Summary
Vi presenterar en murine modell av hjärnan död induktion för att utvärdera påverkan av dess patofysiologiska effekter på organ samt på varandra följande ympkvistar i samband med fasta organ transplantation.
Abstract
Medan både levande donation och donation efter cirkulationsdöd ger alternativa möjligheter till organtransplantation, donation efter givaren hjärndöd (BD) fortfarande den största källan för fasta transplantationer. Tyvärr är den irreversibla förlusten av hjärnans funktion känd för att inducera flera patofysiologiska förändringar, inklusive hemodynamic samt hormonella modifieringar, slutligen leder till ett systemiskt inflammatoriskt svar. Modeller som möjliggör en systematisk undersökning av dessa effekter in vivo är knappa. Vi presenterar en murine modell av BD induktion, som kan hjälpa undersökningar av de förödande effekterna av BD på allograft kvalitet. Efter att ha genomfört intraarteriell blodtrycksmätning via den gemensamma halspulsådern och tillförlitlig ventilation via en trakeostomi, BD induceras av stadigt ökande intrakraniellt tryck med hjälp av en ballong kateter. Fyra timmar efter BD-induktion kan organ skördas för analys eller för ytterligare transplantationsförfaranden. Vår strategi möjliggör en omfattande analys av givaren BD i en murine modell, vilket möjliggör en fördjupad förståelse av BD-relaterade effekter i solid organtransplantation och potentiellt banar väg för optimerad organkonditionering.
Introduction
Transplantation är för närvarande den enda botande behandling för slutet-steg organsvikt. Hittills har hjärnan död (BD) patienter varit den viktigaste källan för organdonationer, även om levande donation och donation efter cirkulationsdöd är värdefulla alternativ1. BD definieras av en irreversibel koma (med en känd orsak), frånvaron av hjärnstammen reflexer och apné2. Tyvärr, BD organ visar sämre resultat i långsiktiga transplantat överlevnad oberoende av mänskliga leukocyte antigen (HLA)-obalans och kall ischemisk tid3. Under tiden har intensiv forskning om denna antigenoberoende riskfaktor utförts vilket resulterar i tre huvudaspekter av patofysiologiska förändringar medierade som en följd av BD: hemodynamisk, hormonell och inflammatorisk4.
Hittills har experimentella BD-modeller hos gnagare mestadels utförts med råttor. För att få större insikt i de immunologiska konsekvenserna för fasta organ efter BD, syftade vi till att upprätta en murine modell av BD, som för närvarande endast mus modeller möjliggör omfattande undersökningar av genetiska eller immunologiska faktorer. I detta sammanhang ger mussystemet ett större utbud av analysverktyg.
Principen om BD induktion som beskrivs här är baserad på en ökning av intrakraniellt tryck framkallas av inflationen av en ballong kateter införas under skallen. Ökat intrakraniellt tryck härmar den fysiologiska mekanismen för BD genom att blockera perfusion av storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen5,6. För att garantera tillräcklig perfusion av perifera organ är blodtrycksmätning obligatorisk under proceduren. Katetern som används för detta ändamål tjänar samtidigt för saltlösningsadministrering för att stabilisera blodtrycket genom vätskeersättning. Eftersom BD åtföljs av att spontan andning upphör måste tillräcklig ventilation säkerställas. En elektrisk filt upprätthåller fysiologisk kroppstemperatur.
Sammanfattningsvis kommer denna modell att möjliggöra djupgående studier av påverkan av BD-inducerad skada, på leukocyte migration7, komplimangaktivering 8, ischemisk reperfusion skada9, och andra faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes i enlighet med principerna för laboratoriedjurvård som formulerats av National Society for Medical Research och Guide for the Care and Use of Laboratory Animals som utarbetats av National Academy of Science och publicerats av National Institutes of Health (NIH Publikation nr 86-23, reviderad 1985). Alla experiment godkändes av det österrikiska ministeriet för utbildning, vetenskap och kultur (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Arteriell kateterisering
- Bedöva musen med en intraperitoneal injektion av ketamin och xyazine10 och ett smärtstillande medel enligt lokal praxis (t.ex. buprenorfin). Nyp ihop baklemmen med pincett för att bekräfta rätt djup av anestesi.
OBS: För denna studie användes hane C57BL/6N möss vid 8−12 veckors ålder (vikt 20−25 g). Författarna har testat manliga BALB/c i samma ålder utan framgång men har inte provat andra stammar (se Diskussion). - Ta bort håret i de områden av intresse (huvud, hals) med hjälp av en rakhyvel. Se till att inget löst hår finns kvar för att förhindra sårkontaminering. Därefter desinficera operationsfältet med 70% etanol/klorhexidin/ betadin och placera musen supine med huvudet mot kirurgen.
- Gör en cervikal mittlinje snitt med dissekerande sax.
- Dissekera submandibular körtlar och hals muskelvävnad och separera dem för att exponera den gemensamma halspulsådern. Använd mestadels trubbig dissekering via pincett.
- Plats tre 8-0 silke ligaturer under rätt vanliga halspulsådern.
- Placera en klämma på den proximala ligaturen och få spänningar i artären så att flödet är upphängt.
- Stäng den mest distala ligaturen.
- Sätt in arteriell kateter genom ett litet, förformat hudhål på kranialaspekten av snittet. Pressa och deformera kateterns lumen om den verkar för stor för att minska blodflödet. Fixera med alla tre ligaturer.
- Fixera katetern på huden för att undvika förskjutning. Gör detta genom att använda en sutur (t.ex. 5-0 monofilament, icke-absorberbar) som förbinder katetern med huden i området för det förformade hudhålet.
2. Trakeostomi
- Dissekera den pre-trakeal muskulatur rakt på sak med pincett.
- Placera två 8-0 silkeligningar under luftstrupen.
- Tracheotomize med hjälp av mikro sax så proximally som möjligt för att undvika ensidig ventilation. Använd en horisontell skärlinje mellan två trakeal brosk.
- Sätt i ventilationsröret och fixera med båda preparerade ligaturer.
OBS: Den proximala änden av luftstrupen behöver inte ligated. - Stäng huden med en rinnande sutur (t.ex. 6-0 monofilament, icke-absorberbar).
- Ventilera musen med en frekvens på 150/min och en tidvattenvolym på 200 μL.
3. Hjärnan död induktion
- Ordna musen till liggande läge.
- Ta bort huden från skallen med kirurgisk sax och pincett för att hålla huden.
- Borra en 1 mm kaliber borrhål paramedially ovanför den vänstra parietal cortex. Sluta borra innan du bryter mot det inre kompakta benet och dura mater.
- Penetrera den slutliga vävnadsbron i skallen med hjälp av trubbiga pincett, ta bort vassa kanter.
- Sätt in ballongkatetern, så att den är helt inom hjärnskålen. Se till att ballongen är förfylld med saltlösning och att all luft evakueras.
- Börja inflationen på ~0,1 ml/min under en period av 10−15 min (total volym på 0,8−1,2 ml) med hjälp av en sprutpump.
OBS: Musen kommer att uppvisa myoklonier, mydriasis, ytterligare beslag aktivitet och agonal flämtar. - Uttala musen hjärnan död när svansen på musen har gått stel och uppfördes.
OBS: BD bekräftas av en karakteristisk initial blodtryckstopp (Cushing reflex), frånvaron av hjärnstammen reflexer och spontan andning. Regelbundna apnétester bör undvikas under experiment, eftersom möss kan bli cirkulationsbrist på grund av syrebrist. - Stoppa ballongkateterns uppblåsning.
- Sätt en värmefilt över musen för att undvika hypotermi.
4.
- Övervaka och dokumentera blodtrycket regelbundet. Uteslut möss med en långvarig hypotensiv fas (genomsnittligt arteriellt tryck [MAP] < 50 mmHg för >30 min).
- Ingjuta 0,1 ml saltlösning var 30:e minut för att stabilisera musens blodtryck.
OBS: Totalt 0,8 ml saltlösning administrerades till varje mus i denna studie. - Efter 4 h BD-varaktighet, skörda musorgan/vävnader. Uteslut musen från experimentet om musens hjärta inte slår i slutet av experimentet.
5. Sham-förfarande
- Utför steg 1.1−3.3.
OBS: Öppna inte det inre kompakta benet. För inte in eller blås upp en ballongkateter. - Håll dig nära musen och observera djuret kontinuerligt. Upprepade gånger nypa bakbenen med pincett för att bekräfta rätt djup av anestesi. Applicera ytterligare anestesi subkutant (ca 1/2 av startdosen) om musen visar tecken på uppvaknande, vilket enligt vår erfarenhet sker ungefär efter 2−3 h postanestesi.
- Applicera samma mängd intravenös koksaltlösning som i BD-mössen.
OBS: Den falska musen kommer att återfå spontan andning efter upphörande av ventilation. BD-musen kommer inte. Apné testning bör göras samtidigt som modellen, men under experiment bör undvikas på grund av onödig fysiologisk stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine BD-modellen utfördes framgångsrikt mer än 100 gånger med en framgång på över 90%. Dessutom har organtransplantation efter interventionellt 2000-årsgrepp på hjärt- och njure utförts på ett säkert sätt7.
BD inducerar en mängd olika patofysiologiska förändringar som kan undersökas ytterligare med hjälp av denna modell. Som visas i figur 1visar blodtrycket en initial hypertensiv topp följt av en långvarig hypotensiv fas. För att undvika skadliga fysiologiska effekter av hypotension uteslöts möss med långvarigt otillräckligt blodtryck (MAP < 50 mmHg i mer än 30 minuter).
En annan väletablerad iakttagelse är att BD-induktion leder till aktivering av immunsystemet. Efter 4 h av BD varaktighet organ-specifik uppreglering av immun markörer på mRNA-nivå (figur 2) samt immuncell migration observerades7.
Figur 1: Invasiv mätning av genomsnittligt arteriellt tryck (MAP) efter BD-induktion eller simulerat förfarande. Vid tidpunkten för BD induktion, blodtrycket var betydligt högre i BD djur (vita rutor) än i bluff djur (svarta rutor) som förklaras via den välbeskrivna cytokin stormen; Därefter blev normaliseringen av blodtrycksnivåerna uppenbar följt av en period av sjunkande trycknivåer som började efter 90 min BD-induktion (n = 19 djur/grupp ± SD). Statistiskt signifikanta skillnader testades med tvåvägs ANOVA och Bonferroni efter testet. **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BD-induktion aktiverar immunsystemet och orsakar direkta organskador före transplantation. Vi visar representativa resultat av den naturliga cytotoxicitet utlösa receptor 1 (NCR1 också NK-p46), som ökar i njurar som en följd av BD på mRNA-nivå. Inga förändringar observerades i lever eller hjärtan. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SE på n = 7−8 djur/grupp. Statistiskt signifikanta skillnader mellan BD och bluff testades med hjälp av Mann-Whitney U-test; **p = 0,0037. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BD, en riskfaktor för allograft kvalitet hos multiorgandonatorer, medför en uppsjö av patofysiologiska förändringar, som endast kan bedömas tillräckligt med hjälp av in vivo-modeller. Hemodynamic förändringar, cytokin storm, hormonella förändringar och deras slutliga inverkan på organtransplantat kvalitet och överlevnad kan inte analyseras in vitro4. Majoriteten av grundläggande transplantation samt immunologisk forskning är beroende av sofistikerade diagnostiska verktyg, som är allmänt tillgängliga endast i möss modeller. Möss modeller har redan lett till en mängd nya insikter i BD-relaterad forskning7,8,9.
Under 1900-talet utvecklades de första modellerna för BD-forskning i babianer, hundar och grisar11,12, det var inte förrän 1996 då den första råttmodellen beskrevs13. Det tog ytterligare 14 år tills en murine modell av BD först publicerades av Wien gruppen i 20106. Även om varje enskilt steg inte är utmanande för en utbildad mikrokirurg, är den modell som beskrivs här bräcklig och kan ta några veckor att fastställa.
Kritiska steg i det här protokollet är följande. Använd sterila engångsartiklar (särskilt arteriell kateter och anslutningsrör) för att undvika oönskad immunstimulering. Undvik blodförlust eftersom hypotensiv fas kan bli okontrollerbar. Använd små kanyler för blodtrycksmätning eller minska lumen för att undvika blodåterflöde. Fäst ventilationsröret samt den arteriella kanylen för att undvika förskjutning när du vrider på musen eller under anfallsaktivitet. Borrhålet får inte vara vasst och bör inte vara för stort. Ballongkatetern ska komma i kontakt med borrhålet. Annars hjärnvävnad kan sticka ut och hindra den avsedda höjden i intrakraniellt tryck. Under BD-perioden, administrera intravenös vätska stadigt. Om möss blir hypotensiva för tidigt i processen (MAP < 50 mmHg efter 2−3 h), är det osannolikt att ytterligare vätskeåterupplivning ger ett ihållande underhåll av blodtrycket.
De flesta problem uppstod under BD induktion via ballongkatetern själv eller blev uppenbart under loppet av BD perioden. Den gemensamma endpoint av alla felaktigheter kommer att hypotension trots flytande administration. Beroende på blodtrycksstabilitet kan BD-varaktigheten förlängas eller förkortas. I litteraturen har varierande perioder från 3−6 h genomförts6,,7,8. Framgången för BD induktion kan också variera mellan olika mus stammar. Även om anatomiska varianter mellan möss stammar bör begränsas, kunde vi inte fastställa samma modell i BALB/c möss. Även om ansträngningen var begränsad till endast några möss och inga andra stammar testades, rekommenderar vi användning av C57BL/6, som har använts i de flesta tidigare forskning8,9. Författarna har ingen tillfredsställande förklaring till varför modellen inte fungerade i BALB / c stam. Endast en publikation har hittills visat en BD-modell med stora (35 g) hona OF-1 möss6.
Sammanfattningsvis utgör musmodellen som beskrivs här ett värdefullt verktyg för att studera en mängd patofysiologiska förändringar orsakade av BD. Även utmanande, kan modellen optimeras inom en rimlig tidsram och utförs på ett standardiserat sätt med en hög framgång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
ant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19 (2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
