Summary
Denne protokollen beskriver metoden, materialer, utstyr og trinn for nedenfra og opp forberedelse av RNA og proteinproduserende syntetiske celler. Det indre akdige rommet i de syntetiske cellene inneholdt S30 bakteriell lysat innkapslet i en lipid bilayer (dvs. stabile liposomer), ved hjelp av en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode.
Abstract
Nedenfra og opp montering tilnærming for bygging av syntetiske celler er et effektivt verktøy for å isolere og undersøke cellulære prosesser i en celle etterligne miljø. Videre har utviklingen av cellefrie uttrykkssystemer vist evnen til å rekonstituere proteinproduksjon, transkripsjon og oversettelsesprosesser (DNA→ RNA→protein) på en kontrollert måte, og utnytte syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokoll for å forberede et cellefritt uttrykkssystem, inkludert produksjon av en potent bakteriell lysat og innkapsling av denne lysaten inne i kolesterolrike lipidbaserte, unilamellære vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), for å danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metodene for å forberede komponentene i de syntetiske cellene, inkludert produksjon av aktive bakterielle lysater, etterfulgt av en detaljert trinnvis forberedelse av syntetiske celler basert på en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode. Disse letter produksjonen av millioner av syntetiske celler på en enkel og rimelig måte med høy allsidighet for å produsere forskjellige typer proteiner. De oppnådde syntetiske cellene kan brukes til å undersøke protein/RNA-produksjon og aktivitet i et isolert miljø, i rettet evolusjon, og også som en kontrollert legemiddelleveringsplattform for behovsbetinget produksjon av terapeutiske proteiner inne i kroppen.
Introduction
Syntetiske celler er kunstige cellelignende partikler, etterligner en eller flere funksjoner i en levende celle, for eksempel evnen til å dele, danne membraninteraksjoner og syntetisere proteiner basert på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler som omslutter cellefrie proteinsyntese (CFPS)-systemer har høy modularitet på grunn av deres evne til å produsere ulike proteiner og RNA-sekvenser etter endringer i DNA-malen. Ved å presentere et attraktivt alternativ til de nåværende tilnærmingene til proteinproduksjon, er CFPS-systemer basert på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og inkluderer alle transkripsjons- og oversettelsesmaskiner som kreves for proteinsyntese som ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-fosforlykemat og adenintriphosfat)4,5,6,7,8,9. Innkapslingen av et CFPS-system inne i lipidvesikler muliggjør enkel og effektiv produksjon av proteiner uten å være avhengig av en levende celle10. Videre tillater denne plattformen syntese av peptider som kan forringes inne i naturlige celler, produksjon av proteiner som er giftige for levende celler, og endre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler har blitt brukt som en modell for forskningsformål som undersøker de minimale cellekomponentene som kreves for å muliggjøre cellulær liv fra et evolusjonært perspektiv1,13. Syntetiske celler har også blitt brukt til å bygge og implementere genetisk krets og som modeller for rettet evolusjon14,15,16. Andre studier har fokusert på evnen til syntetiske celler for å etterligne den biologiske aktiviteten til naturlige celler, med sikte på å erstatte skadede naturlige celler, for eksempel betaceller hos pasienter med diabetes17. Videre illustrerer evnen til disse CFPS-innkapslingssyntetiske cellene til å produsere en rekke terapeutiske proteiner sitt potensial til å bli innlemmet i klinisk bruk18.
Her beskriver vi en bunn-opp lab-skala protokoll (Figur 1) for produksjon av RNA og proteinproduserende syntetiske celler basert på et CFPS-system innkapslet i en lipid vesikkel. Dette viser den potensielle bruken av syntetiske celleplattformer som nye legemiddelleveringssystemer for produksjon av et terapeutisk proteinstoff in vivo19. Tidligere studier har undersøkt optimalisering av CFPS-reaksjonen og cellelysate forberedelsesprosessene4,8,20. Videre har flere teknikker blitt brukt for cellestørrelse liposom forberedelse, for eksempel mikrofluidiske og polymer-baserte dråpestabiliseringsmetoder21,22,23, som også varierer i liposomenes lipidsammensetning24,25,26. I den presenterte protokollen produseres syntetiske celler ved hjelp av en overføringsmetode for vann-i-olje-emulsjon, og innkapslingsprosessen utføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Disse milde forholdene har vist seg å være gunstige for å beholde den biofunksjonelle integriteten til molekylærmaskineriet, nemlig ribosomer og proteiner27,,29,30. Lipidsammensetningen av partiklene består av både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den første finnes i alle pattedyrcellemembraner og er avgjørende for stabilitet, stivhet og permeabilitetsreduksjon av membranen, og sistnevnte etterligner pattedyrfolipidsammensetning11,13. Den cellulære transkripsjonen og oversettelsesmolekylære maskineriet ekstraheres fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som er forvandlet med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase for å øke CFPS potens og proteinsyntese. Dette systemet har blitt brukt til å produsere diagnostiske og terapeutiske proteiner, med molekylvekter på opptil 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokoll gir en enkel og effektiv metode for produksjon av det syntetiske cellesystemet, som kan løse et bredt spekter av grunnleggende spørsmål knyttet til proteinsyntese i naturen og kan også brukes til narkotikaleveringsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Illustrasjon av de komplette syntetiske cellenes produksjonsprotokoll er presentert i figur 1. I henhold til brukerens behov kan proteinuttrykket (avsnitt 3.2) og syntetiskcelledannelse (avsnitt 4) deler av protokollen også utføres uavhengig (med noen tilpasninger).
1. Utarbeidelse av S30-T7 lysate
- Strekplate E. coli BL21(DE3) bakterier forvandlet med T7 RNA polymerase uttrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plate supplert med 50 μg / ml ampicillin for å oppnå enkeltkolonier.
- Forbered en startløsning: Inokuler en enkelt koloni i 5 ml LB-medier supplert med 50 μg/ml ampicillin i en 100 ml Erlenmeyer kolbe og vokse over natten ved hjelp av en gulvinkubator shaker ved 250 rpm og 37 °C. Klargjør duplikater.
- Inokuler hver 5 ml starter separat i 500 ml TB media supplert med 50 μg / ml ampicillin i en 2 L Erlenmeyer kolbe med baffles og vokse den ved hjelp av en gulvinkubator shaker på 250 rpm og 37 ° C til den når OD600 av 0,8-1. Overvåk regelmessig ved hjelp av et spektrotometer.
- Tilsett 2-3 ml 100 mM lager av IPTG (for å nå 0,4 - 0,6 mM) for induksjon av T7 RNA polymerase uttrykk og fortsette å vokse kulturen til den når OD600‰4.
- Overfør oppløsningen fra hver Erlenmeyer kolbe i to 250 ml steriliserte sentrifugerør.
- Sentrifuge hver på 7000 x g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
MERK: På dette stadiet kan bakteriepellet lagres ved -20 °C i noen dager før den går videre til de neste trinnene. - Re-suspendere hver pellet i 250 ml kulde (4 °C) S30 lysate buffer og sentrifuge ved 7000 x g i 10 min ved 4 °C.
MERK: S30 lysatbufferen brukes til å opprettholde proteinstabilitet etter at cellelysis utføres ved hjelp av homogenisatoren i trinn 1.9. Fra dette trinnet fremover skal alle trinn til 1,12 utføres fortløpende og raskt.
MERK: Før du går videre til neste trinn, forhåndskjøl tipsene og 1,5 milliliter hetteglass som vil være nødvendig for lagring av lysat - Kast supernatanten og re-suspendere alle pellets sammen i 15 ml kald S30 lysate buffer. Filtrer fjæringen ved hjelp av gasbindpute.
MERK: 15 ml oppløsning skyldes homogenisator min. volum. Bør legges merke til at bakteriekonsentrasjon også er viktig. - Homogenisere ved et arbeidstrykk på 15.000 psi, med et lufttrykk på 4 bar (to passeringer) for cellebrudd. Unngå løsningsfortynning for en mer konsentrert og aktiv lysat.
- Tilsett 100 μL av 0,1 M DTT (FORSIKTIG) per 10 ml av homogenisert suspensjon.
- Sentrifugersuspensjonen ved 24 700 x g i 30 min ved 4 °C.
- Utfør følgende trinn raskt for å bevare lysataktiviteten: Del supernatanten en etter en i 200 μL aliquots i forhåndskjølte 1,5 ml hetteglass og umiddelbart snap fryse dem med flytende nitrogen. Oppbevares ved -80 °C for videre bruk.
FORSIKTIG: DTT er klassifisert som irriterende og skadelig og bør derfor behandles med forsiktighet.
2. Utarbeidelse av lipider i oljeoppløsning
- Oppløs POPC og kolesterol i kloroform (FORSIKTIG) separat, hver til en endelig konsentrasjon på 100 mg/ ml. Vortex hvert hetteglass separat.
- Kombiner komponentene i et 2ml hetteglass: Tilsett 50 μL POPC i kloroform, 50 μL kolesterol i kloroform og 500 μL mineralolje. For 100 μL syntetiske celler er det nødvendig med 2 hetteglass med lipider i olje.
- Vortex, og deretter varme i ca 1 t ved 80 °C i en kjemisk hette for å fordampe kloroformen. Sørg for at fullstendig fordampning har oppstått ved å følge angitttid/betingelser og overvåke løsningsvolumet.
MERK: Den resulterende lipid-i-olje-løsningen kan lagres ved romtemperatur i opptil to uker. For forbedrede resultater anbefales det å bruke et nytt preparat før hvert eksperiment. Lipid- og kolesterolforhold kan endres i henhold til ønsket membransammensetning. En høy konsentrasjon av kolesterol kan føre til dannelse av aggregater i den endelige syntetiske celleløsningen.
FORSIKTIG: Kloroform er klassifisert som irriterende og skadelig og bør derfor behandles med forsiktighet og i områder med røykekstraksjon.
3. Preparater av ytre, pre-indre og fôringsløsninger
- Utarbeidelse av lagerløsninger
- Forbered lagerløsningene som er oppført i tabell 2 ved hjelp av ultrarent vann (UPW).
MERK: Lagerløsninger skal fremstilles på forhånd og oppbevares ved -20 °C inntil videre bruk. Reagens 7 har en tendens til å danne aggregater. Oppvarming til 37 °C vil redusere aggregeringen. Liten aggregering vil ikke påvirke reaksjonen betydelig. Reagens 8-oppløsning er melkeaktig og uklar.
- Forbered lagerløsningene som er oppført i tabell 2 ved hjelp av ultrarent vann (UPW).
- Ytre løsning
- Oppløs glukose i DNase/RNase-fri H2O til en endelig konsentrasjon på 200 mM.
- For 100 μL indre oppløsning, klargjør 1,6 ml ytre oppløsning.
- Pre-indre løsning
- Legg til reagenser 1-14 i henhold til beløpene og konsentrasjonen som er oppført i tabell 2. For eksempel, for et endelig syntetisk cellevolum på 100 μL, klargjør 100 μL indre oppløsning.
MERK: UPW skal legges til for å fullføre det endelige nødvendige volumet. På dette stadiet kan blandingen lagres ved 4 °C i noen timer.
- Legg til reagenser 1-14 i henhold til beløpene og konsentrasjonen som er oppført i tabell 2. For eksempel, for et endelig syntetisk cellevolum på 100 μL, klargjør 100 μL indre oppløsning.
- Fôringsløsning
- Legg til alle reagensene i henhold til beløpene og konsentrasjonen som er oppført i tabell 3.
MERK: Bruk 1:1-forhold med fôringsoppløsning:indre oppløsning. For et endelig syntetisk cellevolum på 100 μL, klargjør 100 μL fôringsoppløsning. Det anbefales å forberede et lite overflødig volum av ytre, indre og fôringsløsning.
- Legg til alle reagensene i henhold til beløpene og konsentrasjonen som er oppført i tabell 3.
4. Utarbeidelse av syntetiske celler
MERK: Følgende volumer justeres for fremstilling av 100 μL syntetiske celler.
- Syntetiske celler som produserer protein
- I et 15 ml rør plasserer du 12 ml av den ytre oppløsningen og tilsett sakte et lag på toppen av et lag på 500 μL lipider i oljeoppløsning. Inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- For å fullføre det indre løsningspreparatet: bland de indre løsningsingrediensene på knust is til et endelig volum på 100 μL ved å tine og tilsette S30-T7 Lysat (reagens 15) og DNA plasmid (reagens 16) til den lagrede blandingen.
- Til det andre 2 ml hetteglasset med hetteglass med 500 μL lipider i oljeoppløsning, tilsett 100 μL av den indre oppløsningen. Pipette opp og ned kraftig i 1 minutt og vortex for et minutt på nivå fem.
- Inkuber i 10 min på knust is og tilsett langsomt den resulterende emulsjonen på toppen av oljefasen i 15 ml røret (fra 4,1,1).
- Sentrifuge i 10 min ved 100 x g og 4 °C og deretter sentrifuge i 10 min ved 400 x g og 4 °C. Ved slutten av sentrifugeringen bør en pellet nederst på røret observeres.
MERK: Bruk av en svingende bøtte sentrifuge rotor foretrekkes her for å skaffe en bedre dekning av et andre lag av lipider under vann-i-olje dråper passasje gjennom interfasen. I tilfelle det ikke er noen observerbar pellet, kan sentrifugeringshastigheten økes til 1000 x g. Ellers kan du se Diskusjon-delen som refererer til den spesifikke tyngdekraften til den ytre løsningen. - Trekk ut pelleten.
- Fjern overflødig oljelag.
- Bruk en trimmet pipettespiss lastet med ca. 400 μL ytre oppløsning for å trekke ut pelleten. Slipp den ytre løsningen mens du passerer gjennom oljefasen for å samle bare pelleten i vandig fase.
- Tørk av spissen etter ekstraksjonen av pelleten for å unngå overføring av oljerester og overfør pelleten til et rent 1,5 ml rør.
- Sentrifuge i 10 min ved 1000 x g og 4 °C, fjern supernatanten og re-suspendere pelleten i 100 μL fôringsoppløsning (1:1 ratio av indre:fôringsløsninger).
MERK: En fast vinkelsentrifugerotor kan også brukes her. - For proteinuttrykk, inkuber i 2 timer ved 37 °C uten risting.
MERK: Optimal inkubasjonstid varierer mellom forskjellige proteiner. - Evaluer den produserte proteinmengden ved hjelp av en passende metode i henhold til målproteinegenskapene.
- Anbefalte kontrollgrupper
- Indre løsning og lysate aktivitetsbekreftelse
- Forbered en komplett indre løsning (med DNA og S30-T7 lysat).
- Inkuber reaksjonen ovenfor ved hjelp av en gulvinkubator shaker ved 250 o/min eller en termomikser ved 1200 o/min, ved en konstant temperatur på 37 °C i 2 timer.
MERK: Juster inkubasjonstiden slik at den passer til den syntetiske celleinkubasjonstiden.
- Syntetiske celler
- Negativ kontrollgruppe: Klargjør protokollen presentert i 4.1 med indre løsning uten DNA.
- Positiv kontroll: Forbered protokollen presentert i 4.1 med indre løsning som inneholder en T7 plasmid koding for et reportergen.
MERK: Legg til en positiv kontrollgruppe bestående av et reportergen, for eksempel sfGFP, sammen med testgruppene for å sikre innkapslingseffektivitetstrinnet.
- Indre løsning og lysate aktivitetsbekreftelse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en protokoll for fremstilling av syntetiske celler ved å innkapsle et S30-T7 CFPS-system basert på BL21 E. coli inne i lipidvesikler. En skjematisk beskrivelse av forberedelsesprosessen som inneholder et bilde av hvert trinn, presenteres i figur 2. Suksessen til den syntetiske celleklargjøringsprosessen er avhengig av riktig ytelse for hvert trinn og påvirket av forskjellige parametere. Protokollen bør justeres for å imøtekomme produksjonen av et bestemt protein.
Plasmids uttrykke modell protein super-mappen Green Fluorescent Protein (sfGFP) og Renilla Luciferase under T7 arrangøren ble introdusert i CFPS bulk reaksjoner og syntetiske celler, og proteinproduksjon ble evaluert ved hjelp av ulike metoder, inkludert vestlig blot, flow cytometri, mikroskopi og spektroskopi (Figur 3). En verifisering av sfGFP-Hans6 merket protein (~ 27 kDa32) produksjon av western blot analyse er presentert i figur 3A. En prøve på 30 μL syntetiske celler fortynnet 6 folder ble blandet med 10 μL av en vanlig SDS-PAGE prøvebuffer (som inneholder vaskemidler natrium dodecylsulfat (SDS) og β-mercaptoetanol) og kokt i 10 min (95 oC). Vi fant at kombinasjonen av varme og vaskemidler i prøvebufferen er tilstrekkelig til å demontere vesikler og for å muliggjøre kjøring av proteiner i SDS-PAGE gel. Proteindeteksjon ble utført ved hjelp av anti-Hans polyklonale primære antistoff (fortynnet 1:12,000). Som forventet, mens proteinproduksjon oppdages i prøver som inneholder DNA-maler for sfGFP-koding ("+sfGFP DNA"), observeres ikke noe protein i negative kontrollprøver der DNA-malen ble utelukket ("-DNA"). Prøver av renset sfGFP og renset sfGFP innkapslet i syntetiske cellermembran ('sfGFP (innkapslet)), brukes som positive kontroller for sfGFP CFPS bulkproduksjon og for syntesen i syntetiske celler, respectivley. Denne metoden kan brukes på forskjellige proteintyper. Ifølge Krinsky et al.19er sfGFP-produksjonsutbyttet oppnådd under den detaljerte protokollen 380 μg/ml i CFPS-løsning og 5,3 μg/ml, når CFPS-løsningen er innkapslet i lipidvesiklene.
Når proteinet som produseres inne i de syntetiske cellene er fluorescerende, kan produksjonen evalueres ved hjelp av mikroskopi og flyt cytometribaserte metoder. Vi analyserte de syntetiske cellene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med et filter for GFP-fluorescens (figur 3B). Siden CFPS-komponentene har noen autofluorescerende, bør bildeanskaffelsesparametrene tilpasses i henhold til en passende negativ kontrollprøve (syntetiske celler uten DNA-mal, for eksempel).
I tillegg brukte vi flow cytometri for å bestemme gjennomsnittlig fluorescensintensitet av sfGFP-produserende syntetiske celler, og prosentandelen av aktive syntetiske celler, som kan produsere proteiner i dem (Figur 3C I&II). 10 000 hendelser ble samlet inn for hver analysertprøve. Den syntetiske celleproduksjonen, som er beskrevet i denne protokollen, gir vanligvis en aktiv befolkning på 21-25% i en løsning med en omtrentlig konsentrasjon på 107 syntetiske celler / ml. Den lille fluorescensintensiteten som presenteres av "-DNA"-prøver i figur 3C II skyldes autofluorescens av forskjellige komponenter i CFPS-reaksjonen som S30 lysat.
Representativ størrelsesanalyse basert på GFP-signalet (i diameter) av syntetiske celler utarbeidet av metoden beskrevet ovenfor, viser en gjennomsnittlig verdi på 2,4±0,5 μm (figur 3D II). Som dannelsen av vann i olje emulsjon i denne metoden er et resultat av å bruke mekaniske krefter, kan størrelsen fordelingen av partiklene påvirkes av ulike faktorer, for eksempel metoden og hastigheten på pipettering av emulsjonen opp og ned, modellen av vortexmiksermaskinen, etc.
For å teste allsidigheten til syntetiske cellers proteinproduksjon ble uttrykket av reporterproteinet Renilla luciferase inne i syntetiske celler analysert (Figur 3E). Analysen kvantifiserte Renilla luciferase aktivitet ved å måle luminescensgenerert fra enzymatisk reaksjon av luciferase og dets substrat, h-coelenterazine. For å indusere den enzymatiske reaksjonen ble en endelig konsentrasjon på 1 μM h-koelenterazin tilsatt de syntetiske cellene (25 μL prøvevolum) like før målingen. "-DNA" prøve, som ikke inneholder luciferase-koding DNA-malen ble brukt som en negativ kontroll for testing av luminescens på grunn av ikke-enzymatisk oksidasjon av substratet. Luminescens ble målt ved hjelp av en plateleser.
Figur 1: En illustrasjon av prosessen for typiske syntetiske celler forberedelse protokoll. Prosessen er delt inn i to trinn. Trinn 1: Pre-eksperiment preparater inkludert DNA plasmid rensing, S30-T7 lysate forberedelse, lagerløsninger forberedelse som kreves for indre og fôring løsninger, lipider-i-olje løsning forberedelse og ytre løsning forberedelse. Trinn 2: Syntetisk celledannelse som inkluderer fôring og indre løsninger forberedelse, syntetiske celler forberedelse og analyse. Et eksempel på det nødvendige volumet av hver ingrediens for å forberede 100 μL syntetiske celler løsning presenteres i blått i parentes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av den syntetiske celleklargjøringsprotokollen. Et bilde av en godt utført prosess illustrerer hvert trinn i protokollen. Dette tallet er endret fra Krinsky et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av produksjonen av sfGFP og Renilla luciferase inne i syntetiske celler. (A) En vestlig blot analyse av sfGFP-His6 produksjon i både CFPS bulk reaksjoner og inne syntetiske celler. Proteindeteksjon ble utført ved hjelp av anti-Hans polyklonale primære antistoff (fortynnet 1:12,000). Renset sfGFP-His6 ble brukt som en positiv kontroll (7,8 μg). sfGFP (innkapslet) er positiv kontroll av renset sfGFP innkapslet i syntetiske celler. Prøver uten DNA-maler ble brukt som en negativ kontroll for produksjonsanalysen ("-DNA"). (B) Representative bilder av sfGFP som produserer syntetiske celler tatt ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med et lyst felt og et GFP-filter. Skala barer = 50 μm. (C) I & II Flow cytometri analyse av sfGFP produsere syntetiske celler aktivitet (Data samlet ved hjelp av digital, 4-laser analysator). Prøvene ble målt etter 3 timer inkubasjon. 10 000 hendelser ble samlet inn for hver analysertprøve. FSC-filtrene (500 V) og SSC (300 V) ble brukt til å definere den totale syntetiske cellepopulasjonen. Deretter ble et FITC -filter (600 V) brukt til å oppdage GFP-fluorescens.. (I) Beregning av den aktive syntetiske cellepopulasjonen [%] var basert på GFP fluorescensintensitetsterskel, definert av "-DNA"-prøven (rødt histogrammet), slik at en feil på ~ 1%. (II) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet for sfGFP som produserer syntetiske celler. Denne verdien ble beregnet fra den aktive syntetiske cellepopulasjonen og normalisert til "-DNA"-prøven ved å dele gjennomsnittlig fluorescens av de aktive syntetiske cellene ved gjennomsnittet av syntetiske celler uten sfGFP-DNA. (D) I&II Syntetisk cellestørrelsesanalyse. Utslippsspekteret ble påvist av henholdsvis 505-560 nm og 642-745 nm for GFP- og lyse feltsignaler. (I) Et representativt bilde av de analyserte syntetiske cellene. (II) Syntetiske cellers størrelsesfordeling. Analysen ble utført og diameterfordelingene til de aktive syntetiske cellene ble beregnet basert på GFP-signalet. (E) Produksjon av aktive Renilla luciferase inne syntetiske celler. Luciferase aktivitet ble kvantifisert med luminescens målinger etter tillegg av 1 μM h-coelenterazine ved hjelp av en plateleser og presentert som lysintensitet [RLU] x 106. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tabell 1: Forberedelse av buffer- og lagerløsninger. | |
| Kommentarer | |
| Luria Bertani (LB) agar (1,5 %) plate: | Forbered og steriliser. Tilsett Ampicillin ved en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml bare etter avkjøling til romtemperatur. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumklorid (NaCl) | |
| 5 g/ L Bacto-Gjær ekstrakt | |
| 15 g/L Agar agar renset | |
| 50 μg/ml ampicillin | |
| LB media (20 ml): | Minimale medier. Forbered og steriliser på forhånd. Like før du inokulerer bakteriene, tilsett Ampicillin ved en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumklorid (NaCl) | |
| 5 g/ L Bacto-Gjær ekstrakt | |
| 50 μg/ml ampicillin | |
| Terrific Kjøttkraft (TB) media (1 L): | Rike medier. Forbered og steriliser på forhånd. Like før du inokulerer bakteriene, tilsett Ampicillin ved en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| 24 g/ L Bacto-Gjær ekstrakt | |
| 4 % (v/v) Glyserol vannfri | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/ml ampicillin | |
| S30 lysatbuffer (1,5 l): | Forbered og steriliser på forhånd (*unntatt DTT og 2-merkaptoetanol). Oppbevares ved -4 °C. |
| 10 mM Tris-acetat ved pH = 7,4 | Trisma-base. Forbered og juster pH til 7,4 ved hjelp av eddiksyre. |
| 14 mM magnesiumacetat | |
| 60 mM kaliumacetat | |
| * 1 mM DTT | Legg til like før bruk |
| *0,5 ml/L 2-merkaptoetanol | Legg til like før bruk |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | Oppløs HEPES til en endelig konsentrasjon på 1 M. Juster til pH 8 ved hjelp av KOH-oppløsning. |
| HEPES (ANDRE) | |
| Kaliumhydroksid (KOH) | |
| Tabell 2: Indre løsningssammensetning. | ||||||||||
| Endelig forespurt innerløsningsvolum | ||||||||||
| Nummer | Reagens | Lager conc. | Endelig conc. | 25 μL (25 μL) | 50 μL (50 μL) | 100 μL | 200 μL (200 μL) | 300 μL (300 μL) | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M (andre kan være på denne | 55 mM (andre kan være på siden) | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Pre-Indre løsning |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M (andre kan være på denne | 14 mM (andre kan være på siden) | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M (andre kan være på denne | 50 mM (andre kan være på siden) | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ammoniumacetat | 5.2 M (andre kan være på samme siden) | 155 mM (andre kan være på siden) | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | Pinne 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA (andre- og 19- 1 | 0,5 M (andre kan være på samme siden) | 40 mM (andre kan være på siden) | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminosyrer - blanding I | 50 M (andre kan være på siden) | 2,5 mM (andre kan være på samme tid) | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminosyrer - blanding II | 50 M (andre kan være på siden) | 2,5 mM (andre kan være på samme tid) | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM (andre kan være på siden) | 1,2 mM (andre kan være på samme siden) | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM (andre kan være på siden) | 1 mM (andre kan være på siden) | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM (andre kan være på siden) | 0,8 mM (andre kan være på samme siden) | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG (andre er id) | 100 mM (andre kan være på siden) | 1 mM (andre kan være på siden) | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sukrose | 2 M (andre kan være på den | 200 mM (andre kan være på siden) | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA plasmid | 10 μg/ml | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabell 3: Sammensetning av fôringløsning. | |||||||||
| Endelig ønsket fôringsløsningsvolum | |||||||||
| Nummer | Reagens | lager conc. | siste conc. | 25 μL (25 μL) | 50 μL (50 μL) | 100 μL | 200 μL (200 μL) | 300 μL (300 μL) | 400 μL (400 μL) |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M (andre kan være på denne | 83,3 mM (andre kan være på den 4.3 mm) | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M (andre kan være på denne | 21,2 mM (andre kan være på den 21.2 m. mm | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M (andre kan være på denne | 75,5 mM (andre kan være på samme siden) | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ammoniumacetat | 5.2 M (andre kan være på samme siden) | 236,4 mM (236,4 mM) | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PINNE - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA (andre- og 19- 1 | 0,5 M (andre kan være på samme siden) | 60,1 mM (andre kan være på denne siden) | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminosyrer - blanding I | 50 mM (andre kan være på siden) | 3,8 mM (andre kan være på samme tid som) | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminosyrer - blanding II | 50 mM (andre kan være på siden) | 3,8 mM (andre kan være på samme tid som) | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM (andre kan være på siden) | 1,8 mM (andre kan være på samme siden) | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM (andre kan være på siden) | 1,5 mM (andre kan være på samme siden) | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM (andre kan være på siden) | 1,2 mM (andre kan være på samme siden) | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG (andre er id) | 100 mM (andre kan være på siden) | 1,5 mM (andre kan være på samme siden) | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glukose | 2 M (andre kan være på den | 200 mM (andre kan være på siden) | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabell 4: Nødvendige løsninger for syntetiske celler forberedelse. | |
| Løsning og materialer kreves | Kommentarer |
| Lipider i olje | Oppbevares ved romtemperatur til bruk. Utarbeidet i henhold til avsnitt 2 |
| Ytre løsning | Utarbeidet i henhold til pkt. 3.1 |
| Indre løsning | Utarbeidet i henhold til pkt. 3.2. |
| Klargjør tester + kontrollerprøver i henhold til pkt. 4.1. | |
| Hold på knust is til bruk. | |
| Fôringsløsning | Utarbeidet i henhold til pkt. 3.3. |
| Hold på knust is til bruk. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen introduserer en enkel og rimelig metode for produksjon av store mengder proteinproduserende syntetiske celler. Avkastningen av aktive celler er avhengig av forsiktig og nøyaktig gjennomføring av protokollen med vekt på flere kritiske trinn. I lysate forberedelsedelen av denne metoden er det viktig å nå riktig bakterietetthet før cellelysis for å oppnå en tilstrekkelig mengde proteiner i bakterielysatet. For det andre bør lysisprosessen utføres ved 4 °C og lysatet frosset raskt med flytende nitrogen for å opprettholde proteinaktivitet. Videre, i denne protokollen brukte vi E. coli BL21 (DE3) celler forvandlet med pAR1219 plasmid uttrykke T7 RNA polymerase. I tilfeller der en annen bakteriestamme brukes, kan det være nødvendig med endringer i lysatkonsentrasjonen for å nå en tilfredsstillende mengde RNA-polymerase og ribosomer. Selv når den samme bakterielle stammen brukes, kan forskjellige lysateproduksjoner ha noen batch-til-batch variabilitet.
Vesikkelproduksjonsdelen inneholder også et par viktige trinn. Løselighet av lipider og fjerning av kloroformen fra mineraloljen er viktig for å etablere vann-i-olje emulsjon. Sentrifugeringen av vann-i-olje-dråpene i den ytre vandigbufferen er også et viktig skritt i protokollen for å generere syntetiske celler med en lipidbilayer. Endringer i den indre løsningen av vesiklene og lipidsammensetningen kan føre til et lag med dråper i oljevannsinterfasen uten observerbar pellet. For å overvinne dette, er en rask løsning å øke sentrifugeringshastigheten til 1000 x g i emulsjonsoverføringstrinnet. I tilfelle dette ikke løser problemet, kan den spesifikke tyngdekraften til den ytre vandige løsningen endres slik at den indre løsningen vil ha en høyere egenvekt enn den ytre løsningen. Videre kan osmolaliteten til den indre løsningen også variere mellom ulike lysatkilder og produksjoner, alt mellom 800-1100 mOsm/kg. Variabilitet i den indre løsningens osmolalitet skyldes for det meste endrede konsentrasjoner av lysat under produksjonsprosessen. Vanligvis fører dette ikke til betydelige endringer i proteinproduksjon, men en stor fortynning kan føre til redusert utbytte på grunn av lave konsentrasjoner av transkripsjon og oversettelseenzymer i lysatet selv. Måling av den totale proteinkonsentrasjonen i hver lysatbatch kan bidra til å justere lysatkonsentrasjoner i den indre oppløsningen for å opprettholde konstante verdier (ca. 22 mg/ml målt ved Bradford-analyse).
Likevel har denne metoden noen begrensninger som bør nevnes. Ikke alle de genererte syntetiske cellene er aktive og i stand til å produsere proteiner på grunn av ufullstendig innkapsling av alle nødvendige komponenter. Vi målte ca. 21-25 % av aktive celler ved produksjon av sfGFP som uttrykte syntetiske celler ved hjelp av flow cytometri (ingen signifikante størrelsesforskjeller ble observert mellom aktive og inaktive celler). Olje og lipid overflødigrester forblir av og til i bilayer lipidmembranen etter overføring av syntetiske celler inn i vandig fase. Optimalisering av lipid- og kolesterolkonsentrasjonene i oljefasen kan forbedre dette problemet. Det er også viktig å merke seg at størrelsesfordelingen av de oppnådde syntetiske cellene er ganske bred i forhold til alternative mikrofluidiske metoder, med vesikler fra ca. 1-50 μm.
Den høye utbyttet av emulsjonoverføringsmetoden gjør den spesielt egnet for syntetiske celler som innkapsler cellefrie proteinsyntesesystemer for terapeutisk proteinproduksjon. Ulike variasjoner av emulsjonsoverføringsmetoden er brukt i syntetiske cellestudier og inkluderte endringer i oljeklargjøringsprosedyren, membransammensetning, prøvevolum, indre løsning til oljeforhold og sentrifugeringshastigheter5,,24,28. Mikrofluidiske og polymerbaserte dråpestabiliseringsmetoder har også blitt brukt til syntetisk celletilberedning, men innkapsling av hele CFPS-systemet er ikke utført ennå med disse metodene21,,22,23.
De syntetiske cellene oppnådd ved denne metoden ble vist in vivo å produsere proteiner og behandle kreft i murine modeller19. Egenskapene til disse cellene kan utvides ytterligere i fremtiden utover proteinuttrykk. Integrering av andre cellulære prosesser som cellulær kommunikasjon, cytoskeleton modifikasjon og celledeling i syntetiske celler har nylig blitt beskrevet33,34,35,36. Substitusjon av bakteriell lysat med eukaryotisk celle lysat vil tillate uttrykk for proteiner med høyere kompleksitet og post-translasjonelle modifikasjoner, og vil kanskje være mindre immungen selv uten en rengjøringsprosedyre, og derfor åpne mer terapeutiske grenser37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkjenner også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Det tverrfaglige senter for biovitenskap og ingeniørsenter og Israels finansdepartement for et Kamin Grant (52752); Israel Ministry of Science Technology and Space - Office of the Chief Scientist (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske stiftelsen for vitenskapelig forskning og utvikling for en GIF Young stipend (I-2328-1139.10/2012); Den europeiske unions FP-7 IRG-program for en karriereintegrasjonsbevilgning (908049); Fosfolipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for kreftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkjenner Alon og Taub Fellowships. O. Adir anerkjenner Sherman og Gutwirth fellesskap. G. Chen anerkjenner Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkjenner Baronesse Ariane de Rothschild Women Doctoral Program fra Rothschild Caesarea Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
