Summary
Katı organ nakli bağlamında patofizyolojik etkilerinin organlar ve ardışık greftler üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla beyin ölümü indüksiyonunun bir murine modelini satıyoruz.
Abstract
Dolaşım dan sonra hem canlı bağış hem de bağış organ nakli için alternatif fırsatlar sağlarken, donör beyin ölümü (BD) sonrası bağış hala katı nakiliçin ana kaynağı temsil etmektedir. Ne yazık ki, beyin fonksiyonunun geri dönüşümsüz kaybı birden fazla patofizyolojik değişikliklere neden olduğu bilinmektedir, hemodinamik yanı sıra hormonal değişiklikler de dahil olmak üzere, nihayet sistemik inflamatuar yanıta yol açan. Bu etkilerin in vivo sistematik bir araştırma sağlayan modeller azdır. BD indüksiyonunun allograft kalitesi üzerindeki yıkıcı etkilerinin araştırılmasına yardımcı olabilecek bir murine modeli salıyoruz. Ortak karotis arter ve trakeostomi ile güvenilir ventilasyon yoluyla intra-arteriyel kan basıncı ölçümü uygulandıktan sonra, BD bir balon kateter kullanılarak sürekli artan intrakranial basınç tarafından indüklenir. BD indüksiyonundan dört saat sonra, organlar analiz veya daha ileri nakil işlemleri için hasat edilebilir. Stratejimiz, donör BD'nin bir murine modelinde kapsamlı analizini sağlar, bu nedenle katı organ naklinde BD ile ilgili etkilerin derinlemesine anlaşılmasını sağlar ve potansiyel olarak optimize edilmiş organ ön koşullandırmasının önünü açar.
Introduction
Transplantasyon şu anda son dönem organ yetmezliği için tek küratif tedavi yöntemidir. Şimdiye kadar, beyin ölümü (BD) hastalar organ bağışları için ana kaynak olmuştur, dolaşım ölüm sonrası yaşayan bağış ve bağış değerli alternatifler olmasına rağmen1. BD geri dönüşümsüz koma ile tanımlanır (bilinen bir nedeni ile), beyin sapı refleksleri ve apne yokluğu2. Ne yazık ki, BD organları insan lökosit antijenbağımsız uzun vadeli greft sağkalım inferior sonuçlar göstermek (HLA)-uyumsuzluk ve soğuk iskemik zaman3. Bu arada, bu antijen-bağımsız risk faktörü üzerinde yoğun araştırma bd bir sonucu olarak aracılık patofizyolojik değişikliklerin üç ana yönü ile sonuçlanan yapılmıştır: hemodinamik, hormonal, ve inflamatuar4.
Bugüne kadar, kemirgenlerde deneysel BD modelleri çoğunlukla sıçanlar kullanılarak yapılmıştır. BD'den sonra katı organlar üzerindeki immünolojik sonuçlar hakkında daha fazla bilgi edinmek için, şu anda sadece fare modelleri genetik veya immünolojik faktörler üzerinde kapsamlı araştırmalara olanak sağlarken, BD'nin bir murine modelini oluşturmayı amaçladık. Bu bağlamda, fare sistemi analitik araçlar daha geniş bir çeşitlilik sağlar.
Burada açıklandığı gibi BD indüksiyon prensibi kafatası altına yerleştirilen bir balon kateter enflasyon uğrama kaynaklanan intrakranial basınç artışı dayanmaktadır. Artmış intrakranial basınç beyin perfüzyonu engelleyerek BD fizyolojik mekanizması taklit, beyincik, ve beyin sapı5,6. Periferik organların yeterli perfüzyonu garanti etmek için işlem sırasında kan basıncı ölçümü zorunludur. Bu amaçla aynı zamanda kullanılan kateter sıvı ikamesi ile kan basıncını stabilize etmek için tuzlu uygulama için hizmet vermektedir. BD'ye spontan solunumun kesilmesi eşlik ettiği için yeterli ventilasyon sağlanmalıdır. Elektrikli battaniye fizyolojik çekirdek vücut ısısını korur.
Özetle, Bu model BD kaynaklı yaralanma etkisi içine derinlemesine çalışmalar sağlayacak, lökosit göç7, iltifat aktivasyon8, iskemik reperfüzyon yaralanması9, ve diğer faktörler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri ve Ulusal Bilim Akademisi tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır (NIH Yayın No. 86-23, revize 1985). Tüm deneyler Avusturya Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Arteriyel kateterizasyon
- Ketamin ve ksilazin10 intraperitoneal enjeksiyon ve yerel uygulamaya göre bir analjezik ile fare anestezi (örneğin buprenorfin). Anestezinin doğru derinliğini doğrulamak için arka ekstremiteleri forceps ile sıkıştırın.
NOT: Bu çalışmada 8−12 haftalık erkek C57BL/6N fareler kullanıldı (ağırlık 20−25 g). Yazarlar aynı yaştaki erkek BALB/c'yi başarısız bir şekilde test etmişler ancak diğer suşları denemediler (bkz. - Bir elektrikli jilet kullanarak ilgi bölgelerinde (baş, boyun) saç çıkarın. Yara kontaminasyonunu önlemek için gevşek saç kalıntıları olmadığından emin olun. Daha sonra cerrahi alanı %70 etanol/klorheksidin/ betadin ile dezenfekte edin ve fare omurgasını baş cerraha bakacak şekilde yerleştirin.
- Diseksiyon makası ile servikal orta hat kesisi yapın.
- Submandibular bezleri ve boyun kas dokusunu inceleyin ve ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için ayırın. Çoğunlukla forceps ile künt diseksiyon kullanın.
- Üç yer le 8-0 sağ ortak karotis arter altında ipek ligatürler.
- Proksimal ligatür bir kıskaç yerleştirin ve akış askıya böylece arter gerginlik getirmek.
- En distal ligatürü kapatın.
- Arteriyel kateteri kesiğin kraniyal kısmında ki küçük, önceden biçimlendirilmiş bir deri deliğinden takın. Sıkın ve kan geri akışını azaltmak için çok büyük görünüyorsa kateter lümen deforme. Üç bağla da sabitle.
- Çıkık önlemek için cilde kateter sabitle. Bunu, kateteri önceden biçimlendirilmiş cilt deliği alanında cilde bağlayan bir dikiş (örn. 5-0 monofilament, emilemez) kullanarak yapın.
2. Trakeostomi
- Ön trakeal kasları nispler kullanarak açıkça inceleyin.
- İki 8-0 yerleştirin trakeanın altındaki ipek bağlar.
- Tek taraflı havalandırmayı önlemek için mikro makas kullanarak mümkün olduğunca yakın trakeotomize. İki trakeal kıkırdak arasında yatay bir kesme hattı kullanın.
- Havalandırma tüpünü takın ve her iki hazırlanan ligatürler ile fiksat.
NOT: Trakeanın proksimal ucunun ligated edilmesigerekmez. - Çalışan bir dikiş ile cildi kapatın (örneğin, 6-0 monofilament, emilemez).
- Fareyi 150/dk frekansı ve 200 μL'lik gelgit hacmi ile havalandırın.
3. Beyin ölümü indüksiyonu
- Fareyi eğilimli konuma getirin.
- Cerrahi makas ve cilt tutmak için forceps kullanarak kafatası deri çıkarın.
- Sol parietal korteksin üzerinde paramedial olarak 1 mm kalibrelik bir sondaj deliği delin. İç kompakt kemiği ve dura mater'i delmeden önce delmeyi durdurun.
- Keskin kenarları kaldırarak, künt forceps kullanarak kafatasının son doku köprü nüfuz.
- Balon kateteri takın, böylece tamamen kafatası boşluğu içinde olur. Balonun tuzlu suyla önceden doldurulduğundan ve tüm havanın boşaltılmış olduğundan emin olun.
- 10−15 dk (toplam hacim 0,8−1,2 mL) bir şırınga pompası yardımıyla ~0,1 mL/dk'dan başlayan enflasyona başlayın.
NOT: Farede miyoklonus, midriazis, daha fazla nöbet aktivitesi ve agonal gasp lar yer alacaktır. - Farenin kuyruğu sertleştikten ve dikildikten sonra farenin beyninin öldüğünü telaffuz edin.
NOT: BD karakteristik bir ilk kan basıncı zirvesi ile doğrulanır (Cushing refleks), beyin sapı refleksleri ve spontan solunum yokluğu. Fareler oksijen eksikliği nedeniyle dolaşım dengesiz hale gelebilir gibi düzenli apne testi deneyler sırasında kaçınılmalıdır. - Balon kateterinin şişirmesini durdurun.
- Hipotermi önlemek için fare üzerine bir ısıtma battaniye sokul.
4. BD döneminde
- Kan basıncını düzenli olarak izleyin ve belgeleyebilirsiniz. Uzun süreli hipotansif faza sahip fareleri hariç trafbe edin (ortalama arterbasıncı [MAP] < 50 mmHg for >30 dk).
- Farenin kan basıncını dengelemek için her 30 dakikada bir 0,1 mL tuzlu su aşındırın.
NOT: Bu çalışmada her fareye toplam 0,8 mL tuzlu luk uygulandı. - BD süresinin 4 saat sonra fare organları/ dokuları hasat. Farenin kalbi denemenin sonunda atmıyorsa fareyi denemeden hariç tinler.
5. Sham prosedürü
- 1.1−3.3 adımlarını gerçekleştirin.
NOT: İç kompakt kemiği açmayın. Balon kateteri takmayın veya şişirmeyin. - Fareye yakın durun ve hayvanı sürekli gözlemleyin. Anestezinin doğru derinliğini doğrulamak için arka ekstremiteleri tekrar tekrar piştürür. Farede uyanış belirtileri gösteriyorsa (başlangıç dozunun yaklaşık 1/2'si) ek anestezi uygulayın, ki bu da deneyimlerimize göre anestezi sonrası 2−3 saat sonra yaklaşık olarak gerçekleşir.
- BD farelerde olduğu gibi intravenöz salin aynı miktarda uygulayın.
NOT: Sahte fare ventilasyon kesildikten sonra spontan solunumu yeniden kazanır. BD fare olmaz. Apne testi modeli oluştururken yapılmalıdır, ancak deneyler sırasında gereksiz fizyolojik stres nedeniyle kaçınılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine BD modeli başarıyla% 90 üzerinde bir başarı oranı ile 100'den fazla kez yapıldı. Ayrıca, kalp ve böbrek girişimsel organ nakli sonrası güvenli bir şekilde7gerçekleştirilmiştir.
BD bu model kullanılarak daha fazla araştırılabilir patofizyolojik değişiklikler çeşitli neden olur. Şekil 1'degösterildiği gibi, kan basıncı ilk hipertansif zirveyi ve ardından uzun süreli hipotansif fazı gösterir. Hipotansiyonun zararlı fizyolojik etkilerini önlemek için, uzun süreli yetersiz kan basıncına sahip fareler (MAP < 30 dk'dan fazla 50 mmHg) dışlandı.
Başka bir köklü gözlem BD indüksiyon bağışıklık sisteminin aktivasyonu yol açar. 4 h sonra BD süresi organspesifik upregülasyonu ndan sonra mRNA düzeyinde immün belirteçlerin(Şekil 2)yanı sıra bağışıklık hücresi göçügözlenmiştir 7.
Şekil 1: BD indüksiyonu veya sham işlemini takiben ortalama arteriyel basıncın (MAP) invaziv ölçümü. BD indüksiyon zaman noktasında, kan basıncı önemli ölçüde bd hayvanlarda daha yüksekti (beyaz kareler) sahte hayvanlar (siyah kareler) hangi iyi tarif sitokin fırtına ile açıklanmıştır; Daha sonra kan basıncı seviyelerinin normalleşmesi ve ardından 90 dk BD indüksiyonundan sonra başlayan basınç seviyelerinin azaldığı bir dönem (n = 19 hayvan/grup ± SD) belirginhale geldi. İstatistiksel olarak anlamlı farklar iki yönlü ANOVA ve Bonferroni testi sonrası test ile test edildi; **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BD indüksiyonu bağışıklık sistemini aktive eder ve transplantasyon öncesinde doğrudan organ hasarına neden olur. MRNA düzeyinde BD sonucu böbreklerde artış gösteren doğal sitotoksisite tetikleyici reseptör 1 (NCR1 ayrıca NK-p46) sonuçlarını gösteriyoruz. Karaciğerlerde veya kalplerde herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Veriler n = 7−8 hayvan/grubun ortalama ± SE'si olarak sunulur. BD ve sham arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklar Mann-Whitney U-testi kullanılarak test edildi; **p = 0.0037. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multi-organ donörlerinde allogreft kalitesi için bir risk faktörü olan BD, in vivo modelleri kullanılarak yeterince değerlendirilebilen patofizyolojik değişiklikler gerektirir. Hemodinamik değişiklikler, sitokin fırtınası, hormonal değişiklikler ve organ grefti kalitesi ve sağkalım üzerindeki nihai etkileri in vitro4analiz edilemez. Temel transplantasyonun ve immünolojik araştırmaların çoğu, sadece fare modellerinde yaygın olarak bulunan gelişmiş tanı araçlarına bağlıdır. Fareler modelleri zaten BD ile ilgili araştırma7,8,8,9yeni anlayışlar çeşitli yol açmıştır.
20. yüzyılda BD araştırma için ilk modeller babun, köpek ve domuz11,12geliştirilmiş iken, ilk sıçan modeli13açıklandığı 1996 yılına kadar değildi . BD bir murine modeli ilk Viyana grubu tarafından 20106yılında yayınlanan kadar daha 14 yıl sürdü. Her adım eğitimli bir mikrocerrah için zor olmasa da, burada açıklanan model kırılgan kalır ve kurmak için birkaç hafta sürebilir.
Bu protokolün kritik adımları aşağıdaki gibidir. İstenmeyen bağışıklık stimülasyonu önlemek için steril tek kullanımlık öğeleri (özellikle arteriyel kateter ve bağlantı tüpleri) kullanın. Hipotansif faz kontrol edilemez hale gelebilir gibi herhangi bir kan kaybını önlemek. Kan basıncı ölçümü için küçük kanüller kullanın veya kan reflü önlemek için lümen azaltmak. Fareyi çevirirken veya nöbet aktivitesi sırasında çıkıktan kaçınmak için ventilasyon tüpünü ve arteriyel kanülünü düzeltin. Sondaj deliği keskin kenarlı olmamalı ve çok büyük olmamalıdır. Balon kateteri sondaj deliğiyle temas etmeli. Aksi takdirde beyin dokusu çıkıntı ve intra-kranial basınçta amaçlanan yükseklik engelleyebilir. BD-döneminde, sürekli intravenöz sıvı uygulayın. Fareler işlemin çok erken saatlerinde hipotansif hale gelirse (MAP < 2−3 saat sonra 50 mmHg), ek sıvı resüsitasyonunun kan basıncının sürekli bakımını sağlaması olası değildir.
Çoğu sorun balon kateter kendisi üzerinden BD indüksiyon sırasında meydana geldi veya BD dönemi boyunca belirgin oldu. Tüm yanlışlıkların ortak bitiş noktası sıvı uygulamasına rağmen hipotansiyon olacaktır. Kan basıncı stabilitesi bağlı olarak, BD süresi uzatılabilir veya kısaltılabilir. Literatürde, 3−6 h arasında değişen dönemler 66,7,8uygulanmıştır. BD indüksiyonunun başarısı farklı fare suşları arasında da farklılık gösterebilir. Fare suşları arasındaki anatomik varyantlar sınırlı olsa da BALB/c farelerinde aynı modeli oluşturabildik. Çaba sadece birkaç fare ile sınırlı olmasına ve başka suşları test edilmiş olmasına rağmen, biz C57BL/6, en önceki araştırma8,,9kullanılmıştır kullanımını öneririz. Yazarlar model BALB / c zorlanma işe yaramadı neden tatmin edici bir açıklama var. Sadece bir yayın şimdiye kadar büyük (35 g) kadın OF-1 fareler6kullanarak bir BD modeli göstermiştir.
Özetle, burada açıklanan fare modeli BD'nin neden olduğu çok sayıda patofizyolojik değişimi incelemek için değerli bir aracı temsil eder. Zorlu olsa da, model makul bir zaman dilimi içinde optimize edilebilir ve yüksek başarı oranı ile standart bir şekilde gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Navdar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19 (2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
