Summary
Этот протокол описывает метод, материалы, оборудование и шаги для подготовки РНК и белка, производящих синтетические клетки. Внутренний водный отсек синтетических клеток содержал бактериальный лизат S30, инкапсулированный в липидный двухслойный (т.е. стабильные липосомы), используя метод переноса эмульсии воды в масле.
Abstract
Подход снизу вверх для сборки синтетических клеток является эффективным инструментом для изоляции и исследования клеточных процессов в клеточной среде. Кроме того, развитие систем самовыражения без клеток продемонстрировало способность к восстановлению производства белков, транскрипции и процессов перевода (ДНК-РНК-белок) контролируемым образом, используя синтетическую биологию. Здесь мы описываем протокол для подготовки системы свободного выражения клеток, в том числе производство мощного бактериального лизата и инкапсуляции этого лизата внутри богатых холестерином липидов на основе гигантских пузырьков (GUV) (т.е. стабильные липосомы), чтобы сформировать синтетические клетки. Протокол описывает методы подготовки компонентов синтетических клеток, включая производство активных бактериальных лизатов, с последующим детальным поэтапным препаратом синтетических клеток на основе метода переноса эмульсии воды в масле. Они облегчают производство миллионов синтетических клеток в простой и доступной манере с высокой универсальностью для производства различных типов белков. Полученные синтетические клетки могут быть использованы для исследования производства белка/РНК и деятельности в изолированной среде, в направленной эволюции, а также в качестве контролируемой платформы доставки лекарств для производства терапевтических белков внутри организма по требованию.
Introduction
Синтетические клетки являются искусственными клетками, как частицы, имитирующие одну или несколько функций живой клетки, такие как способность делиться, формировать мембранные взаимодействия, и синтезировать белки на основе генетического кода1,2,3. Синтетические клетки, которые прилагают системы синтеза белка без клеток (CFPS), обладают высокой модульностью из-за их способности производить различные белки и рнковые последовательности после изменений в шаблоне ДНК. Представляя привлекательную альтернативу современным подходам к производству белка, системы CFPS основаны на клеточном лицезе, очищенных компонентах или синтетических компонентах и включают в себя все транскрипции и переводческих механизмов, необходимых для синтеза белка, таких как рибосомы, РНК-полимераза, аминокислоты и источники энергии (например, 3-фосфогцерат7,8,9и аденина трифосфат)4,5,69 , 9 , 9 , 9,9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , Инкапсуляция системы CFPS внутри липидных пузырьков позволяет просто и эффективно производить белки без зависимости от живой клетки10. Кроме того, эта платформа позволяет синтез пептидов, которые могут деградировать внутри естественных клеток, производство белков, которые являются токсичными для живых клеток, и модифицировать белки с неестественными аминокислотами11,12. Синтетические клетки были использованы в качестве модели для исследовательских целей исследования минимальных компонентов клеток, необходимых для обеспечения клеточной жизни с эволюционной точки зрения1,13. Синтетические клетки также были использованы для создания и реализации генетической цепи и в качестве моделей для направленной эволюции14,15,16. Другие исследования были сосредоточены на способности синтетических клеток имитировать биологическую активность естественных клеток, с целью заменить поврежденные естественные клетки, такие как бета-клетки у пациентов с диабетом17. Кроме того, способность этих CFPS инкапсулировать синтетические клетки для производства различных терапевтических белков иллюстрирует его потенциал, чтобы быть включены в клиническое использование18.
Здесь мы описываем протокол лабораторного масштаба снизу вверх(рисунок 1)для производства РНК и белково-производящих синтетических клеток на основе системы CFPS, инкапсулированной в липидной везикуле. Это показывает потенциальное использование синтетических клеточных платформ в качестве новых систем доставки лекарств для производства терапевтического белка препарата in vivo19. Предыдущие исследования исследовали оптимизацию реакции CFPS и процессы подготовки лизата клетки4,,8,,20. Кроме того, некоторые методы были применены для клеточного размера липосомы подготовки, таких как микрофлюидные и полимерной основе капель стабилизации методы21,22,23, которые также отличаются в липидном составе липосомы липосом24,25,26. В представленном протоколе синтетические клетки производятся с использованием метода переноса эмульсии воды в масле, а инкапсуляция осуществляется при низких температурах (Злт; 4 КС)5,,10,,24,,27,28. Эти мягкие условия были признаны благоприятными для сохранения биофункциональной целостности молекулярного механизма, а именно рибосом и белков27,,29,30. Липидный состав частиц состоит как из холестерина, так и из 1-пальмитоила-2-олеойл-сн-глицеро-3-фосфохолина (ПОПК). Первый находится во всех мембранах клеток млекопитающих и имеет важное значение для стабильности, жесткости и проницаемости сокращения мембраны, а последний имитирует млекопитающего фосфолипидного состава11,13. Клеточная транскрипция и перевод молекулярного механизма извлекаются из штамма BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), который преобразуется с pAR1219 плазмид, переэкспрессирующий полимеразу T7 РНК для увеличения потенции CFPS и синтеза белка. Эта система была использована для производства диагностических и терапевтических белков, с молекулярными весами до 66 kDa in vitro и in vivo19,31. Следующий протокол обеспечивает простой и эффективный метод для производства синтетической клеточной системы, который может решить широкий спектр фундаментальных вопросов, связанных с синтезом белка в природе, а также может быть использован для применения наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстрация полного протокола производства синтетических клеток представлена на рисунке 1. В соответствии с потребностями пользователя, выражение белка (раздел 3.2) и синтетическое образование клеток (раздел 4) части протокола также могут осуществляться независимо (с некоторыми адаптациями).
1. Подготовка lysate S30-T7
- Полоса пластины E. coli BL21 (DE3) бактерии преобразованы с T7 РНК полимеразы, выражающие pAR1219 плазмид на пластине LB-агар дополнен 50 мкг /мЛ ампициллин для получения отдельных колоний.
- Подготовьте стартовое решение: привить одну колонию в 5 мл LB-медиа, дополненную 50 мкг/мл ампициллин в колбе Erlenmeyer 100 мл и расти на ночь с помощью напольного инкубатора шейкера при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию. Подготовка дубликатов.
- Прививать каждый 5 мл стартер отдельно в 500 мл ТБ СМИ дополняется 50 мкг /мл ампициллин в 2 L Erlenmeyer колбу с перегородками и выращивать его с помощью напольного инкубатора шейкер на 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию, пока не достигнет ОД600 0,8-1. Периодически отслеживайте с помощью спектрофотометра.
- Добавьте 2-3 мл 100 мМ запаса IPTG (для достижения 0,4 - 0,6 мм) для индукции экспрессии Полимеразы РНК T7 и продолжайте расти до тех пор, пока она не достигнет OD600х 4.
- Перенесите раствор с каждой колбы Эрленмейера в две стерилизованные центрифуги 250 мл.
- Центрифуга каждый на 7000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, бактериальные гранулы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующим шагам. - Повторно приостановить каждый гранулы в 250 мл холодного (4 кВ) S30 lysate буфера и центрифуги на 7000 х г в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: S30 lysate буфер используется для поддержания стабильности белка после того, как лиза клетки выполняется с помощью гомогенизатора в шаге 1.9. С этого шага вперед все шаги до 1.12 должны выполняться последовательно и быстро.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем перейти к следующему шагу, предварительно охладить советы и 1,5-миллилитровые флаконы, которые будут необходимы для хранения лизата - Откажитесь от супернатанта и повторно приостановите все гранулы вместе в 15 мл холодного s30 lysate буфера. Фильтр подвески с помощью марлевой площадки.
ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл раствора связано с гомогенизатором мин. объем. Следует отметить, что концентрация бактерий также имеет важное значение. - Гомогенизировать при рабочем давлении 15000 пси, с давлением воздуха 4 бара (два прохода) для поломки клеток. Избегайте разбавления раствора для более концентрированного и активного лизата.
- Добавьте 100 л 0,1 М ДТТ (ПРЕСТЕРЕ) на 10 мл гомогенизированной подвески.
- Centrifuge подвески на 24700 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
- Выполните следующий шаг быстро для сохранения активности лизата: разделить супернатант один за другим на 200 аликотов в предварительно охлажденных флаконах 1,5 мл и немедленно заморозить их жидким азотом. Хранить при -80 градусах по Цельсию для дальнейшего использования.
ВНИМАНИЕ: DTT классифицируется как раздражающий и вредный и поэтому следует относиться с осторожностью.
2. Подготовка липидов в масляном растворе
- Растворите ПОПК и холестерин в хлороформе (CAUTION) отдельно, каждый до конечной концентрации 100 мг/мл. Вихрь каждый флакон отдельно.
- Объедините компоненты в стеклянном флаконе 2 мл: добавьте 50 л ПОПК в хлороформ, 50 л холестерина в хлороформе и 500 л минерального масла. Для 100 л синтетических клеток, 2 флакона липидов в масле не требуется.
- Вихрь, а затем тепла около 1 ч при 80 градусов по Цельсию в химическом капоте, чтобы испарять хлороформ. Убедитесь, что полное испарение произошло, следуя указанному времени/условиям и контролируя объем раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: В результате липидов в масле раствор может храниться при комнатной температуре до двух недель. Для улучшения результатов рекомендуется использовать свежий препарат перед каждым экспериментом. Соотношения липидов и холестерина могут быть изменены в соответствии с желаемым составом мембраны. Высокая концентрация холестерина может привести к образованию агрегатов в окончательном растворе синтетических клеток.
ВНИМАНИЕ: Хлороформ классифицируется как раздражающий и вредный и поэтому следует лечить с осторожностью и в районах с выкопом дыма.
3. Препараты внешних, предвнутренних и кормовых растворов
- Подготовка биржевых решений
- Подготовьте фондовые решения, перечисленные в таблице 2, с использованием ультрачистой воды (UPW).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы должны быть подготовлены заранее и храниться при -20 градусов до дальнейшего использования. Реагент 7 имеет тенденцию к форме агрегатов. Отопление до 37 градусов по Цельсию снизит агрегацию. Небольшая агрегация не сильно повлияет на реакцию. Раствор реагента 8 молочный и мутный.
- Подготовьте фондовые решения, перечисленные в таблице 2, с использованием ультрачистой воды (UPW).
- Внешнее решение
- Растворите глюкозу в DNase/RNase-free H2O до конечной концентрации 200 мМ.
- Для 100 л внутреннего раствора подготовьте 1,6 мл внешнего раствора.
- Предварительное внутреннее решение
- Добавить реагенты 1-14 в зависимости от количества и концентрации, перечисленные в таблице 2. Например, для окончательного объема синтетических клеток в 100 л, подготовить 100 л внутреннего раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: UPW должны быть добавлены для завершения окончательного необходимого объема. На этом этапе смесь может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов.
- Добавить реагенты 1-14 в зависимости от количества и концентрации, перечисленные в таблице 2. Например, для окончательного объема синтетических клеток в 100 л, подготовить 100 л внутреннего раствора.
- Решение для кормления
- Добавьте все реагенты в зависимости от количества и концентрации, перечисленных в таблице 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1:1 соотношение кормления решение: внутреннее решение. Для окончательного синтеза синтетических клеток в 100 л, подготовить 100 л кормления раствора. Рекомендуется подготовить небольшой избыточный объем наружного, внутреннего и кормового раствора.
- Добавьте все реагенты в зависимости от количества и концентрации, перечисленных в таблице 3.
4. Подготовка синтетических клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие тома корректируются для подготовки 100 л синтетических клеток.
- Синтетические клетки, производящие белок
- В трубке 15 мл поместите 12 мл внешнего раствора и медленно добавьте сверху слой 500 л липидов в масляном растворе. Инкубировать при комнатной температуре 20 мин.
- Для завершения подготовки внутреннего раствора: смешайте ингредиенты внутреннего раствора на дробленом льду до конечного объема в 100 л путем оттаивания и добавления S30-T7 Lysate (реагент 15) и плазмида ДНК (реагент 16) в хранит смесь.
- Ко второму 2 мл стеклянного флакона с 500 л липидов в масляном растворе добавьте 100 л внутреннего раствора. Пипетка вверх и вниз энергично в течение 1 минуты и вихрь еще на минуту на пятом уровне.
- Инкубировать в течение 10 минут на дробленом льду и медленно добавлять полученную эмульсию в верхней части фазы масла в трубке 15 мл (от 4.1.1).
- Центрифуга в течение 10 мин при 100 х г и 4 кв с, а затем центрифуга в течение 10 мин при 400 х г и 4 кв. c. К концу центрифугации следует наблюдать гранулы в нижней части трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование размахивая ведро центрифуга ротор предпочтительнее здесь для приобретения лучшего покрытия второго слоя липидов во время воды в масле капель "проход через межфазы. В случае, если нет наблюдаемых гранул, скорость центрифугирования может быть увеличена до 1000 х г. В противном случае смотрите раздел Обсуждение, в который говорится о конкретной серьезности внешнего решения. - Извлеките гранулы.
- Удалите лишний слой масла.
- Используйте обрезанный наконечник пипетки, нагруженный примерно 400 злител внешнего раствора, чтобы извлечь гранулы. Отпустите внешний раствор при прохождении через фазу масла, чтобы собрать только гранулы в ваквоковой фазе.
- Протрите кончик после извлечения гранул, чтобы избежать переноса остатков масла и перенесите гранулы в чистую трубку площадью 1,5 мл.
- Центрифуга в течение 10 мин при 1000 х г и 4 градусах По Цельсию, удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в 100 кЛ раствора для кормления (1:1 соотношение внутренних: кормящих растворов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированный угол центрифуги ротор может быть использован здесь также. - Для экспрессии белка, инкубировать в течение 2 часов при 37 градусов без тряски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации варьируется между различными белками. - Оцените количество произведенного белка с помощью подходящего метода в соответствии с свойствами белка цели.
- Рекомендуемые контрольные группы
- Внутреннее решение и подтверждение активности lysate
- Подготовьте полное внутреннее решение (с помощью lysate ДНК и S30-T7).
- Немедленно инкубировать реакцию выше с помощью напольного инкубатора шейкер ажиотаж при 250 об/мин или термомиксер при 1200 об/мин, при постоянной температуре 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации, чтобы соответствовать времени инкубации синтетических клеток.
- Синтетические клетки
- Отрицательная контрольная группа: Подготовьте протокол, представленный в 4.1 с внутренним раствором без ДНК.
- Положительный контроль: Подготовьте протокол, представленный в 4.1 с внутренним раствором, содержащим плазмидt T7, кодируя для гена репортера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте положительную контрольную группу, состоящую из гена репортера, например sfGFP, наряду с испытательными группами, чтобы обеспечить эффективность инкапсуляции.
- Внутреннее решение и подтверждение активности lysate
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем протокол для подготовки синтетических клеток путем инкапсуляции системы S30-T7 CFPS на основе BL21 E. coli внутри липидных пузырьков. Схематическое описание процесса подготовки, включающий изображение каждого этапа, представлено на рисунке 2. Успех процесса подготовки синтетических клеток зависит от правильной производительности каждого этапа и осуществляется по различным параметрам. Протокол должен быть скорректирован с учетом производства конкретного белка.
Плазмиды, выражающие модель белка супер-флип зеленый флуоресцентный белок (sfGFP) и Ренилла Люцифераза под промоутером T7 были введены в CFPS массовых реакций и синтетических клеток, и производство белка была оценена с помощью различных методов, в том числе западной помок, цитометрии потока, микроскопии и спектроскопии (рисунок 3). Проверка sfGFP-Его6 помеченных белка (No 27 kDa32) производства западного анализа побелки представлена на рисунке 3A. Образец из 30 юрлиц разбавленных 6 складок был смешан с 10 qL общего буфера образца SDS-PAGE (содержащего моющие средства натрия dodecyl sulfate (SDS) и й-меркаптоэтанол) и вареной в течение 10 мин (95 oC). Мы обнаружили, что сочетание тепла и моющих средств в буфере образца достаточно, чтобы разобрать пузырьки и обеспечить работу белков в геле SDS-PAGE. Обнаружение белка было выполнено с использованием анти-Хистоголовых первичных антител (разбавленных 1:12,000). Как и ожидалось, в то время как производство белка обнаруживается в образцах, содержащих sfGFP-кодирования ШАБЛОНов ДНК ("SfGFP ДНК"), нет белка наблюдается в отрицательных контрольных образцов, в которых шаблон ДНК был исключен ("-ДНК"). Образцы очищенной sfGFP и очищенной sfGFP, инкапсулированной в мембране синтетических клеток ('sfGFP (инкапсулированный)), используются в качестве положительного контроля для массового производства sfGFP CFPS и для его синтеза в синтетических клетках, respectivley. Этот метод может быть применен к различным типам белков. Согласно Krinsky et al.19,доходность производства sfGFP, полученная в соответствии с подробным протоколом, составляет 380 мкг/мл в растворе CFPS и 5,3 мкг/мл, когда раствор CFPS инкапсулируется внутри липидных пузырьков.
Когда белок, который вырабатывается внутри синтетических клеток, флуоресцентный, его производство можно оценить с помощью микроскопии и потока цитометрии на основе методов. Мы проанализировали синтетические клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с фильтром для флуоресценции GFP(рисунок 3B). Поскольку компоненты CFPS имеют некоторые автофлуоресцентные, параметры приобретения изображения должны быть адаптированы в соответствии с соответствующим отрицательным контрольным образцом (синтетические клетки без шаблона ДНК, например).
Кроме того, мы использовали цитометрию потока, чтобы определить среднее интенсивность флуоресценции sfGFP-производящих синтетических клеток, и процент активных синтетических клеток, которые могут производить белки в них (Рисунок 3C I и II). Для каждого проанализированных выборочных образцов было собрано 10 000 событий. Производство синтетических клеток, описанное в этом протоколе, обычно дает активную популяцию 21-25% в растворе с приблизительной концентрацией 107 синтетических клеток/мл. Незначительная интенсивность флуоресценции, представленная образцами «-ДНК» на рисунке 3C II, обусловлена аутофлуоресценцией различных компонентов реакции CFPS, таких как lysate S30.
Анализ размера представителя на основе сигнала GFP (в диаметре) синтетических клеток, подготовленных описанным выше методом, показывает среднее значение 2,4 х 0,5 мкм(рисунок 3D II). Поскольку образование воды в масляной эмульсии в этом методе является результатом применения механических сил, на распределение размеров частиц могут влиять различные факторы, такие как метод и скорость трубачания эмульсии вверх-вниз, модель смесителя вихря и т.д.
Чтобы проверить универсальность производства белка синтетических клеток, экспрессия репортер белка Ренилья люциферазы внутри синтетических клеток был проанализирован(рисунок 3E). В ходе проверки была определена активность люциферазы Рениллы путем измерения люминесценции, полученной в результате ферментативной реакции люциферазы и ее субстрата, h-coelenterazine. Чтобы вызвать ферментативную реакцию, окончательная концентрация 1 мкм h-coelenterazine была добавлена к синтетическим клеткам (объем образца 25 л) непосредственно перед измерением. Образец «-ДНК», не содержащий шаблон ДНК, ошивки люциферазы, использовался в качестве отрицательного контроля для тестирования люминесценции из-за неферментатного окисления субстрата. Люминесценция была измерена с помощью считывателя пластин.
Рисунок 1: Иллюстрация процесса для типичного протокола подготовки синтетических клеток. Процесс разделен на два этапа. Шаг 1: Предварительные эксперименты, включая очистку плазмида ДНК, препарат лицейsate S30-T7, подготовку стоковых растворов, необходимых для внутреннего и кормления растворов, подготовку липидов в масле и подготовку внешнего раствора. Шаг 2: Синтетическое образование клеток, которое включает в себя кормление и подготовку внутренних растворов, подготовку и анализ синтетических клеток. Пример требуемого объема каждого ингредиента для приготовления раствора 100 л синтетических клеток представлен синим цветом в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация протокола подготовки синтетических клеток. Изображение хорошо выполненного процесса иллюстрирует каждый этап протокола. Эта цифра была изменена с Кринского и др.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты производства sfGFP и Renilla luciferase внутри синтетических клеток. (A) Западный анализ поблуга sfGFP-His6 производства как cfPS навалом реакций и внутри синтетических клеток. Обнаружение белка было проведено с использованием анти-Хистоголновых первичных антител (разбавленных 1:12,000). Очищенный sfGFP-His6 был использован в качестве положительного контроля (7,8 мкг). sfGFP (инкапсулированный) является положительный контроль очищенных sfGFP инкапсулированных в синтетических клетках. Образцы без шаблонов ДНК использовались в качестве отрицательного контроля для производственного анализа ("-ДНК"). (B) Репрезентативные изображения sfGFP производства синтетических клеток, принятых с помощью флуоресцентного микроскопа с ярким полем и фильтром GFP. Шкала баров 50 мкм. (C) I и II поток цитометрии анализа sfGFP производства синтетических клеток деятельности (Данные, собранные с помощью цифрового, 4-лазерный анализатор). Образцы были измерены после 3 ч инкубации. Для каждого проанализированных выборочных образцов было собрано 10 000 событий. Для определения общей популяции синтетических клеток использовались фильтры FSC (500 V) и SSC (300 V). Затем для обнаружения флуоресценции GFP был использован фильтр FITC (600 V). (I) Расчет популяции активных синтетических клеток (%), основанный на пороге интенсивности флуоресценции GFP, определяемом образцом "-ДНК" (красная гистограмма), допускающая погрешность в размере 1%. (II) Средняя интенсивность флуоресценции sfGFP производства синтетических клеток. Это значение было рассчитано из активной популяции синтетических клеток и нормализовалось до "-ДНК" образца путем деления средней флуоресценции активных синтетических клеток на среднее синтетических клеток без sfGFP-ДНК. (D) I и II Синтетический анализ размера клеток. Спектр выбросов был обнаружен на 505-560 нм и 642-745 нм для GFP и ярких полевых сигналов, соответственно. (I) Репрезентативное изображение проанализированных синтетических клеток. (II) Распределение размера синтетических элементов. Был проведен анализ и рассчитано распределение диаметра активных синтетических клеток на основе сигнала GFP. (E) Производство активной люциферазы Ренилья внутри синтетических клеток. Активность люциферазы была количественно с измерениями люминесценции после добавления 1 мкм h-coelenterazine с помощью считывателя пластин и представлены как интенсивность света (RLU) х 106. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Таблица 1: Подготовка буферных и фондовых решений. | |
| Комментарии | |
| Лурия Бертани (LB) агар (1.5%) Пластины: | Подготовка и стерилизовать. Добавить ампициллин при конечной концентрации 50 мкг/мл только после охлаждения до комнатной температуры. |
| 10 г/л Бакто-триптон | |
| 10 г/л хлорида натрия (NaCl) | |
| 5 г/л экстракта Бакто-Дрожжи | |
| 15 г/L агар-агар очищен | |
| 50 мкг/мл ампициллин | |
| LB-медиа (20 мл): | Минимальные носители. Подготовка и стерилизовать заранее. Незадолго до прививки бактерий, добавить Ампициллин при окончательной концентрации 50 мкг/мл. |
| 10 г/л Бакто-триптон | |
| 10 г/л хлорида натрия (NaCl) | |
| 5 г/л экстракта Бакто-Дрожжи | |
| 50 мкг/мл ампициллин | |
| Потрясающий бульон (ТБ) СМИ (1 L): | Богатые средства массовой информации. Подготовка и стерилизовать заранее. Незадолго до прививки бактерий, добавить Ампициллин при окончательной концентрации 50 мкг/мл. |
| 12 г/л Бакто-триптон | |
| 24 г/л экстракта бакто-дрожжей | |
| 4% (v/v) Глицерол ангидрус | |
| 2,32 г/л K2HPO4 | |
| 12,54 г/л KH2PO4 | |
| 50 мкг/мл ампициллин | |
| S30 lysate буфер (1,5 л): | Подготовьте и стерилизуйте заранее (за исключением DTT и 2-меркаптоэтанола). Хранить при -4 градусах по Цельсию. |
| 10 мМ Трис-ацетат при рН 7,4 | Трисма-база. Подготовка и настроить рН до 7,4 с помощью уксусной кислоты. |
| 14 мМ ацетат магния | |
| 60 мМ ацетат калия | |
| 1 мМ ДТТ | Добавить непосредственно перед использованием |
| 0,5 мл/л 2-меркаптоэтанол | Добавить непосредственно перед использованием |
| 1 M HEPES-KOH (pH No 8): | Растворите HEPES до конечной концентрации 1 М. Отрегулируйте до pH 8 с помощью решения KOH. |
| ГЕПЕС | |
| Гидроксид калия (KOH) | |
| Таблица 2: Состав внутреннего раствора. | ||||||||||
| Окончательный запрошенный объем внутреннего решения | ||||||||||
| Номер | Реагента | Фондовый конк. | Заключительный conc. | 25 зл. | 50 зл | 100 л | 200 зл. | 300 л | 400 L | |
| 1 | HEPES KOH рХNo 8 | 1 M | 55 мМ | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Предварительное внутреннее решение |
| 2 | Ацетат магния | 1 M | 14 мМ | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Ацетат калия | 1 M | 50 мМ | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ацетат аммония | 5,2 м | 155 мМ | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 м | 40 мМ | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Аминокислоты - смесь I | 50 М | 2,5 мМ | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Аминокислоты - смесь II | 50 М | 2,5 мМ | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 мМ | 1,2 мМ | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 мМ | 1 мМ | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 мМ | 0,8 мм | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 мМ | 1 мМ | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Сахароза | 2 M | 200 мМ | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | Днк плазмида | 10 мкг/мл | * | * | * | * | * | * | ||
| Таблица 3: Состав кормящего раствора. | |||||||||
| Окончательный запрошенный объем раствора кормления | |||||||||
| Номер | Реагента | фондовых ConC. | окончательный conc. | 25 зл. | 50 зл | 100 л | 200 зл. | 300 л | 400 л |
| 1 | HEPES KOH рХNo 8 | 1 M | 83,3 мМ | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Ацетат магния | 1 M | 21,2 мМ | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Ацетат калия | 1 M | 75,5 мМ | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ацетат аммония | 5,2 м | 236,4 мМ | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | ПЕГ - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 м | 60,1 мМ | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Аминокислоты - смесь I | 50 мМ | 3,8 мМ | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Аминокислоты - смесь II | 50 мМ | 3,8 мМ | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 мМ | 1,8 мм | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 мМ | 1,5 мМ | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 мМ | 1,2 мМ | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 мМ | 1,5 мМ | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Глюкозы | 2 M | 200 мМ | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Таблица 4: Необходимые решения для подготовки синтетических клеток. | |
| Требуется решение и материалы | Комментарии |
| Липиды в масле | Хранить при комнатной температуре до использования. Подготовлено в соответствии с разделом 2 |
| Внешнее решение | Подготовлено в соответствии с разделом 3.1 |
| Внутреннее решение | Подготовлено в соответствии с разделом 3.2. |
| Подготовка тестов и контроль образцов в соответствии с разделом 4.1. | |
| Хранить на дробленом льду до использования. | |
| Решение для кормления | Подготовлено в соответствии с разделом 3.3. |
| Хранить на дробленом льду до использования. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол вводит простой и доступный метод для производства больших количеств белково-производящих синтетических клеток. Урожайность активных ячеек зависит от тщательного и точного выполнения протокола с акцентом на несколько критических шагов. В разделе подготовки лизата этого метода, важно достичь соответствующей плотности бактерий до лиза клетки для достижения достаточного количества белков в бактериальном лизате. Во-вторых, процесс лизиса должен быть выполнен при 4 градусах По Цельсию, а лизат быстро заморожен жидким азотом для поддержания белковой активности. Кроме того, в этом протоколе мы использовали E. coli BL21 (DE3) клетки, преобразованные с pAR1219 плазмид, выражающий T7 РНК-полимераза. В тех случаях, когда используется другой штамм бактерий, изменения концентрации лизата могут потребоваться для достижения удовлетворительного количества РНК-полимераза и рибосомы. Даже когда тот же бактериальный штамм используется, различные производства лизата могут иметь некоторые партии к партии изменчивости.
Раздел везикулпроизводства также включает в себя несколько важных шагов. Растворить липиды и удаление хлороформа из минерального масла имеет важное значение для установления эмульсии воды в масле. Центрифугирование капель воды в масле во внешний водный буфер также является ключевым шагом в протоколе для создания синтетических клеток с липидным двухслойным слоем. Изменения во внутреннем растворе пузырьков и липидном составе могут привести к повода для слоя капель на масляно-водяной межфазах без каких-либо наблюдаемых гранул. Чтобы преодолеть это, быстрое решение заключается в увеличении скорости центрифугирования до 1000 х г в шаге передачи эмульсии. В случае, если это не решит проблему, специфическая гравитация внешнего водного решения может быть изменена, гарантируя, что внутреннее решение будет иметь более высокую специфическую гравитацию, чем внешнее решение. Кроме того, осмолальность внутреннего раствора может также варьироваться между различными источниками лизата и производств, в пределах от 800-1100 мОзм/кг. Вариативность осмолальности внутреннего раствора в основном обусловлена изменением концентрации лизата во время его производства. Обычно это не приводит к значительным изменениям в производстве белка, но большое разбавление может привести к снижению урожайности из-за низкой концентрации транскрипции и перевода ферментов в самом лизате. Измерение общей концентрации белка в каждой партии лизата может помочь в настройке концентрации лизата во внутреннем растворе для поддержания постоянных значений (приблизительно 22 мг/мл, измеренных анализом Брэдфорда).
Тем не менее, этот метод имеет некоторые ограничения, которые следует упомянуть. Не все генерируемые синтетические клетки активны и способны производить белки из-за неполной инкапсуляции всех необходимых компонентов. Мы измерили примерно 21-25% активных клеток при производстве sfGFP, выражающих синтетические клетки с помощью цитометрии потока (существенных различий в размерах между активными и неактивными клетками не наблюдалось). Масло и липидные избыточные остатки иногда остаются в двухслойной липидной мембране после переноса синтетических клеток в водиную фазу. Оптимизация концентрации липидов и холестерина в фазе масла может улучшить этот вопрос. Важно также отметить, что распределение размеров полученных синтетических клеток довольно широкое по сравнению с альтернативными микрофлюидными методами, с пузырьками от примерно 1-50 мкм.
Высокая урожайность метода переноса эмульсии делает его особенно подходящим для синтетических клеток, инкапсулирующих системы синтеза белка без клеток для производства терапевтического белка. Различные вариации метода переноса эмульсии были использованы в синтетических клеточных исследованиях и включали изменения в процедуре приготовления масла, состав мембраны, объем образца, внутреннее решение к соотношению масла и скорость центрифугирования5,24,28. Микрофлюидные и полимерные методы стабилизации капель также были использованы для подготовки синтетических клеток, однако, инкапсуляция всей системы CFPS еще не была выполнена с этими методами21,22,23.
Синтетические клетки, полученные этим методом, были показаны in vivo для производства белков и лечения рака в моделях мурин19. Возможности этих клеток могут быть расширены в будущем за пределы экспрессии белка. Интеграция других клеточных процессов, таких как сотовая связь, модификация цитоскелетов и деление клеток в синтетических клетках, были недавно описаны33,,34,,35,36. Замена бактериального лизата эукариотическим изатом позволит экспрессию белков с более высокой сложностью и посттрансляционными модификациями, и, возможно, будет менее иммуногенной даже без процедуры очистки, поэтому открывая более терапевтические границы37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ERC-STG-2015-680242.
Авторы также признают поддержку Центра интегрированного рака Technion (TICC); Институт нанотехнологий Рассела Берри; Лорри И. Локи Междисциплинарный центр наук и инженерии о жизни; министерство экономики Израиля за грант Камин (52752); Министерство науки и космонавтики Израиля - Канцелярия главного ученого (3-11878); Израильский научный фонд (1778/13, 1421/17); Израильская онкологическая ассоциация (2015-0116); Немецко-израильский фонд научных исследований и разработок для гранта GIF Young (I-2328-1139.10/2012); программа Европейского союза FP-7 IRG для гранта на профессиональную интеграцию (908049); Фосалипидский исследовательский центр Грант; Фонд Розенблатта по изучению рака, грант Фонда семьи Маллат; и Фонд семьи Унгер. А. Шредер признает алон и Тауб стипендий. О. Адир признает стипендии Шермана и Гутвирта. Г. Чэнь признает стипендию Шермана. Н. Крински признает баронесса Ариан де Ротшильд женщин докторской программы от Ротшильд Кесарево фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
