Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Hjernedødinduktion hos mus ved hjælp af intraarteriel blodtryksovervågning og ventilation via tracheostomi

Published: April 17, 2020 doi: 10.3791/60831
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en murine model af hjernedød induktion med henblik på at vurdere indflydelsen af dens patofysiologiske virkninger på organer samt på hinanden følgende grafts i forbindelse med solid organtransplantation.

Abstract

Mens både levende donation og donation efter kredsløbsdød giver alternative muligheder for organtransplantation, er donation efter donorhjernedød (BD) stadig den største kilde til solide transplantationer. Desværre, den irreversible tab af hjernefunktion er kendt for at fremkalde flere patofysiologiske ændringer, herunder hæmodynamiske samt hormonelle ændringer, endelig fører til en systemisk inflammatorisk reaktion. Modeller, der muliggør en systematisk undersøgelse af disse virkninger in vivo, er knappe. Vi præsenterer en murine model af BD induktion, som kunne støtte undersøgelser af de ødelæggende virkninger af BD på allograft kvalitet. Efter at have implementeret intraarteriel blodtryksmåling via den fælles halspulsåre og pålidelig ventilation via en trakeostomi induceres BD ved støt stigende intrakranielt tryk ved hjælp af et ballonkateter. Fire timer efter BD-induktion kan organer høstes til analyse eller til yderligere transplantationsprocedurer. Vores strategi muliggør en omfattende analyse af donor BD i en murinemodel, hvilket giver mulighed for en dybdegående forståelse af BD-relaterede virkninger ved solid organtransplantation og potentielt bane vejen for optimeret organforkonditionering.

Introduction

Transplantation er i øjeblikket den eneste helbredende behandling for end-stage organsvigt. Indtil nu har hjernedød (BD) patienter været den vigtigste kilde til organdonationer, selv om levende donation og donation efter kredsløbsdød er værdifulde alternativer1. BD er defineret ved en irreversibel koma (med en kendt årsag), fraværet af hjernestammen reflekser og apnø2. Desværre, BD organer demonstrere ringere resultater i langsigtet graft overlevelse uafhængigt af humanleocyt antigen (HLA)-mismatch og kold iskæmisk tid3. I mellemtiden, intensiv forskning på denne antigen-uafhængige risikofaktor er blevet udført resulterer i tre hovedaspekter af patofysiologiske ændringer medieret som en konsekvens af BD: hæmodynamisk, hormonelle, oginflammatoriske 4.

Til dato har eksperimentelle BD-modeller hos gnavere for det meste udført ved hjælp af rotter. For at få større indsigt i de immunologiske konsekvenser for faste organer efter BD, vi havde til formål at etablere en murine model af BD, som i øjeblikket kun musemodeller giver mulighed for omfattende undersøgelser af genetiske eller immunologiske faktorer. I denne sammenhæng giver musesystemet et større udvalg af analyseværktøjer.

Princippet om BD induktion som beskrevet her er baseret på en stigning i intrakranielt tryk forårsaget af inflationen af en ballon kateter indsat under kraniet. Øget intrakranielt tryk efterligner den fysiologiske mekanisme af BD ved at blokere perfusion af cerebrum, cerebellum, og hjernestammen5,6. For at sikre tilstrækkelig perfusion af perifere organer er blodtryksmåling obligatorisk under proceduren. Kateteret, der anvendes til dette formål på samme tid tjener til saltvand administration med henblik på at stabilisere blodtrykket ved væskesubstitution. Da BD ledsages af ophør af spontan vejrtrækning, skal der sikres tilstrækkelig ventilation. Et elektrisk tæppe opretholder fysiologiske kerne kropstemperatur.

Sammenfattende vil denne model muliggøre dybdegående undersøgelser af påvirkningen af BD-induceret skade, på leukocyt migration7, kompliment aktivering8, iskæmisk reperfusion skade9, og andre faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med principperne for laboratoriepleje formuleret af National Society for Medical Research og Guide for care and use of Laboratory Animals udarbejdet af National Academy of Science og udgivet af National Institutes of Health (NIH Publication No. 86-23, revideret 1985). Alle forsøg blev godkendt af det østrigske ministerium for uddannelse, videnskab og kultur (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Arteriel kateterisation

  1. Bedøve musen med en intraperitoneal injektion af ketamin og xylamin10 og et smertestillende middel i henhold til lokal praksis (f.eks. buprenorphin).  Klem bagbenene med pincet for at bekræfte bedøvelsens korrekte dybde.
    BEMÆRK: Til dette studie blev der anvendt mandlige C57BL/6N-mus i alderen 8−12 uger (vægt 20−25 g). Forfatterne har testet mandlige BALB / c af samme alder uden held, men har ikke prøvet andre stammer (se Diskussion).
  2. Fjern håret i de regioner af interesse (hoved, hals) ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Sørg for, at der ikke er løst hår tilbage for at forhindre sårforurening. Derefter desinficere det kirurgiske felt med 70% ethanol / chlorhexidin / betadin og placere musen supine med hovedet mod kirurgen.
  3. Lav en cervikal midterlinjen snit med dissekere saks.
  4. Dissekere submandibulære kirtler og hals muskelvæv og adskille dem for at afsløre den fælles halspulsåren. Brug for det meste stump dissektion via pincet.
  5. Placer tre 8-0 silke ligaturer under den rigtige fælles halspulsåren.
  6. Placer en klemme på den proksimale ligatur og bringe spændinger i arterien, så strømmen er suspenderet.
  7. Luk den mest distale ligatur.
  8. Sæt arteriekateteret gennem et lille, præformet hudhul på kranieaspektet af snittet. Klem og deformere lumen af kateteret, hvis det ser for stor til at reducere blod tilbageløb. Fiksere med alle tre ligaturer.
  9. Fikser kateteret til huden for at undgå dislokation. Gør dette ved hjælp af en sutur (f.eks. 5-0 monofilamenter, ikke-absorberbare), som forbinder kateteret med huden i det område af det præforme hudhul.

2. Trakeostomi

  1. Dissekere den præ-trakeal muskulatur rent ud ved hjælp af pincet.
  2. Placer to 8-0 silke ligaturer under luftrøret.
  3. Tracheotomize ved hjælp af mikro saks så proksimalt som muligt for at undgå ensidig ventilation. Brug en vandret skærelinje mellem to luftrørbrusk.
  4. Sæt ventilationsrøret og fiksermed begge forberedte ligaturer.
    BEMÆRK: Den proksimale ende af luftrøret behøver ikke at være ligated.
  5. Luk huden med en løbende sutur (f.eks. 6-0 monofilamenter, ikke-absorberbare).
  6. Uddel musen med en frekvens på 150/min. og et tidevandsrum på 200 μL.

3. Hjernedødinduktion

  1. Arrangere musen til den udsatte position.
  2. Fjern huden fra kraniet ved hjælp af kirurgisk saks og pincet til at holde huden.
  3. Bor en 1 mm kaliber borehul paramedially over venstre parietal cortex. Stop boringen, før du bryder den indre kompakte knogle og dura mater.
  4. Trænge ind i den endelige vævbro af kraniet ved hjælp af stumpe pincet, fjerne skarpe kanter.
  5. Sæt ballonkatetret i, så det er helt inden for kraniehulen. Sørg for, at ballonen er fyldt med saltvand, og at al luft evakueres.
  6. Begynd inflationen på ~0,1 ml/min over en periode på 10−15 min (samlet volumen på 0,8−1,2 ml) ved hjælp af en sprøjtepumpe.
    BEMÆRK: Musen vil udstille myoklonus, mydriasis, yderligere beslaglæggelse aktivitet og agonal gisper.
  7. Udtal musen hjernen døde, når halen af musen er gået stiv og rejst.
    BEMÆRK: BD bekræftes af en karakteristisk indledende blodtrykpeak (Cushing refleks), fraværet af hjernestammenreflekser og spontan vejrtrækning. Regelmæssig apnø test bør undgås under forsøg, som mus kan blive kredsløbssygdomme ustabile på grund af mangel på ilt.
  8. Stop oppustningen af ballonkatetret.
  9. Sæt en opvarmning tæppe over musen for at undgå hypotermi.

4.

  1. Overvåg og dokumentere blodtrykket regelmæssigt. Ekskluder mus med en langvarig hypotensive fase (gennemsnitligt arterielt tryk [MAP] < 50 mmHg i >30 min).
  2. Indgyde 0,1 ml saltvand hver 30 min at stabilisere blodtrykket af musen.
    BEMÆRK: I alt blev der i alt givet 0,8 ml saltvand til hver mus i denne undersøgelse.
  3. Efter 4 timer af BD varighed, høst musen organer / væv. Ekskluder musen fra eksperimentet, hvis hjertet af musen ikke slår i slutningen af eksperimentet.

5. Sham-proceduren

  1. Udfør trin 1.1−3.3.
    BEMÆRK: Åbn ikke den indre kompakte knogle. Der må ikke indsættes eller pustes op i et ballonkateter.
  2. Hold dig tæt på musen og hold konstant øje med dyret. Klem gentagne gange bagbenene med pincet for at bekræfte bedøvelsens korrekte dybde. Påfør yderligere anæstesi subkutant (ca. 1/2 af startdosis), hvis musen viser tegn på opvågnen, hvilket, til vores erfaring, sker ca. efter 2−3 h post-anæstesi.
  3. Påfør den samme mængde intravenøs saltvand som i BD-musene.
    BEMÆRK: Fingeret mus vil genvinde spontan vejrtrækning efter ophør af ventilation. BD-musen vil ikke. Apnø test bør gøres, mens oprettelse af modellen, men under eksperimenter bør det undgås på grund af unødvendig fysiologisk stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murine BD-modellen blev udført mere end 100 gange med en succesrate på over 90%. Derudover er post interventionel organtransplantation af hjerte og nyre blevet sikkert udført7.

BD fremkalder en række patofysiologiske ændringer, der kan undersøges yderligere ved hjælp af denne model. Som vist i figur 1viser blodtrykket en indledende hypertensive top efterfulgt af en langvarig hypotensive fase. For at undgå skadelige fysiologiske virkninger af hypotension blev mus med et langvarigt utilstrækkeligt blodtryk (MAP < 50 mmHg i mere end 30 min) udelukket.

En anden veletableret observation er, at BD induktion fører til aktivering af immunsystemet. Efter 4 timer af BD varighed organ-specifik opregulering af immun markører på mRNA-niveau (Figur 2) samt immuncellemigration blev observeret7.

Figure 1
Figur 1: Invasiv måling af gennemsnitligt arterielt tryk (MAP) efter BD-induktion eller fingeret procedure. På tidspunktet for BD induktion, blodtryk var betydeligt højere i BD dyr (hvide firkanter) end i fingerede dyr (sorte firkanter), som forklares via den velbeskrevne cytokin storm; derefter blev normaliseringen af blodtrykket tydelig efterfulgt af en periode med faldende trykniveauer, der begyndte efter 90 min BD-induktion (n = 19 dyr/gruppe ± SD). Statistisk signifikante forskelle blev testet med tovejs ANOVA og Bonferroni post-test; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: BD-induktion aktiverer immunsystemet og forårsager direkte organskader før transplantation. Vi viser repræsentative resultater af den naturlige cytotoksicitet, der udløser receptor 1 (NCR1 også NK-p46), som stiger i nyrerne som følge af BD på mRNA-niveau. Ingen ændringer blev observeret i lever eller hjerter. Data præsenteres som gennemsnit ± SE af n = 7−8 dyr/gruppe. Statistisk signifikante forskelle mellem BD og fingeret blev testet ved hjælp af Mann-Whitney U-testen; **p = 0,0037. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BD, som er en risikofaktor for allograftkvalitet hos multiorgandonorer, medfører et væld af patofysiologiske ændringer, som kun kan vurderes tilstrækkeligt ved hjælp af in vivo-modeller. Hæmodynamiske forandringer, cytokinstorm, hormonelle forandringer og deres endelige indvirkning på organtransplantatets kvalitet og overlevelse kan ikke analyseres in vitro4. Størstedelen af den grundlæggende transplantation samt immunologisk forskning er afhængig af avancerede diagnostiske værktøjer, som kun er bredt tilgængelige i musemodeller. Musmodeller har allerede ført til en række nye indsigter i BD-relateret forskning7,8,9.

mens de første modeller for BD-forskning i det11,1220. Det tog yderligere 14 år, før en murine model af BD blev første gang offentliggjort af Wien-gruppen i 20106. Selv om hvert enkelt skridt ikke er udfordrende for en uddannet mikrokirurg, den model, der er beskrevet her forbliver skrøbelig og kan tage nogle uger at etablere.

Kritiske trin i denne protokol er som følger. Brug sterile engangselementer (især arteriekateteret og tilslutningsrør) for at undgå uønsket immunstimulation. Undgå blodtab, da hypotensive fase kan blive ukontrollabel. Brug små kanyler til blodtryksmåling eller reducere lumen for at undgå blodrefluks. Fastgør ventilationsrøret samt arterielt kanyle for at undgå dislokation, når du drejer musen eller under beslaglæggelse aktivitet. Borehullet må ikke være skarpt kantet og må ikke være for stort. Ballonkatetret skal være i kontakt med borehullet. Ellers hjernevæv kan stikke ud og hindre den tilsigtede elevation i intra-kranietryk. I BD-perioden administreres intravenøs væske støt. Hvis mus bliver hypotensive for tidligt i processen (MAP < 50 mmHg efter 2−3 h), yderligere væske genoplivning er usandsynligt, at give vedvarende vedligeholdelse af blodtrykket.

De fleste problemer opstod under BD induktion via ballonkatetret selv eller blev indlysende i løbet af BD periode. Det fælles endepunkt for alle unøjagtigheder vil være hypotension trods væskeadministration. Afhængigt af blodtrykstabiliteten kan BD-varighed forlænges eller forkortes. I litteraturen er der gennemført varierende perioder fra 3-6 timer6,7,8. Succesen med BD induktion kan også variere mellem forskellige musestammer. Selvom anatomiske varianter mellem musstammer bør begrænses, var vi ikke i stand til at etablere den samme model i BALB/c mus. Selv om indsatsen var begrænset til kun få mus og ingen andre stammer blev testet, anbefaler vi brug af C57BL/6, som har været anvendt i de fleste tidligere forskning8,9. Forfatterne har ingen tilfredsstillende forklaring på, hvorfor modellen ikke virkede i BALB / c stamme.   Kun én publikation har hidtil vist en BD-model ved hjælp af store (35 g) kvindelige OF-1 mus6.

Sammenfattende repræsenterer den musemodel, der er beskrevet her, et værdifuldt værktøj til at studere et væld af patofysiologiske ændringer forårsaget af BD. Selvom udfordrende, kan modellen optimeres inden for en rimelig tidsramme og udføres på en standardiseret måde med en høj succesrate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

N.a.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G) BD 391349
Blood Pressure Transducers (APT300) Harvard Apparatus Inc. 73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 Edwards Lifesciences Corporation 120403F
Forceps FST 11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus Inc. 55-7020
Ketansol Graeub 6680110
Micro scissor FST 15018-10
Needle holder FST 12060-02
Prolene 5-0 Ethicon 8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single Harvard Apparatus Inc. 70-4500
Scissor FST 14075-11
Stereotactic microscope Olympus SZX7
Transpore Tape 3M 1527-1
Underpads Molinea.A 274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845) Harvard Apparatus Inc. 73-0043
Xylasol Graeub 7630109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19 (2019).
  2. The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
  3. Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
  4. Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
  5. Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
  6. Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
  7. Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
  8. Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
  9. Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
  10. Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
  11. Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
  12. Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
  13. Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).

Tags

Neurovidenskab Udgave 158 transplantation hjernedød organdonation murine blodtryksmåling trakeostomi
Hjernedødinduktion hos mus ved hjælp af intraarteriel blodtryksovervågning og ventilation via tracheostomi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ritschl, P. V., Hofhansel, L.,More

Ritschl, P. V., Hofhansel, L., Flörchinger, B., Oberhuber, R., Öllinger, R., Pratschke, J., Kotsch, K. Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy. J. Vis. Exp. (158), e60831, doi:10.3791/60831 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter