Summary
Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.
Abstract
Sentetik hücrelerin yapımı için aşağıdan yukarıya montaj yaklaşımı, hücre taklit ortamında hücresel süreçleri izole etmek ve araştırmak için etkili bir araçtır. Ayrıca hücresiz ifade sistemlerinin geliştirilmesi, protein üretimini, transkripsiyon ve çeviri süreçlerini (DNA→RNA→protein) kontrollü bir şekilde yeniden oluşturma yeteneğini ortaya çıkararak sentetik biyolojiden yararlanmıştır. Burada güçlü bir bakteriyel lizat üretimi ve bu lizatiçinde kolesterol açısından zengin lipid bazlı unilamellar veziküller içinde kapsülleme dahil olmak üzere bir hücre serbest ifade sistemi hazırlamak için bir protokol tarif (GUVs) (yani, istikrarlı lipozomlar), sentetik hücreler oluşturmak için. Protokol, aktif bakteriyel lizatların üretimi de dahil olmak üzere sentetik hücrelerin bileşenlerinin hazırlanmasına yönelik yöntemleri açıklar ken, ardından sentetik hücrelerin petrol de-yağ da emülsiyon transfer yöntemine dayalı olarak adım adım hazırlanmasını sağlar. Bunlar, farklı protein türleri üretmek için yüksek çok yönlülük ile basit ve uygun fiyatlı bir şekilde sentetik hücrelerin milyonlarca üretimini kolaylaştırmak. Elde edilen sentetik hücreler izole bir ortamda protein/RNA üretimini ve aktivitesini araştırmak, yönlendirilmiş evrim de ve aynı zamanda vücutta ki terapötik proteinlerin isteğe bağlı üretimi için kontrollü bir ilaç dağıtım platformu olarak kullanılabilir.
Introduction
Sentetik hücreler yapay hücre benzeri parçacıklar, bir canlı hücrenin bir veya birden fazla fonksiyonlarını taklit, bölme yeteneği gibi, membran etkileşimleri oluşturmak, ve genetik kod1dayalı proteinleri sentezlemek1 ,2,3. Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS) sistemlerini içine alan sentetik hücreler, DNA şablonundaki değişikliklerden sonra çeşitli proteinler ve RNA dizileri üretme yetenekleri nedeniyle yüksek modülerliğe sahiptir. Protein üretiminin mevcut yaklaşımlarına cazip bir alternatif sunan CFPS sistemleri hücre lisat, saflaştırılmış bileşenler veya sentetik bileşenlere dayanır ve ribozomlar, RNA polimeraz, amino asitler ve enerji kaynakları (örn. 3 fosfogliserin ve adenin trifosfosfat)4,,5,6,7,8,9gibi protein sentezi için gerekli tüm transkripsiyon ve çeviri makinelerini içerir. Lipid veziküller içinde bir CFPS sisteminin kapsülleme canlı hücre 10 bağlı olmadan proteinlerin basit ve verimli üretim sağlar10. Ayrıca, bu platform doğal hücreler içinde bozulabilir peptidlerin sentezi sağlar, canlı hücreler için toksik proteinlerin üretimi, ve doğal olmayan amino asitler ile proteinleri değiştirmek11,12. Sentetik hücreler, hücresel yaşamı evrimsel bir perspektiften etkinleştirmek için gerekli olan minimal hücre bileşenlerini araştırmak için bir model olarak kullanılmıştır1,13. Sentetik hücreler de oluşturmak ve genetik devre uygulamak için kullanılan ve yönettiği evrim için modeller olarak14,15,16. Diğer çalışmalar, sentetik hücrelerin doğal hücrelerin biyolojik aktivitesini taklit etme yeteneği üzerinde durarak, diyabetli hastalarda beta hücreleri gibi hasarlı doğal hücrelerin yerini almayı hedeflemektedir17. Ayrıca, bu CFPS kapsülleme sentetik hücreleri çeşitli terapötik proteinler üretmek için yeteneği klinik kullanıma dahil olma potansiyelini göstermektedir18.
Burada, lipid vezikül içinde kapsüllenmiş bir CFPS sistemine dayalı RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için aşağıdan yukarıya laboratuvar ölçekli bir protokol(Şekil 1)açıklıyoruz. Bu in vivo19terapötik bir protein ilacıyerinde üretimi için yeni ilaç dağıtım sistemleri olarak sentetik hücre platformlarının potansiyel kullanımını gösterir. Önceki çalışmalarda CFPS reaksiyonunun optimizasyonu ve hücre lysat ekibe hazırlık süreçleriaraştırılmıştır 4,8,20. Ayrıca, mikroakışkan ve polimer bazlı damlacık stabilizasyon yöntemleri21,22,23gibi hücre büyüklüğünde lipozom preparat için çeşitli teknikler uygulanmıştır, ayrıca lipozomların lipid bileşimi24,,25,26. Sunulan protokolde sentetik hücreler yağ da su emülsiyon transfer yöntemi kullanılarak üretilir ve kapsülleme işlemi düşük sıcaklıklarda (<4 °C)5,10,24,27,28olarak gerçekleştirilir. Bu hafif koşullar moleküler makine biyo-fonksiyonel bütünlüğünü korumak için olumlu olduğu bulunmuştur, yani ribozomlar ve proteinler27,29,30. Partiküllerin lipid bileşimi hem kolesterol hem de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) oluşur. İlk tüm memeli hücre zarlarında bulunan ve membran istikrar, sertlik ve geçirgenlik azaltma için gerekli olan, ve ikinci memeli fosfolipid bileşimi taklit11,13. Hücresel transkripsiyon ve çeviri moleküler makine CFPS potens ve protein sentezini artırmak için pAR1219 plazmid overexpressing T7 RNA polimeraz ile dönüştürülür BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) suşu elde edilir. Bu sistem tanısal ve terapötik proteinler üretmek için kullanılmıştır, kadar moleküler ağırlıkları ile 66 kDa in vitro ve in vivo19,31. Aşağıdaki protokol, doğada protein sentezi ile ilişkili çok çeşitli temel sorulara cevap verebilen ve uyuşturucu dağıtım uygulamalarında da kullanılabilen sentetik hücre sisteminin üretimi için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Komple sentetik hücrelerin üretim protokolünün illüstrasyonu Şekil 1'desunulmuştur. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre, protokolün protein ekspresyonu (bölüm 3.2) ve sentetik hücre oluşumu (bölüm 4) bölümleri de bağımsız olarak (bazı adaptasyonlarla) yapılabilir.
1. S30-T7 lysate hazırlanması
- Çizgi plaka E. coli BL21 (DE3) bakteri tek koloniler elde etmek için 50 g/mL ampisilin ile desteklenen bir LB-agar plaka üzerinde pAR1219 plazmid ifade T7 RNA polimeraz ile dönüştürülmüş.
- Başlangıç çözeltisi hazırlayın: Tek bir koloniyi 100 mL Erlenmeyer şişesinde 50 μg/mL ampisilin ile desteklenen 5 mL LB-media'ya dönüştürün ve 250 rpm ve 37 °C'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı kullanarak bir gecede büyüyün. Yinelenenleri hazırlayın.
- Her 5 mL'lik starteri, 2 L Erlenmeyer şişesinde 50 μg/mL ampisilin ile desteklenen 500 mL TB ortama ayrı ayrı aşılayın ve 0.8-1'in OD600'üne ulaşana kadar 250 rpm ve 37 °C'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı kullanarak büyütün. Spektrofotometre kullanarak periyodik olarak izleyin.
- T7 RNA polimeraz ekspresyonunun indüksiyonu için 100 mM IPTG stokunun 2-3 mL'sini (0,4 - 0,6 mM'ye ulaşmak için) ekleyin ve OD600,4'e ulaşana kadar kültürü büyütmeye devam edin.
- Her Erlenmeyer şişesinden gelen çözeltiyi 250 mL steril santrifüj tüpüne aktarın.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 7.000 x g'de santrifüj. Supernatant atın.
NOT: Bu aşamada, bakteriyel pelet sonraki adımlara geçmeden önce birkaç gün -20 °C'de saklanabilir. - Her peleti 250 mL soğuk (4 °C) S30 lysate tampon ve santrifüj de 7.000 x g'de 10 dakika 4 °C'de yeniden askıya alın.
NOT: S30 lizat tamponu, hücre lizisi adım 1.9'da homogenizer kullanılarak yapıldıktan sonra protein stabilitesini korumak için kullanılır. Bu adımdan itibaren 1.12'ye kadar olan tüm adımlar art arda ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce, tüyoları ve 1,5 mililitrelik şişeleri önceden soğutun. - Supernatant atın ve soğuk S30 lysate tampon 15 mL birlikte tüm peletleri yeniden askıya. Süspansiyonu gazlı bez ped kullanarak filtreleyin.
NOT: 15ml çözelti homogenizer min. hacimden kaynaklanmaktadır. Bakteri konsantrasyonu da önemli olduğu unutulmamalıdır. - Hücre kırılması için 4 bar (iki geçiş) hava basıncı ile 15.000 psi çalışma basıncında homojenleştirin. Daha konsantre ve aktif bir sıvı için çözelti seyreltmekaçının.
- Homojenleştirilmiş süspansiyonun 10 mL'si başına 0,1 M DTT (DİkKAT) 100 μL ekleyin.
- Süspansiyonu 24.700 x g'de 30 dk 4 °C'de santrifüj edin.
- Lysate aktivitesini korumak için aşağıdaki adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin: supernatant'ı önceden soğutulmuş 1,5 mL şişelerde 200 μL'ye bölün ve hemen sıvı nitrojenle dondurun. Daha fazla kullanım için -80 °C'de saklayın.
DTT: DTT Tahriş edici ve Zararlı olarak sınıflandırılır ve bu nedenle dikkatli davranılmalıdır.
2. Yağ çözeltisinde lipidlerin hazırlanması
- POPC ve kolesterolü kloroformda (DİkKAT) ayrı ayrı çözün, her biri 100 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar. Girdap her şişe ayrı ayrı.
- Bileşenleri 2mL cam şişede birleştirin: kloroformda 50 μL POPC, kloroformda 50 μL kolesterol ve 500 μL mineral yağ ekleyin. Sentetik hücrelerin 100 μL için, yağ lipidlerin 2 şişe gereklidir.
- Girdap, ve sonra kloroform buharlaştırmak için kimyasal bir başlık 80 °C'de yaklaşık 1 saat ısı. Belirtilen zamanı/koşulları izleyerek ve çözüm hacmini izleyerek tam buharlaşma nın meydana geldiğinden emin olun.
NOT: Elde edilen lipid-in-oil çözeltisi iki haftakadar oda sıcaklığında saklanabilir. Daha iyi sonuçlar için, her denemeden önce yeni bir hazırlık kullanılması önerilir. Lipid ve kolesterol oranları istenilen membran bileşimine göre değiştirilebilir. Kolesterol yüksek konsantrasyonson sentetik hücre çözeltisi agregaoluşumuna yol açabilir.
DİkKAT: Kloroform Tahriş edici ve Zararlı olarak sınıflandırılır ve bu nedenle dikkatli ve duman ekstraksiyonu olan alanlarda tedavi edilmelidir.
3. Dış, iç ve dış çözeltilerin preparatları
- Stok çözümlerinin hazırlanması
- Ultra saf su (UPW) kullanarak Tablo 2'de listelenen stok çözümlerini hazırlayın.
NOT: Stok çözümleri önceden hazırlanmalı ve ileri kullanıma kadar -20 °C'de saklanmalıdır. Reaktif 7 agregalar oluşturma eğilimindedir. 37 °C'ye Kadar Isıtma toplamayı azaltacaktır. Hafif toplama reaksiyonu önemli ölçüde etkilemez. Reaktif 8 çözeltisi sütlü ve bulanıktır.
- Ultra saf su (UPW) kullanarak Tablo 2'de listelenen stok çözümlerini hazırlayın.
- Dış çözelti
- DNase/RNase içermeyen H2O'daki glikozu 200 mM'lik son konsantrasyona kadar çözündürün.
- 100 μL iç çözelti için 1,6 mL dış çözelti hazırlayın.
- İç öncesi çözüm
- Tablo 2'delistelenen miktarlara ve konsantrasyona göre 1-14 reaktif ekleyin. Örneğin, 100 μL'lik son sentetik hücre hacmi için 100°L iç çözelti hazırlayın.
NOT: Gerekli son hacmi tamamlamak için UPW eklenmelidir. Bu aşamada karışım 4 °C'de birkaç saat saklanabilir.
- Tablo 2'delistelenen miktarlara ve konsantrasyona göre 1-14 reaktif ekleyin. Örneğin, 100 μL'lik son sentetik hücre hacmi için 100°L iç çözelti hazırlayın.
- Besleme çözeltisi
- Tablo 3'te listelenen miktarlara ve konsantrasyona göre tüm reaktifleri ekleyin.
NOT: Besleme çözeltisinin 1:1 oranını kullanın:iç çözelti. 100 μL'lik son sentetik hücre hacmi için 100 μL besleme çözeltisi hazırlayın. Bu dış, iç ve besleme çözeltisi küçük bir aşırı hacim hazırlamak için tavsiye edilir.
- Tablo 3'te listelenen miktarlara ve konsantrasyona göre tüm reaktifleri ekleyin.
4. Sentetik hücrelerin hazırlanması
NOT: Aşağıdaki hacimler 100 μL sentetik hücre hazırlanması için ayarlanır.
- Protein üreten sentetik hücreler
- 15 mL'lik bir tüpte, dış çözeltinin 12 mL'sini yerleştirin ve yağ çözeltisindeki 500 μL'lik lipitleri yavaşça bir tabaka üzerine ekleyin. 20 dk oda sıcaklığında kuluçka.
- İç çözelti hazırlamayı sonuçlandırmak için: ezilmiş buzun üzerindeki iç çözelti malzemelerini, depolanan karışıma S30-T7 Lysate (reaktif 15) ve DNA plazmidi (reaktif 16) ekleyerek 100°L'lik son bir hacme karıştırın.
- Yağ çözeltisinde 500 μL lipid içeren ikinci 2 mL cam şişeye iç çözeltinin 100 μL'sini ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle 1 dakika ve girdap için başka bir dakika için seviye beş.
- Ezilmiş buz üzerinde 10 dakika kuluçka ve yavaş yavaş 15 mL tüp (4.1.1 itibaren) yağ fazı üstüne sonuç emülsiyon ekleyin.
- 10 00 x g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj ve 400 x g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj. Santrifüj sonunda tüpün alt kısmında bir pelet gözlenmelidir.
NOT: Yağdaki su damlacıklarının interfazdan geçişi sırasında ikinci bir yağ tabakasının daha iyi bir kapsama alanı elde etmek için burada sallanan bir kova santrifüj rotor kullanmak tercih edilir. Gözlemlenebilir pelet olmaması durumunda santrifüj hızı 1000 x g'yeçıkarılabilir. Aksi takdirde, dış çözümün özgül ağırlığına atıfta bulunan Tartışma bölümüne bakın. - Peleti çıkar.
- Fazla yağ tabakasını çıkarın.
- Peleti çıkarmak için yaklaşık 400 μL dış çözelti ile yüklenmiş kesilmiş pipet ucu kullanın. Sulu fazda sadece pelet toplamak için yağ aşamasından geçerken dış çözeltibırakın.
- Yağ kalıntılarının akmasını önlemek için peletin çıkarılmasından sonra ucu silin ve peleti temiz bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- 10 dk 1.000 x g ve 4 °C'de santrifüj, süpernatantı çıkarın ve 100 μL besleme çözeltisi (iç besleme çözeltilerinin 1:1 oranı) içinde peleti yeniden askıya alın.
NOT: Burada sabit açılı santrifüj rotor da kullanılabilir. - Protein ekspresyonu için, 37 °C'de 2 saat boyunca titremeden kuluçkaya yatırın.
NOT: Optimal kuluçka süresi farklı proteinler arasında değişir. - Üretilen protein miktarını hedef protein özelliklerine göre uygun bir yöntemle değerlendirin.
- Önerilen kontrol grupları
- İç çözelti ve lysate aktivite onayı
- Tam bir iç çözelti hazırlayın (DNA & S30-T7 lysate ile).
- 250 rpm'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı veya 1200 rpm'de termomik eritme kullanarak yukarıdaki reaksiyonu 2 saat boyunca 37 °C sabit sıcaklıkta hemen kuluçkaya yatırın.
NOT: Sentetik hücre kuluçka süresine uyacak şekilde kuluçka süresini ayarlayın.
- Sentetik hücreler
- Negatif kontrol grubu: 4.1'de sunulan protokolü DNA'sız iç solüsyonile hazırlayın.
- Pozitif kontrol: 4.1'de sunulan protokolü, muhabir gen için T7 plazmid kodlaması içeren iç solüsyon ile hazırlayın.
NOT: Kapsülleme verimliliği adımını sağlamak için test gruplarının yanı sıra sfGFP gibi bir muhabir geninden oluşan pozitif bir kontrol grubu ekleyin.
- İç çözelti ve lysate aktivite onayı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipid veziküllerin içinde BL21 E. coli tabanlı bir S30-T7 CFPS sistemini kapsülleyerek sentetik hücrelerin hazırlanması için bir protokol salıyoruz. Her aşamanın bir görüntüsünü içeren hazırlık sürecinin şematik bir açıklaması Şekil 2'devettir. Sentetik hücre hazırlama sürecinin başarısı her aşamanın uygun performansına bağlıdır ve farklı parametrelerden etkilenir. Protokol belirli bir proteinin üretimini karşılamak için ayarlanmalıdır.
T7 organizatörü altında model protein süper klasör Yeşil Floresan Protein (sfGFP) ve Renilla Luciferase ifade Plazmidler CFPS toplu reaksiyonlar ve sentetik hücreler içine tanıtıldı, ve protein üretimi farklı yöntemler kullanılarak değerlendirildi, batı leke dahil olmak üzere, akış sitometri, mikroskopi ve spektroskopi(Şekil 3). Batı leke analizi ile sfGFP-His6 etiketli protein (~27 kDa32)üretiminin doğrulanması Şekil 3A'dasunulmuştur. 6 kat seyreltilmiş 30°L sentetik hücre numunesi, ortak bir SDS-PAGE numune tamponunun 10 μL'si (sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve β-merektoetanol içeren) ile karıştırıldı ve 10 dakika (95 oC) kaynatıldı. Örnek tamponundaki ısı ve deterjan kombinasyonunun vezikülleri sökmek ve SDS-PAGE jelindeki proteinlerin çalışmasını sağlamak için yeterli olduğunu bulduk. Protein tespiti anti-His poliklonal primer antikor kullanılarak yapıldı (seyreltilmiş 1:12,000). Beklendiği gibi, sfGFP kodlayıcı DNA şablonları ("+sfGFP DNA") içeren örneklerde protein üretimi saptanırken, DNA şablonunun dışlandığı negatif kontrol örneklerinde ("-DNA") hiçbir protein gözlenmez. Saflaştırılmış sfGFP ve sentetik hücre zarı içinde kapsüllenmiş saflaştırılmış sfGFP örnekleri ('sfGFP (kapsüllü)), sfGFP CFPS toplu üretimi ve sentetik hücreler içinde sentezi için pozitif kontroller olarak kullanılır, respectivley. Bu yöntem farklı protein türlerine uygulanabilir. Krinsky ve ark.19'agöre, ayrıntılı protokol kapsamında elde edilen sfGFP üretim verimi CFPS çözeltisinde 380 μg/mL ve 5.3 g/mL olup, CFPS çözeltisi lipid veziküllerin içine kapsüllendiğinde.
Sentetik hücreler içinde üretilen protein floresan olduğunda, üretimi mikroskopi ve akış sitometri sitometrisi bazlı yöntemler kullanılarak değerlendirilebilir. Sentetik hücreleri ffloresan mikroskobu kullanarak GFP floresan için bir filtre ile analiz ettik(Şekil 3B). CFPS bileşenlerinde bazı otofloresan olduğundan, görüntü edinme parametreleri uygun bir negatif kontrol örneğine (örneğin DNA şablonu olmayan sentetik hücreler) göre uyarlanmalıdır.
Buna ek olarak, sfGFP üreten sentetik hücrelerin ortalama floresan yoğunluğunu ve bunların içinde protein üretebilen aktif sentetik hücrelerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi kullandık (Şekil 3C I&II). Analiz edilen her örnek için 10.000 etkinlik toplandı. Bu protokolde tanımlanan sentetik hücre üretimi genellikle yaklaşık 107 sentetik hücre/mL konsantrasyonu olan bir çözelti içinde %21-25 oranında aktif bir popülasyon sağlar. Şekil 3C II'de "-DNA" örneklerinin sunduğu hafif floresan yoğunluğu, CFPS reaksiyonundaki S30 lysate gibi farklı bileşenlerin otofloresansından kaynaklanmaktadır.
Yukarıda açıklanan yöntemle hazırlanan sentetik hücrelerin GFP sinyaline (çap) dayalı temsili boyut analizi ortalama değeri 2,4±0,5 m(Şekil 3D II)olarak göstermektedir. Bu yöntemde yağ emülsiyonunda su oluşumu mekanik kuvvetler uygulanmasının bir sonucu olduğundan, parçacıkların boyut dağılımı emülsiyonun yukarı ve aşağı borulama yöntemi ve hızı, girdap karıştırıcı makinesinin modeli gibi farklı faktörlerden etkilenebilir.
Sentetik hücrelerin protein üretiminin çok yönlülüğünü test etmek için, sentetik hücrelerin içindeki muhabir protein Renilla luciferase ifadesi analiz edilmiştir(Şekil 3E). Teşp, luciferase ve substratı h-coelenterazine'in enzimatik reaksiyonundan kaynaklanan ışılışı ölçerek Renilla luciferase aktivitesini ölçtü. Enzimatik reaksiyonu indüklemek için, ölçümden hemen önce sentetik hücrelere (25°L numune hacmi) 1 μM h-coelenterazine son konsantrasyonu eklendi. "-DNA" örneği, luciferase-kodlama DNA şablonu içermeyen substrat olmayan enzimatik oksidasyon nedeniyle parlaklık test etmek için negatif bir kontrol olarak kullanılmıştır. Luminescence bir plaka okuyucu kullanılarak ölçüldü.
Şekil 1: Tipik sentetik hücre hazırlama protokolü için sürecin bir örneği. İşlem iki adıma ayrılır. 1. Adım: DNA plazmid saflaştırma, S30-T7 lysate hazırlama, iç ve besleme çözeltileri için gerekli stok çözeltisi hazırlama, yağ içi çözelti hazırlama ve dış çözelti hazırlama gibi deney öncesi preparatlar. Adım 2: Beslenme ve iç çözeltihazırlama, sentetik hücre hazırlama ve analizi içeren sentetik hücre oluşumu. 100 μL sentetik hücre çözeltisi hazırlamak için her bileşenin gerekli hacminin bir örneği parantez içinde mavi renkte sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sentetik hücre hazırlama protokolünün şematik çizimi. İyi gerçekleştirilen bir işlemin görüntüsü protokolün her aşamasını gösterir. Bu rakam Krinsky ve ark.19'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sentetik hücreler içinde sfGFP ve Renilla luciferase üretiminin temsili sonuçları. (A) Hem CFPS toplu reaksiyonlarında hem de sentetik hücrelerin içinde sfGFP-His6 üretiminin batıda bir leke analizi. Protein tespiti anti-His poliklonal primer antikor (seyreltilmiş 1:12.000) kullanılarak gerçekleştirildi. Saflaştırılmış sfGFP-His6 pozitif kontrol (7.8 g) olarak kullanıldı. sfGFP (kapsüllü) sentetik hücrelerde kapsüllenmiş saflaştırılmış sfGFP pozitif kontrolüdür. DNA şablonu olmayan örnekler üretim analizi ("-DNA") için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (B) Parlak alan ve GFP filtresi ile floresan mikroskop kullanılarak çekilen sentetik hücreler üreten sfGFP'nin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. (C) Sentetik hücre aktivitesi üreten sfGFP'nin I&II Akış sitometri analizi (Dijital, 4-lazer analizörü kullanılarak toplanan veriler). Örnekler 3 saat kuluçkadan sonra ölçüldü. Analiz edilen her örnek için 10.000 etkinlik toplandı. Toplam sentetik hücre popülasyonunu tanımlamak için FSC (500 V) ve SSC (300 V) filtreler kullanıldı. Daha sonra, GFP floresansını tespit etmek için bir FITC (600 V) filtresi kullanıldı... (I) Aktif sentetik hücre popülasyonunun hesaplanması [%] GFP floresan yoğunluk eşiğine dayanıyordu, "-DNA" örneği (kırmızı histogram) ile tanımlanan, ~%1'lik bir hataya izin veren. (II) Sentetik hücreler üreten sfGFP'nin ortalama floresan yoğunluğu. Bu değer aktif sentetik hücre popülasyonundan hesaplanmış ve sfGFP-DNA içermeyen sentetik hücrelerin ortalama floresansı ile "-DNA" örneğine normalleştirilmiştir. (D) I&II Sentetik hücre büyüklüğü analizi. Emisyon spektrumu sırasıyla GFP ve parlak alan sinyalleri için 505-560 nm ve 642-745 nm ile tespit edildi. (I) Analiz edilen sentetik hücrelerin temsili bir görüntüsü. (II) Sentetik hücrelerin boyut dağılımı. Analiz yapıldı ve aktif sentetik hücrelerin çap dağılımları GFP sinyaline göre hesaplandı. (E) Sentetik hücrelerin içinde aktif Renilla luciferase üretimi. Luciferase aktivitesi bir plaka okuyucu kullanılarak 1 μM h-coelenterazine ilave edildikten sonra lüminesans ölçümleri ile ölçülür ve ışık yoğunluğu [RLU] x 106olarak sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tablo 1: Tampon ve stok çözümleri hazırlama. | |
| Yorum | |
| Luria Bertani (LB) agar (%1.5) Plaka: | Hazırlayın ve sterilize edin. Ampisilin'i 50 g/mL'lik son konsantrasyonda sadece oda sıcaklığına kadar soğuttuktan sonra ekleyin. |
| 10 g/L Bacto-tripto | |
| 10 g/L Sodyum klorür (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Maya özü | |
| 15 g/L Agar arınmış | |
| 50 μg/mL Ampisilin | |
| LB ortam (20 mL): | Minimal medya. Önceden hazırlayın ve sterilize edin. Bakterileri aşılamadan hemen önce, 50 g/mL'lik son konsantrasyonda Ampisilin ekleyin. |
| 10 g/L Bacto-tripto | |
| 10 g/L Sodyum klorür (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Maya özü | |
| 50 μg/mL Ampisilin | |
| Müthiş Suyu (TB) medya (1 L): | Zengin medya. Önceden hazırlayın ve sterilize edin. Bakterileri aşılamadan hemen önce, 50 g/mL'lik son konsantrasyonda Ampisilin ekleyin. |
| 12 g/L Bacto-tripto | |
| 24 g/L Bacto-Maya özü | |
| %4 (v/v) Gliserol susuz | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL Ampisilin | |
| S30 lysate tampon (1,5 L): | Önceden hazırlayın ve sterilize edin (*DTT ve 2-mercaptoethanol hariç). -4 °C'de saklayın. |
| 10 mM Tris-asetat pH = 7.4 | Trisma üssü. Asetik asit kullanarak pH'ı 7.4'e hazırlayın ve ayarlayın. |
| 14 mM magnezyum asetat | |
| 60 mM potasyum asetat | |
| *1 mM DTT | Kullanmadan hemen önce ekleme |
| *0,5 mL/L 2-merkaptoetanol | Kullanmadan hemen önce ekleme |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | HEPES'i 1 M.'lik son konsantrasyona kadar çözün. |
| HEPES | |
| Potasyum hidroksit (KOH) | |
| Tablo 2: İç çözelti bileşimi. | ||||||||||
| Son istenen İç çözelti hacmi | ||||||||||
| Numarası | Reaktif | Stok eksi. | Son conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | İç öncesi çözüm |
| 2 | Magnezyum asetat | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Potasyum asetat | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Amonyum asetat | 5.2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Amino asitler - karışım I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Amino asitler - karışım II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100mm | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100mm | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100mm | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sakaroz | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA plazmidi | 10 μg/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| Tablo 3: Besleme çözeltisi bileşimi. | |||||||||
| Son istenen besleme çözeltisi hacmi | |||||||||
| Numarası | Reaktif | stok conc. | son conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μL |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnezyum asetat | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Potasyum asetat | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Amonyum asetat | 5.2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Amino asitler - karışım I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Amino asitler - karışım II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100mm | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100mm | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100mm | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glikoz | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tablo 4: Sentetik hücre hazırlama için gerekli çözümler. | |
| Çözüm & malzemeler gerekli | Yorum |
| Yağlipidler | Kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. Bölüm 2'ye göre hazırlanır |
| Dış çözelti | Bölüm 3.1'e göre hazırlanmıştır |
| İç çözelti | Bölüm 3.2'ye göre hazırlanmıştır. |
| Bölüm 4.1'e göre testleri + kontrolleri örnekleri hazırlayın. | |
| Kullanıma kadar ezilmiş buz üzerinde tutun. | |
| Besleme çözeltisi | Bölüm 3.3'e göre hazırlanmıştır. |
| Kullanıma kadar ezilmiş buz üzerinde tutun. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, büyük miktarlarda protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için basit ve uygun fiyatlı bir yöntem tanıetmektedir. Etkin hücrelerin verimi, birkaç kritik adıma vurgu ile protokolün dikkatli ve doğru uygulanmasına bağlıdır. Bu yöntemin lizate hazırlama bölümünde, bakteri lizate proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için hücre lizis önce uygun bakteri yoğunluğuulaşmak esastır. İkinci olarak, lysis işlemi 4 °C'de yapılmalı ve protein aktivitesini korumak için sıvı nitrojen ile hızlı bir şekilde dondurulmuş lysate. Ayrıca bu protokolde pAR1219 plazmid ile dönüşen E. coli BL21(DE3) hücreleri kullanıldı. Farklı bir bakteri suşunun kullanıldığı durumlarda, tatmin edici miktarda RNA polimeraz ve ribozomlara ulaşmak için lysat konsantrasyonunda değişiklik yapılması gerekebilir. Aynı bakteriyel tür kullanılsa bile, farklı lizate üretimleri toplu-toplu değişkenliğe sahip olabilir.
Vezikül üretim bölümü de önemli adımlar bir çift içerir. Lipidlerin çözünmesi ve kloroformun mineral yağdan uzaklaştırılması, yağdaki suyun emülsiyonunu oluşturmak için önemlidir. Dış sulu tampon içine su-in-petrol damlacıkları santrifüj de bir lipid çift katmanlı sentetik hücreler oluşturmak için protokolönemli bir adımdır. Veziküllerin iç çözeltisindeki değişiklikler ve lipid bileşimi, gözlemlenebilir pelet olmadan yağ-su interfazında damlacıktabakasına yol açabilir. Bunun üstesinden gelmek için, hızlı bir çözüm emülsiyon aktarım adım1.000 x g santrifüj hızını artırmaktır. Bu sorunu çözmezse, dış sulu çözeltinin özgül ağırlığı, iç çözeltinin dış çözeltiden daha yüksek bir özgül çekim gücüne sahip olmasını sağlayarak değiştirilebilir. Ayrıca iç çözeltinin osmolalitesi 800-1100 mOsm/kg arasında değişen farklı lysate kaynakları ve üretimleri arasında da farklılık gösterebilir. İç çözeltinin osmolalitesindeki değişkenlik çoğunlukla üretim sürecinde ki lysate konsantrasyonlarının değişmesinden kaynaklanmaktadır. Genellikle bu protein üretiminde önemli değişikliklere yol açmaz, ancak büyük bir seyreltme düşük transkripsiyon ve çeviri enzimleri lysate kendisi nedeniyle daha az verim yol açabilir. Her bir lysate partisindeki toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi, sabit değerleri korumak için iç çözeltideki lysat konsantrasyonlarının ait ait ait ait ait ait olmasında yardımcı olabilir (Bradford tsay ile ölçülen yaklaşık 22 mg/mL).
Yine de, bu yöntemde belirtilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. Üretilen sentetik hücrelerin hepsi aktif değildir ve gerekli tüm bileşenlerin eksik kapsüllemesi nedeniyle protein üretebilme yeteneğine sahiptir. Akış sitometrisi kullanarak sentetik hücreleri ifade eden sfGFP üretirken aktif hücrelerin yaklaşık %21-25'ini ölçtük (aktif ve aktif olmayan hücreler arasında önemli boyut farkları gözlenmedi). Yağ ve lipid fazlaksizleri bazen sulu faziçine sentetik hücrelerin transferi nden sonra çift katmanlı lipid membran kalır. Yağ fazında lipid ve kolesterol konsantrasyonları optimize bu sorunu artırabilir. Elde edilen sentetik hücrelerin boyut dağılımının alternatif mikroakışkan yöntemlere göre oldukça geniş olduğunu veyaklaşık 1-50 μm arasında değişen veziküllerin olduğunu da belirtmek önemlidir.
Emülsiyon transfer yönteminin yüksek verimi, onu terapötik protein üretimi için hücresiz protein sentez sistemlerini kapsülleme yapan sentetik hücreler için özellikle uygun kılmaktadır. Sentetik hücre çalışmalarında emülsiyon transfer yönteminin farklı varyasyonları kullanılmış ve yağ hazırlama prosedürü, membran bileşimi, numune hacmi, yağ oranı ve santrifüj hızları5,,24,28için iç çözelti değişiklikleri dahil edilmiştir. Mikroakışkan ve polimer bazlı damlacık stabilizasyon yöntemleri de sentetik hücre hazırlanması için kullanılmıştır, ancak, tüm CFPS sisteminin kapsülleme henüz bu yöntemlerle yapılmamışmıştır21,22,23.
Bu yöntemle elde edilen sentetik hücreler in vivo proteinler üretmek ve murine modellerinde kanser tedavisinde gösterilmiştir19. Bu hücrelerin yetenekleri gelecekte protein ekspresyonunun ötesine daha da genişletilebilir. Hücresel iletişim, sitoiskelet modifikasyonu ve sentetik hücrelerde hücre bölünmesi gibi diğer hücresel süreçlerin entegrasyonu son zamanlarda tarif edilmiştir33,34,35,36. Ökaryotik hücre lizatı ile bakteriyel lizatın ikame edilmesi, daha yüksek karmaşıklık ve post-çevirisel modifikasyonlara sahip proteinlerin ekspresyonuna olanak sağlayacak ve belki de temizlik prosedürü olmadan bile daha az immünojenik olacaktır, bu nedenle daha terapötik sınırlar açarak37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma ERC-STG-2015-680242 tarafından desteklenmiştir.
Yazarlar ayrıca Technion Entegre Kanser Merkezi (TICC) desteğini kabul; Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü; Kamyon I. Lokey Disiplinlerarası Yaşam Bilimleri ve Mühendislik Merkezi; Kamin Hibesi için İsrail Ekonomi Bakanlığı (52752); İsrail Bilim Teknoloji ve Uzay Bakanlığı - Baş Bilim Adamı Ofisi (3-11878); İsrail Bilim Vakfı (1778/13, 1421/17); İsrail Kanser Derneği (2015-0116); GIF Young hibesi için Alman-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı (I-2328-1139.10/2012); Avrupa Birliği FP-7 IRG Kariyer Entegrasyonu Hibeprogramı (908049); Fosfolipid Araştırma Merkezi Hibe; Bir Rosenblatt Kanser Araştırmaları Vakfı, Mallat Aile Vakfı Hibe; ve Unger Aile Vakfı. A. Schroeder Alon ve Taub Bursları'nı kabul ediyor. O. Adir, Sherman ve Gutwirth burslarını kabul eder. G. Chen, Sherman Bursu'nu kabul ediyor. N. Krinsky, Rothschild Caesarea Vakfı'nın Barones Ariane de Rothschild Kadın Doktora Programı'nı kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
