분해하고 SDS-PAGE 젤에 있는 단백질의 실행을 가능하게 하기에 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다. 단백질 검출은 항-그의 폴리클로날 1차 항체(희석 1:12,000)를 사용하여 수행하였다. 예상대로, 단백질 생산은 sfGFP 인코딩 DNA 템플릿 ("+sfGFP DNA")을 포함하는 견본에서 검출되는 동안, DNA 템플릿이 제외된 음성 통제 견본에서 아무 단백질도 관찰되지 않습니다 ("-DNA"). 합성 세포의 멤브레인 ('sfGFP (캡슐화)) 내에 캡슐화 된 정제 된 sfGFP 및 정제 된 sfGFP 샘플은 sfGFP CFPS 대량 생산및 합성 세포 내에서의 합성을위한 긍정적 인 대조군으로 사용됩니다. 이 방법은 상이한 단백질 유형에 적용될 수 있다. Krinsky 등19에따르면, 상세한 프로토콜하에서 얻어진 sfGFP 생산 수율은 CFPS 용액에서 380 μg/mL이고 CFPS 용액이 지질 소포 내부에 캡슐화될 때 5.3 μg/mL이다.
합성 세포 내부에서 생산되는 단백질이 형광이되면 현미경 검사법 및 유동 세포 분석 기반 방법을 사용하여 생산을 평가 할 수 있습니다. GFP 형광에 대한 필터를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 합성 세포를 분석하였다(도3B). CFPS 구성 요소에는 일부 자가 형광이 있기 때문에 이미지 수집 매개 변수는 적절한 음성 대조군 샘플(예를 들어 DNA 템플릿이 없는 합성 세포)에 따라 조정되어야 합니다.
또한, 우리는 sfGFP 생산 합성 세포의 평균 형광 강도, 그리고 그 안에 단백질을 생성 할 수있는 활성 합성 세포의 비율을 결정하기 위해 유세포 측정을 사용(그림 3C I & II). 분석된 각 샘플에 대해 10,000개의 이벤트가 수집되었습니다. 이 프로토콜에 설명된 합성 세포 생산은 일반적으로 107 개의 합성 세포 / mL의 대략적인 농도로 용액 내에서 21-25 %의 활성 집단을 산출합니다. 도 3C II에서 "-DNA" 샘플에 의해 제시된 경미한 형광 강도는 S30 용해물과 같은 CFPS 반응에서 상이한 성분의 자가형광에 기인한다.
상술한 방법에 의해 제조된 합성 세포의 GFP 신호(직경)에 기초한 대표적인 크기 분석은 2.4±0.5 μm의 평균 값을나타낸다(도 3D II). 이 방법에서 오일 에멀젼의 물 형성은 기계적 힘을 가하는 결과이기 때문에 입자의 크기 분포는 에멀젼을 상하로 파이펫팅하는 방법 및 속도, 와류 믹서 기계의 모델 등과 같은 다른 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
합성 세포의 단백질 생산의 다양성도를 시험하기 위해, 합성 세포 내부의 리포터 단백질 레닐라 루시퍼라아제의 발현을 분석하였다(도3E). 이 분석기는 루시퍼라아제와 그의 기질, h-coelenterazine의 효소 반응으로부터 생성된 발광을 측정함으로써 레닐라 루시퍼라아제 활성을 정량화하였다. 효소 반응을 유도하기 위해, 측정 직전에 합성 세포(25 μL 샘플 부피)에 1 μM의 h-coelenterazine의 최종 농도를 첨가하였다. "-DNA" 샘플은, 루시퍼라제 인코딩 DNA 템플릿을 함유하지 않고 기판의 비효소 산화로 인한 발광 시험을 위한 음성 대조군으로 사용하였다. 발광은 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다.
도 1: 전형적인 합성 세포 제제 프로토콜에 대한 공정의 예시. 이 과정은 두 단계로 나뉩니다. 1 단계 : DNA 플라스미드 정제, S30-T7 용해제 준비, 내부 및 공급 용액에 필요한 재고 용액 준비, 지질 - 인 - 오일 용액 준비 및 외부 용액 준비를 포함한 사전 실험 준비. 2 단계 : 공급 및 내부 솔루션 준비, 합성 세포 준비 및 분석을 포함하는 합성 세포 형성. 합성 세포 용액의 100 μL을 준비하기 위한 각 성분의 필요한 부피의 예는 괄호로 파란색으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 합성 세포 제제 프로토콜의 개략적 그림. 잘 수행된 프로세스의 이미지는 프로토콜의 각 단계를 보여 줍니다. 이 그림은 크린스키 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 합성 세포 내부의 sfGFP 및 레닐라제라제의 생산의 대표적인 결과. (A)CFPS 대량 반응과 합성 세포 내부에서 sfGFP-His6 생산의 서쪽 얼룩 분석. 단백질 검출은 항-그의 폴리클로날 1차 항체(희석 1:12,000)를 사용하여 수행하였다. 정제된 sfGFP-His6은 양성 대조군(7.8 μg)으로 사용하였다. sfGFP(캡슐화)는 합성 세포에 캡슐화된 정제된 sfGFP의 양성 대조군이다. DNA 템플릿이 없는 샘플은 생산 분석을 위한 음성 대조군("-DNA")으로 사용하였다. (B)밝은 필드와 GFP 필터를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 촬영 한 합성 세포를 생산하는 sfGFP의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 50 μm.(C)sfGFP의 I&II 유동 세포 분석 분석 (디지털, 4 레이저 분석기를 사용하여 수집 된 데이터). 샘플을 3h 의 배양 후에 측정하였다. 분석된 각 샘플에 대해 10,000개의 이벤트가 수집되었습니다. FSC(500 V) 및 SSC(300 V) 필터를 사용하여 총 합성 세포 집단을 정의하였다. 이어서, FITC(600 V) 필터를 사용하여 GFP 형광을 검출하였다. (i) 활성 합성 세포 집단 [%]의 계산은 GFP 형광 강도 임계값을 기초로 하였고, "-DNA" 샘플(red histogram)에 의해 정의되어~ 1%의 오차를 허용하였다. (II) 합성 세포를 생산하는 sfGFP의 평균 형광 강도. 이 값은 활성 합성 세포 집단으로부터 계산하고 sfGFP-DNA 없이 합성 세포의 평균형을 합성 세포의 평균으로 나누어 "-DNA" 샘플로 정규화하였다. (D)I&II 합성 세포 크기 분석. 방출 스펙트럼은 GFP 및 밝은 필드 신호에 대해 각각 505-560 nm 및 642-745 nm에 의해 검출되었다. (I) 분석된 합성 세포의 대표적인 이미지. (II) 합성 세포의 크기 분포. 분석은 수행되었고, 활성 합성 세포의 직경 분포는 GFP 신호에 기초하여 계산되었다. (E)활성 레닐라 루시퍼라아제 의 합성 세포 내부 생산. 루시퍼라제 활성은 플레이트 리더를 사용하여 1 μM h-coelenterazine를 첨가한 후 발광 측정으로 정량화하고 광강도 [RLU] x 106으로제시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표 1: 버퍼 및 재고 솔루션 준비. | |
| 코멘트 | |
| 루리아 베르타니 (LB) 한천 (1.5%) 격판덮개: | 준비하고 살균하십시오. 암피실린을 실온으로 냉각한 후에만 50 μg/mL의 최종 농도로 추가하십시오. |
| 10 g/L 바토 트립톤 | |
| 염화나트륨(NaCl) 10 g/L | |
| 바토 효모 추출물 5 g/L | |
| 정제된 한천 15 g/L 한천 | |
| 50 μg/mL 암피실린 | |
| LB 미디어(20mL): | 최소한의 미디어. 사전에 준비하고 소독하십시오. 박테리아를 접종하기 직전에 50 μg / mL의 최종 농도로 Ampicillin을 추가하십시오. |
| 10 g/L 바토 트립톤 | |
| 염화나트륨(NaCl) 10 g/L | |
| 바토 효모 추출물 5 g/L | |
| 50 μg/mL 암피실린 | |
| 훌륭한 국물 (TB) 미디어 (1 L): | 리치 미디어. 사전에 준비하고 소독하십시오. 박테리아를 접종하기 직전에 50 μg / mL의 최종 농도로 Ampicillin을 추가하십시오. |
| 12 g/L 바토 트립톤 | |
| 바토 효모 추출물 24 g/L | |
| 4% (v/v) 글리세롤 무수 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL 암피실린 | |
| S30 리세이트 버퍼(1.5L): | 사전에 준비하고 소독하십시오 (*DTT 및 2-메르카포에탄올 제외). -4 °C에서 보관하십시오. |
| pH에서 10 mM 트리스 아세테이트 = 7.4 | 트리스마 베이스. 아세트산을 사용하여 pH를 7.4로 준비하고 조절합니다. |
| 14 mM 마그네슘 아세테이트 | |
| 아세테이트 60 mM 칼륨 | |
| *1 mM DTT | 사용하기 직전에 추가 |
| *0.5 mL/L 2-메르카포에탄올 | 사용하기 직전에 추가 |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | HEPES를 KOH 용액을 사용하여 pH 8로 조정하여 최종 농도1M으로 용해합니다. |
| 헤페스 (주)는 | |
| 수산화칼륨 (KOH) | |
| 표 2: 내부 용액 조성물. | ||||||||||
| 최종 요청된 내부 솔루션 볼륨 | ||||||||||
| 수 | 시약 | 주식 콘. | 최종 conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μ ℓ | |
| 1 | 헤페스 KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | 프리 내부 솔루션 |
| 2 | 마그네슘 아세테이트 | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | 아세테이트 칼륨 | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | 암모늄 아세테이트 | 5.2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | 못 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0.5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | 아미노산 -혼합물 I | 50 M | 2.5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | 아미노산 - 혼합물 II | 50 M | 2.5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1.2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0.8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | 자당 | 2 M | 200mm | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 리세이트 | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA 플라스미드 | 10 μg/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| 표 3: 공급 용액 조성물. | |||||||||
| 최종 요청된 급지 용액 볼륨 | |||||||||
| 수 | 시약 | 주식 conc. | 최종 conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μL |
| 1 | 헤페스 KOH pH=8 | 1 M | 83.3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | 마그네슘 아세테이트 | 1 M | 21.2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | 아세테이트 칼륨 | 1 M | 75.5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | 암모늄 아세테이트 | 5.2 M | 236.4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | 페그 - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0.5 M | 60.1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | 아미노산 -혼합물 I | 50 mM | 3.8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | 아미노산 - 혼합물 II | 50 mM | 3.8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1.8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1.5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1.2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1.5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | 포도 당 | 2 M | 200mm | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| 표 4: 합성 세포 준비를 위한 필수 솔루션. | |
| 솔루션 및 재료 필요 | 코멘트 |
| 오일의 지질 | 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 섹션 2에 따라 준비 |
| 외부 솔루션 | 섹션 3.1에 따라 준비 |
| 내부 솔루션 | 섹션 3.2에 따라 준비. |
| 준비 테스트 + 섹션 4.1에 따라 샘플을 제어합니다. | |
| 사용할 때까지 으깬 얼음을 사용하세요. | |
| 공급 솔루션 | 섹션 3.3에 따라 준비. |
| 사용할 때까지 으깬 얼음을 사용하세요. | |
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Discussion
이 프로토콜은 다량의 단백질 생산 합성 세포를 생산하기 위한 간단하고 저렴한 방법을 소개합니다. 활성 세포의 수율은 몇 가지 중요한 단계에 중점을 둔 프로토콜의 신중하고 정확한 실행에 달려 있습니다. 이 방법의 분해 제제 섹션에서, 세균 분해에 충분한 양의 단백질을 달성하기 위해 세포 가포하기 전에 적절한 박테리아 밀도에 도달하는 것이 필수적이다. 둘째, 용해 과정은 단백질 활성을 유지하기 위해 액체 질소로 신속하게 4°C 및 용해액을 동결하여 수행해야 한다. 더욱이, 이 프로토콜에서는 T7 RNA 폴리머라제발현을 pAR1219 플라스미드로 형질전환한 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하였다. 박테리아의 다른 긴장이 이용되는 경우에, 용해 농도에 변경은 RNA 중합효소 및 리보솜의 만족스러운 양에 도달하기 위하여 요구될 수 있습니다. 동일한 박테리아 균주를 사용하는 경우에도 다른 용해수기 생산은 일부 배치 대 배치 가변성을 가질 수 있습니다.
소포 생산 섹션에는 몇 가지 중요한 단계도 포함되어 있습니다. 지질의 용해및 미네랄 오일로부터 클로로포름의 제거는 수중 오일 에멀젼을 확립하는 데 중요하다. 외부 수성 완충액으로 의물방울의 원심분리는 또한 지질 이중층을 가진 합성 세포를 생성하는 프로토콜의 핵심 단계이다. 소포및 지질 조성물의 내부 용액의 변화는 관찰 가능한 펠릿없이 오일-물 상호상에서 방울층으로 이어질 수 있다. 이를 극복하기 위해, 신속한 해결책은 에멀젼 전달 단계에서 원심분리 속도를 1,000 x g으로 증가시키는 것이다. 이 문제를 해결하지 못하는 경우, 외부 수성 용액의 비중을 변경하여 내부 용액이 외부 용액보다 더 높은 비중을 갖도록 할 수 있습니다. 또한, 내부 용액의 삼투압은 또한 800-1100 mOsm/kg 사이에서 구역 수색하는 다른 용해 근원 및 생산 사이에서 변화할 수 있습니다. 내부 용액의 삼투성의 가변성은 주로 생산 공정 중 용해물의 농도 변화에 기인합니다. 일반적으로 이것은 단백질 생산에 있는 중요한 변경으로 이끌어 내지 않습니다, 그러나 큰 희석은 용해 자체에 있는 전사 그리고 번역 효소의 낮은 사격량 때문에 감소된 수율로 이끌어 낼 수 있습니다. 각 용해 배치의 총 단백질 농도를 측정하면 내부 용액의 용해 농도를 조정하여 일정한 값을 유지할 수 있습니다(브래드포드 분석법에 의해 측정된 약 22 mg/mL).
그럼에도 불구하고이 방법은 언급해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 생성된 모든 합성 세포가 활성화되어 있고 필요한 모든 성분의 불완전한 캡슐화로 인해 단백질을 생산할 수 있는 것은 아닙니다. 우리는 유세포측정을 사용하여 합성 세포를 발현하는 sfGFP를 생산할 때 활성 세포의 약 21-25%를 측정했습니다(활성 세포와 비활성 세포 간에 유의한 크기 차이는 관찰되지 않았습니다). 오일 및 지질 과잉 잔기는 때때로 수성 단계로 합성 세포의 전송 후 이중 층 지질 막에 남아있다. 오일 단계에서 지질과 콜레스테롤 농도최적화하면 이 문제를 개선할 수 있습니다. 또한 수득된 합성 세포의 크기 분포는 약 1-50 μm에 이르는 소포와 함께 대체 미세 유체 방법에 비해 상당히 넓다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
에멀젼 전달 방법의 높은 수율은 치료 단백질 생산을위한 무세포 단백질 합성 시스템을 캡슐화 합성 세포에 특히 적합합니다. 에멀젼 전달 방법의 다른 변이는 합성 세포 연구에 사용되어 왔으며 오일 제제 절차, 멤브레인 조성, 샘플 부피, 오일 비율 및 원심 분리속도에대한 내부 용액의 변화를포함5,,24,28. 미세유체 및 중합체 계 액적 안정화 방법도 합성 세포 제제에 사용되어 왔지만, 전체 CFPS 시스템의 캡슐화는 이러한 방법21,,22,,23으로아직 수행되지 않았다.
이 방법에 의해 수득된 합성 세포는 뮤린 모델19에서단백질을 생산하고 암을 치료하기 위해 생체 내에서 나타났다. 이들 세포의 능력은 미래에 단백질 발현을 넘어 더욱 확장될 수 있다. 세포 통신, 세포골격 변형 및 합성 세포에서의 세포 분열과 같은 다른 세포 과정의 통합은 최근33,,34,,35,,36으로기술되고 있다. 진핵 세포 용해물로 세균 용해물의 치환은 더 높은 복잡성 및 번역 후 변형을 가진 단백질의 발현을 허용할 것이고, 아마도 세정 절차 없이도 면역원성이 적을 것이고, 따라서 더 많은 치료 국경을열어주는 37.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 ERC-STG-2015-680242에 의해 지원되었다.
저자는 또한 테크니온 통합 암 센터 (TICC)의 지원을 인정; 러셀 베리 나노 기술 연구소; 로리 I. 로키 생명 과학 및 공학 학제 센터; 카민 그랜트에 대한 이스라엘 경제부 (52752); 이스라엘 과학기술우주부 – 수석과학자실 (3-11878); 이스라엘 과학 재단 (1778/13, 1421/17); 이스라엘 암 협회 (2015-0116); GIF 젊은 교부금을위한 과학 연구 개발을위한 독일 - 이스라엘 재단 (I-2328-1139.10/2012); 경력 통합 교부금에 대한 유럽 연합 FP-7 IRG 프로그램 (908049); 인지질 연구 센터 그랜트; 암 연구를위한 로젠 블라트 재단, 말라트 가족 재단 보조금; 그리고 Unger 가족 재단. A. 슈뢰더는 알론과 타우브 펠로우십을 인정한다. O. 아디르는 셔먼과 구트위르트의 펠로우십을 인정한다. G. 첸은 셔먼 펠로우십을 인정한다. N. 크린스키는 로스차일드 제왕절개 재단의 바론스 아리안 드 로스차일드 여성 박사 과정에 대해 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
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