Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Hjernedødinduksjon hos mus ved hjelp av intraarteriell blodtrykksovervåking og ventilasjon via trakeostomi

Published: April 17, 2020 doi: 10.3791/60831
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en murine modell av hjernedød induksjon for å evaluere påvirkning av sine patofysiologiske effekter på organer samt på påfølgende grafts i sammenheng med solid organtransplantasjon.

Abstract

Mens både levende donasjon og donasjon etter sirkulasjonsdød gir alternative muligheter for organtransplantasjon, representerer donasjon etter donorhjernedød (BD) fortsatt den viktigste kilden for solide transplantasjoner. Dessverre er det irreversible tapet av hjernefunksjon kjent for å indusere flere patofysiologiske endringer, inkludert hemodynamiske samt hormonelle modifikasjoner, som til slutt fører til en systemisk inflammatorisk respons. Modeller som tillater en systematisk undersøkelse av disse effektene in vivo er knappe. Vi presenterer en murine modell av BD induksjon, som kan hjelpe undersøkelser i de ødeleggende effektene av BD på allograft kvalitet. Etter implementering av intraarteriell blodtrykksmåling via den vanlige halspulsåren og pålitelig ventilasjon via trakeostomi, induseres BD ved å stadig øke intrakranielt trykk ved hjelp av et ballongkateter. Fire timer etter BD induksjon, organer kan høstes for analyse eller for ytterligere transplantasjon prosedyrer. Vår strategi muliggjør omfattende analyse av donor BD i en murine-modell, noe som gir en grundig forståelse av BD-relaterte effekter i solid organtransplantasjon og potensielt banet vei for optimalisert organprekondisjonering.

Introduction

Transplantasjon er for tiden den eneste kurative behandlingen for organsvikt i sluttfasen. Inntil nå har hjernedød (BD) pasienter vært den viktigste kilden for organdonasjoner, selv om levende donasjon og donasjon etter sirkulasjonsdød er verdifulle alternativer1. BD er definert av en irreversibel koma (med en kjent årsak), fravær av hjernestammenreflekser og apné2. Dessverre viser BD-organer dårligere resultater i langsiktig graft overlevelse uavhengig av humant leukocytter antigen (HLA)-mismatch og kald iskemisk tid3. I mellomtiden har intensiv forskning på denne antigenuavhengige risikofaktoren blitt utført, noe som resulterer i tre hovedaspekter av patofysiologiske endringer mediert som følge av BD: hemodynamisk, hormonell og inflammatorisk4.

Til dags dato har eksperimentelle BD-modeller hos gnagere for det meste blitt utført ved hjelp av rotter. For å få større innsikt i de immunologiske konsekvensene på faste organer etter BD, hadde vi som mål å etablere en murinemodell av BD, da foreløpig bare musemodeller tillater omfattende undersøkelser av genetiske eller immunologiske faktorer. I denne sammenheng gir musesystemet et større utvalg av analytiske verktøy.

Prinsippet om BD induksjon som beskrevet her er basert på en økning i intrakranielt trykk indusert av inflasjonen av et ballongkateter satt inn under skallen. Økt intrakranielt trykk etterligner den fysiologiske mekanismen til BD ved å blokkere perfusjonen av cerebrum, lillehjernen og hjernestammen5,6. For å garantere tilstrekkelig perfusjon av perifere organer, er blodtrykksmåling obligatorisk under prosedyren. Kateteret som brukes til dette formålet samtidig tjener for saltvannsadministrasjon for å stabilisere blodtrykket ved væskesubstitusjon. Ettersom BD ledsages av opphør av spontan pusting, må tilstrekkelig ventilasjon sikres. Et elektrisk teppe opprettholder fysiologisk kjernekroppstemperatur.

Oppsummert vil denne modellen muliggjøre grundige studier på påvirkning av BD-indusert skade, på leukocytter migrasjon7, kompliment aktivering8, iskemisk reperfusjon skade9, og andre faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøk ble utført i samsvar med prinsippene for laboratoriedyromsorg formulert av National Society for Medical Research og Guide for care and use of Laboratory Animals utarbeidet av National Academy of Science og utgitt av National Institutes of Health (NIH Publication No. 86-23, revidert 1985). Alle eksperimenter ble godkjent av det østerrikske departementet for utdanning, vitenskap og kultur (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Arteriell kateterisering

  1. Bedøve musen med en intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin10 og et smertestillende middel i henhold til lokal praksis (f.eks buprenorfin).  Klyp baklemmer med tang for å bekrefte riktig dybde av anestesi.
    MERK: For denne studien ble mannlige C57BL/6N-mus i en alder av 8–12 uker brukt (vekt 20–25 g). Forfatterne har testet mannlige BALB/c i samme alder uten hell, men har ikke prøvd andre stammer (se Diskusjon).
  2. Fjern håret i regionene av interesse (hode, nakke) ved hjelp av en elektrisk barberhøvel. Sørg for at det ikke forblir løst hår for å unngå sårkontaminering. Deretter desinfisere retisering av det kirurgiske feltet med 70% etanol / klorhexidin / betadin og plasser musen supine med hodet mot kirurgen.
  3. Lag en cervical midline snitt med dissekerende saks.
  4. Dissekere submandibular kjertler og nakke muskelvev og skille dem for å utsette den vanlige halspulsåren. Bruk for det meste sløv disseksjon via tang.
  5. Plass tre 8-0 silke ligaturer under høyre vanlige halspulsåren.
  6. Plasser en klemme på den proksimale ligaturen og bringe spenning i arterien slik at strømmen er suspendert.
  7. Lukk den mest distale ligaturen.
  8. Sett arteriekateteret gjennom et lite, forhåndsformet hudhull på kranialaspektet av snittet. Klem og deformer kateterets lumen hvis det ser for stort ut til å redusere tilbakestrømningen av blodet. Fikser med alle tre ligaturene.
  9. Fest kateteret til huden for å unngå forvridning. Gjør dette ved hjelp av en sutur (f.eks. 5-0 monofilament, ikke-absorberbar) som kobler kateteret til huden i området av det forhåndsformede hudhullet.

2. Trakeostomi

  1. Dissekere pre-tracheal muskulaturen rett ut ved hjelp av tang.
  2. Plasser to 8-0 silke ligaturer under luftrøret.
  3. Tracheotomize ved hjelp av mikrosaks så proksiformelt som mulig for å unngå ensidig ventilasjon. Bruk en horisontal skjærelinje mellom to trakealbrusk.
  4. Sett inn ventilasjonsrøret og fest med begge forberedte ligaturer.
    MERK: Den proksimale enden av luftrøret trenger ikke å bli ligated.
  5. Lukk huden med en løpende sutur (f.eks. 6-0 monofilament, ikke-absorberbar).
  6. Ventiler musen med en frekvens på 150/min og et tidevannsvolum på 200 μL.

3. Hjernedød induksjon

  1. Ordne musen til utsatt posisjon.
  2. Fjern huden fra skallen ved hjelp av kirurgisk saks og tang for å holde huden.
  3. Bor et 1 mm kaliber borehull paramedialt over venstre parietal cortex. Slutt å bore før du bryter det indre kompakte beinet og dura mater.
  4. Tren inn i den endelige vevsbroen i skallen ved hjelp av stumpe tang, og fjern skarpe kanter.
  5. Sett inn ballongkateteret, slik at det er helt innenfor kranialhulen. Sørg for at ballongen er ferdigfylt med saltvann og all luft er evakuert.
  6. Begynn inflasjonen på ~ 0,1 ml/min over en periode på 10–15 min (totalt volum på 0,8–1,2 ml) ved hjelp av en sprøytepumpe.
    MERK: Musen vil vise myoklonus, mydriasis, ytterligere anfallsaktivitet og agonale gisp.
  7. Uttale musen hjernen død når halen av musen har gått stiv og reist.
    MERK: BD bekreftes av en karakteristisk startblodtrykkstopp (Cushing refleks), fravær av hjernestammereflekser og spontan pusting. Regelmessig apnétesting bør unngås under eksperimenter, da mus kan bli sirkulasjonsinstabil på grunn av mangel på oksygen.
  8. Stopp inflasjonen av ballongkateteret.
  9. Sett et varmeteppe over musen for å unngå hypotermi.

4. I løpet av BD-perioden

  1. Overvåk og dokumenter blodtrykket regelmessig. Ekskluder mus med en langvarig hypotensiv fase (gjennomsnittlig arterielt trykk [MAP] < 50 mmHg i > 30 min).
  2. Infuse 0,1 ml saltvann hver 30.
    MERK: Totalt ble 0,8 ml saltvann administrert til hver mus i denne studien.
  3. Etter 4 timer bd varighet, høste museorganer / vev. Ekskluder musen fra eksperimentet hvis hjertet av musen ikke slår på slutten av eksperimentet.

5. Sham prosedyre

  1. Utfør trinn 1.1−3.3.
    MERK: Ikke åpne det indre kompakte benet. Ikke sett inn eller blås opp et ballongkateter.
  2. Hold deg nær musen og følg dyret kontinuerlig. Klem gjentatte ganger baklemmer med tang for å bekrefte riktig dybde av anestesi. Påfør ekstra anestesi subkutant (ca. 1/2 av startdosen) hvis musen viser tegn på oppvåkning, som, etter vår erfaring, skjer omtrent etter 2-3 h post-anestesi.
  3. Påfør samme mengde intravenøs saltvann som i BD-musene.
    MERK: Sham musen vil gjenvinne spontan pust etter opphør av ventilasjon. BD-musen vil ikke. Apnétesting bør gjøres under etablering av modellen, men under eksperimenter bør det unngås på grunn av unødvendig fysiologisk stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murine BD-modellen ble utført mer enn 100 ganger med en suksessrate på over 90%. I tillegg har post intervensjonsorgantransplantasjon av hjerte og nyre blitt trygt utført7.

BD induserer en rekke patofysiologiske endringer som kan undersøkes ytterligere ved hjelp av denne modellen. Som vist i figur 1viser blodtrykket en innledende hypertensiv topp etterfulgt av en langvarig hypotensiv fase. For å unngå skadelige fysiologiske effekter av hypotensjon, ble mus med langvarig utilstrekkelig blodtrykk (MAP < 50 mmHg i mer enn 30 min) utelukket.

En annen veletablert observasjon er at BD induksjon fører til aktivering av immunsystemet. Etter 4 t bd varighet organ-spesifikk upregulation av immunmarkører på mRNA nivå (Figur 2) samt immuncellemigrasjon ble observert7.

Figure 1
Figur 1: Invasiv måling av gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) etter BD induksjon eller svindelprosedyre. På tidspunktet for BD induksjon, blodtrykket var betydelig høyere i BD dyr (hvite firkanter) enn i falske dyr (svarte firkanter) som forklares via den godt beskrevne cytokin storm; Deretter ble normalisering av blodtrykksnivået tydelig etterfulgt av en periode med fallende trykknivåer som starter etter 90 min med BD induksjon (n = 19 dyr/gruppe ± SD). Statistisk signifikante forskjeller ble testet med toveis ANOVA og Bonferroni etter testen; **p < 0,01, ***p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: BD induksjon aktiverer immunsystemet og forårsaker direkte organskade før transplantasjon. Vi viser representative resultater av den naturlige cytotoksisiteten som utløser reseptor 1 (NCR1 også NK-p46), som øker i nyrene som følge av BD på mRNA-nivå. Ingen endringer ble observert i lever eller hjerter. Data presenteres som gjennomsnitt ± SE på n = 7-8 dyr/gruppe. Statistisk signifikante forskjeller mellom BD og sham ble testet ved hjelp av Mann-Whitney U-test; **p = 0,0037. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BD, en risikofaktor for allograftkvalitet hos multiorgandonorer, innebærer en mengde patofysiologiske endringer, som bare kan vurderes tilstrekkelig ved bruk av in vivo-modeller. Hemodynamiske endringer, cytokinstorm, hormonelle endringer og deres ultimate innvirkning på organgraftkvalitet og overlevelse kan ikke analyseres in vitro4. Flertallet av grunnleggende transplantasjon samt immunologisk forskning er avhengig av sofistikerte diagnostiske verktøy, som er allment tilgjengelig bare i mus modeller. Mus modeller har allerede ført til en rekke nye innsikt i BD-relatert forskning7,8,9.

Mens på 1900-tallet ble de første modellene for BD-forskning utviklet i bavianer, hunder og griser11,12, det var ikke før 1996 da den første rottemodellen ble beskrevet13. Det tok ytterligere 14 år før en murine modell av BD først ble publisert av Wien-gruppen i 20106. Selv om hvert enkelt trinn ikke er utfordrende for en utdannet mikrokirurg, forblir modellen som er beskrevet her, skjør og kan ta noen uker å etablere.

Kritiske trinn i denne protokollen er som følger. Bruk sterile engangsartikler (spesielt arterielt kateter og tilkoblingsrør) for å unngå uønsket immunstimulering. Unngå blodtap som hypotensive fase kan bli ukontrollerbar. Bruk små kanyler for blodtrykksmåling eller reduser lumen for å unngå blodrefluks. Fest ventilasjonsrøret samt arteriell kanyle for å unngå forvridning når du vrir musen eller under anfallsaktivitet. Borehullet må ikke være skarpt kantet og bør ikke være for stort. Ballongkateteret skal være i kontakt med borehullet. Ellers kan hjernevev stikke ut og hindre den tiltenkte økningen i intrakranielt trykk. I bd-perioden, administrer intravenøs væske jevnt. Hvis mus blir hypotensive for tidlig i prosessen (MAP < 50 mmHg etter 2-3 h), er det lite sannsynlig at ytterligere væskegjenoppliving gir vedvarende vedlikehold av blodtrykket.

De fleste problemene oppstod under BD-induksjon via selve ballongkateteret eller ble tydelig i løpet av BD-perioden. Det vanlige endepunktet for alle unøyaktigheter vil være hypotensjon til tross for væskeadministrasjon. Avhengig av blodtrykksstabiliteten kan BD-varighet forlenges eller forkortes. I litteraturen er varierende perioder fra 3-6 timer implementert6,7,8. Suksessen til BD induksjon kan også variere mellom ulike musestammer. Selv om anatomiske varianter mellom musstammer skulle begrenses, var vi ikke i stand til å etablere samme modell i BALB/c-mus. Selv om innsatsen var begrenset til bare få mus og ingen andre stammer ble testet, anbefaler vi bruk av C57BL/6, som har blitt brukt i de fleste tidligere forskning8,9. Forfatterne har ingen tilfredsstillende forklaring på hvorfor modellen ikke fungerte i BALB /c belastning.   Bare én publikasjon har så langt vist en BD-modell ved hjelp av store (35 g) kvinnelige OF-1 mus6.

Oppsummert representerer musemodellen som er beskrevet her et verdifullt verktøy for å studere en rekke patofysiologiske endringer forårsaket av BD. Selv om den er utfordrende, kan modellen optimaliseres innen rimelig tid og utføres på en standardisert måte med høy suksessrate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

i.a.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G) BD 391349
Blood Pressure Transducers (APT300) Harvard Apparatus Inc. 73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 Edwards Lifesciences Corporation 120403F
Forceps FST 11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus Inc. 55-7020
Ketansol Graeub 6680110
Micro scissor FST 15018-10
Needle holder FST 12060-02
Prolene 5-0 Ethicon 8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single Harvard Apparatus Inc. 70-4500
Scissor FST 14075-11
Stereotactic microscope Olympus SZX7
Transpore Tape 3M 1527-1
Underpads Molinea.A 274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845) Harvard Apparatus Inc. 73-0043
Xylasol Graeub 7630109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19 (2019).
  2. The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
  3. Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
  4. Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
  5. Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
  6. Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
  7. Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
  8. Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
  9. Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
  10. Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
  11. Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
  12. Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
  13. Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 158 transplantasjon hjernedød organdonasjon murine blodtrykksmåling trakeostomi
Hjernedødinduksjon hos mus ved hjelp av intraarteriell blodtrykksovervåking og ventilasjon via trakeostomi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ritschl, P. V., Hofhansel, L.,More

Ritschl, P. V., Hofhansel, L., Flörchinger, B., Oberhuber, R., Öllinger, R., Pratschke, J., Kotsch, K. Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy. J. Vis. Exp. (158), e60831, doi:10.3791/60831 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter