Summary
אנו מציגים דגם murine של אינדוקציה מוות המוח על מנת להעריך את ההשפעה של ההשפעות הפתופיזילוגיות שלה על איברים, כמו גם על שתלים רצופים בהקשר של השתלת איברים מוצק.
Abstract
בעוד תרומת החיים והתרומה לאחר מוות הדם לספק הזדמנויות חלופיות השתלת איברים, תרומה לאחר מוות המוח תורם (BD) עדיין מייצג את המקור העיקרי עבור השתלות מוצק. למרבה הצער, אובדן בלתי הפיך של תפקוד המוח ידוע לגרום לשינויים פתופסלוגיים מרובים, כולל הומודינמיקה כמו גם שינויים הורמונליים, לבסוף מוביל תגובה דלקתית מערכתית. מודלים המאפשרים חקירה שיטתית של תופעות אלה vivo הם נדירים. אנו מציגים מודל murine של האינדוקציה BD, אשר יכול לסייע חקירות לתוך ההשפעות ההרסניות של bd על איכות השתלת. לאחר יישום לחץ דם פנים עורקי מדידה דרך העורק הראשי המשותף אוורור אמין באמצעות הקנה הנשימה, BD נגרמת על ידי הגדלת בהתמדה לחץ תוך גולגולתי באמצעות קטטר בלון. ארבע שעות לאחר האינדוקציה BD, איברים יכולים להיות נקצרו לניתוח או להליכי השתלת נוספת. האסטרטגיה שלנו מאפשרת ניתוח מקיף של התורם BD במודל murine, ולכן מאפשר הבנה מעמיקה של השפעות BD הקשורות השתלת איברים מוצק ופוטנציאל לסלול את הדרך כדי אופטימיזציה האיברים הקדם.
Introduction
השתלת כיום הטיפול המרפא היחיד עבור כשל איבר בשלב הסופי. עד עכשיו, מוות מוחי (BD) מטופלים היו המקור העיקרי לתרומות איברים, למרות התרומה החי והתרומה לאחר מוות הדם הן חלופות ערך1. BD מוגדר על ידי תרדמת בלתי הפיכה (עם סיבה ידועה), העדר רפלקסים גזע המוח דום נשימה2. למרבה הצער, איברי BD להפגין תוצאות נחות לטווח ארוך הישרדות השתלת עצמאית של אנטיגן לוקיציט אנושי (HLA)-חוסר התאמה והזמן איסכמי קר3. בינתיים, מחקר אינטנסיבי על גורם זה אנטיגן הסיכון העצמאי בוצע וכתוצאה מכך שלושה היבטים עיקריים של שינויים פתופסלוגיים מתווך כתוצאה של BD: הומודינמיקה, הורמונלי, ו דלקתיות4.
עד כה, מודלים BD ניסיוני מכרסמים בוצעו בעיקר באמצעות חולדות. כדי לקבל תובנה גדולה יותר על ההשלכות האימונולוגיים על איברים מוצקים לאחר BD, כיוונו להקים מודל מורטין של BD, כמו כרגע רק מודלים העכבר לאפשר חקירה מקיפה לגורמים גנטיים או אימונולוגיים. בהקשר זה, מערכת העכבר מספקת מגוון רחב יותר של כלים אנליטיים.
עקרון האינדוקציה BD כפי שמתואר כאן מבוסס על עלייה בלחץ תוך גולגולתי הנגרמת על ידי האינפלציה של קטטר בלון מוכנס מתחת לגולגולת. לחץ תוך גולגולתי מוגברת מחקה את המנגנון הפיזיולוגי של BD על ידי חסימת זלוף של המוח, המוח החלק, ואת גזע המוח5,6. כדי להבטיח שילוב מספיק של איברים היקפיים, מדידת לחץ הדם היא חובה במהלך ההליך. הקטטר המשמש למטרה זו באותו זמן משמש לניהול מלוחים כדי לייצב את לחץ הדם על ידי החלפת נוזלים. כמו BD מלווה בהפסקת נשימה ספונטנית, יש להבטיח אוורור מספיק. שמיכה חשמלית שומרת על טמפרטורת גוף ליבה פיזיולוגית.
לסיכום, מודל זה יאפשר מחקרים מעמיקים לתוך השפעה של פציעה BD המושרה, על הגירה לוקיציט7, הפעלת מחמאה8, הreperfusion פציעה9, וגורמים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לעקרונות של טיפול בעלי חיים במעבדה שגובשה על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהוכנו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום No. 86-23, תוקן 1985). כל הניסויים אושרו על ידי משרד החינוך, המדע והתרבות האוסטרית (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. צנתור עורקים
- הזרק את העכבר בזריקה תוך-בצפק של קטמין ו-xylazine10 ומשכך כאבים על פי הנוהג המקומי (למשל בופרינורפין). צבוט את הגפיים האחוריות עם מלקחיים כדי לאשר את העומק הנכון של הרדמה.
הערה: למחקר זה, עכברים C57BL/6N בגיל 8 עד 12 שבועות שימשו (משקל 20-25 גרם). המחברים בחנו את BALB/c זכר באותו גיל ללא הצלחה, אך לא ניסו זנים אחרים (ראה דיון). - הסר את השיער באזורי העניין (ראש, צוואר) באמצעות תער חשמלי. ודא כי לא נותר שיער רופף כדי למנוע זיהום הפצע. לאחר מכן לחטא את השדה כירורגי עם 70% אתנול/כלורהקאדין/betadine ומניחים את העכבר פרקדן עם הראש מול המנתח.
- לעשות חתך באמצע הצוואר הצווארי עם מספריים מבתר.
- לנתח את בלוטות הלסת התחתונה ואת רקמת שריר הצוואר ולהפריד אותם כדי לחשוף את עורק הראש המשותף. השתמש בעיקר בניתוח. קהה באמצעות מלקחיים
- . מקום שלוש 8-0 ליגטורות ממשי. מתחת לעורק הראש המשותף הנכון
- מניחים מלחציים על הקשירה האבובית ומביאים מתח בעורק כדי שהזרימה תושהה.
- . תסגור את החיבור המרוחק ביותר
- הכנס את קטטר העורקים דרך חור עור קטן, שנוצר מראש על ההיבט הגולגולתית של החתך. לסחוט ו עוות לומן של הקטטר אם הוא מופיע גדול מדי כדי להפחית את זרימת הדם. מתקבע עם כל שלושת הליגטורות.
- מתיקונים את הקטטר לעור כדי למנוע נקע. עשה זאת על ידי שימוש תפר (למשל, 5-0 מונופינט, לא נספגים) אשר מחבר את הקטטר לעור באזור חור העור טרום המבנה.
2. מסדר קנה מאוזן
- לנתח את השרירים שלפני הקנה. בעזרת מלקחיים
- . מקום שני 8-0 ליגטורות משי מתחת לקנה הנשימה.
- קנה מידה באמצעות מספריים מיקרו ככל האפשר כדי למנוע אוורור חד צדדית. השתמש בקו חיתוך אופקי בין שני סחוס הקנה.
- הכנס את צינור האוורור ואת התיקונים עם הליגטורות המוכנות.
הערה: הקצה החלק היותר של קנה הנשימה אינו צריך להיות מוקשה. - לסגור את העור בתפר מסתובב (למשל, 6-0 מונופינט, לא נספגים).
- לאוורר את העכבר עם תדר של 150/דקות ואת נפח הגאות של 200 μL.
3. מוות מוחי האינדוקציה
- לסדר את העכבר על התנוחה נוטה.
- להסיר את העור מהגולגולת באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים להחזיק את העור.
- מקדחה מקדח בקוטר 1 מ"מ. מעל קליפת הקודקוד השמאלית הפסיקו את הקידוח לפני שפורצים את העצם הקומפקטית הפנימית ואת מאטר דורא.
- לחדור את גשר הרקמה הסופית של הגולגולת באמצעות מלקחיים קהה, הסרת קצוות חדים.
- הכנס את קטטר הבלון, כך שהוא לגמרי בתוך חלל הגולגולת. ודא שהבלון מתמלא בתמיסת מלח וכל האוויר פונה.
- התחל באינפלציה ב-~ 0.1 mL/min לאורך תקופה של 10 עד 15 דקות (נפח כולל של 0.8-1.2 mL) בעזרת משאבת מזרק.
הערה: העכבר יהיה להפגין מיוקלאוס, mydriasis, עוד להתקף פעילות ונשימות נשימות אגונאליות. - לבטא את המוח העכבר מת פעם הזנב של העכבר הלך נוקשה והוקם.
הערה: BD מאושר על ידי שיא מאפיין של לחץ דם ראשוני (רפלקס קושינג), העדר רפלקסים גזע המוח נשימה ספונטנית. בדיקת דום נשימה רגילה יש להימנע במהלך ניסויים, כמו עכברים עלולים להיות מסוגל להפוך את הדם בשל חוסר חמצן. - לעצור את האינפלציה של קטטר הבלון.
- לשים שמיכה הסקה על העכבר כדי למנוע היפותרמיה.
4. במהלך תקופת BD
- לפקח ולתעד לחץ דם באופן קבוע. להוציא עכברים עם שלב היתר ממושך (מתכוון לחץ עורקי [MAP] < 50 mmHg עבור > 30 דקות).
- להשרות 0.1 mL של תמיסת מלח כל 30 דקות כדי לייצב את לחץ הדם של העכבר.
הערה: בסך הכל 0.8 מ ל של תמיסת מלח היה מנוהל כל עכבר במחקר זה. - לאחר 4 h של משך BD, הקציר העכבר איברים/רקמות. הוצא את העכבר מהניסוי אם לב העכבר אינו פועם בסוף הניסוי.
5. הליך זה
- ביצוע שלבים 1.1-3.3.
הערה: אל תפתחו את העצם הקומפקטית הפנימית. אין להוסיף או לנפח צנתר בלון. - הישארו קרוב לעכבר וברציפות להתבונן בחיה. מלקחיים כדי לאשר את העומק. הנכון של ההרדמה החלת תת-עורי הרדמה נוספת (כ 1/2 של מינון ההתחלה) אם העכבר מראה סימנים של התעוררות, אשר, לניסיוננו, קורה בערך אחרי 2-3 h לאחר ההרדמה.
- החל את אותה כמות של תמיסת מלח ורידי כמו בעכברים BD.
הערה: העכבר המזויף יקבל חזרה את הנשימה הספונטנית לאחר הפסקת האוורור. העכבר BD לא. בדיקת דום נשימה צריך להתבצע בעת הקמת המודל, אבל במהלך ניסויים יש להימנע בשל לחץ פיזיולוגי מיותרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל ה-BD murine בוצע בהצלחה יותר מ 100 פעמים עם שיעור הצלחה של מעל 90%. בנוסף, השתלת איברים התערבותית של הלב והכליות כבר בוצעה בבטחה7.
BD משרה מגוון שינויים פתופסלוגיים שעשויים להיחקר עוד באמצעות מודל זה. כמתואר באיור 1, לחץ הדם מראה שיא הראשוני לחץ דם גבוה ואחריו שלב היתר ממושך. כדי למנוע השפעות פיזיולוגיות מזיקות של תת לחץ דם, עכברים עם לחצים ממושכת מספיק בדם (מפה < 50 mmHg עבור יותר מ 30 דקות) לא נכללו.
עוד התבוננות מבוססת היטב היא כי האינדוקציה BD מוביל להפעלת המערכת החיסונית. לאחר 4 שעות של BD למשך האיברים הספציפיים upregulation של סמנים החיסונית ברמה mRNA (איור 2), כמו גם הגירה התא החיסונית נצפתה7.
איור 1: מדידה פולשנית של לחץ עורקי ממוצע (MAP) בעקבות השראה BD או הליך התחזות. בנקודת הזמן של האינדוקציה bd, לחץ דם היה גבוה באופן משמעותי ב-bd בעלי חיים (ריבועים לבנים) מאשר בעלי חיים מזויפים (ריבועים שחורים) אשר מוסבר באמצעות סופת היטב תיאר ציטוקינים; לאחר מכן, נורמליזציה של רמות לחץ דם התברר ואחריו תקופה של רמות הלחץ הפוחתת החל לאחר 90 דקות של האינדוקציה BD (n = 19 בעלי חיים/קבוצה ± SD). הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית נבדקו עם ANOVA דו כיוון ובונפררוני פוסט-מבחן; * *p < 0.01, * * *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אינדוקציה BD מפעיל את המערכת החיסונית וגורם נזק איברים ישירים לפני השתלת. אנו מראים את תוצאות הנציג של הרעלים הטבעית מפעילה הקולטן 1 (NCR1 גם NK-p46), אשר מגדיל את הכליות כתוצאה של BD ברמת mRNA. לא נצפו שינויים בכבדים או בלבבות. נתונים מוצגים כממוצע ± SE של n = 7-8 בעלי חיים/קבוצה. הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין BD המזויף נבדקו באמצעות מאן-ויטני U-test; * *p = 0.0037. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BD, גורם סיכון לאיכות השתלת בתורמים רב איברים, כרוך שפע של שינויים pathפסולוגיים, אשר ניתן רק מוערך מספיק באמצעות מודלים vivo. שינויים הומודינמיים, סערת cy, שינויים הורמונליים והשפעתם האולטימטיבית על איכות והשתלת איברים לא ניתן לנתח בתוך מבחנה4. רוב ההשתלה הבסיסית, כמו גם מחקר אימונולוגיים תלויה בכלי אבחון מתוחכמים, אשר זמינים באופן נרחב רק בדגמי עכברים. מודלים עכברים כבר הובילו למגוון תובנות חדשות ב-BD הקשורות מחקר7,8,9.
ואילו במאה ה -20 הדגמים הראשונים של מחקר BD פותחו בבבונים, כלבים וחזירים11,12, זה לא היה עד 1996 כאשר המודל עכברוש הראשון תיאר13. זה לקח 14 שנים נוספות עד מודל murine של BD פורסם לראשונה על ידי קבוצת וינה ב 20106. למרות שצעד בודד אינו מאתגר עבור מיקרוכירורג מיומן, המודל המתואר כאן נשאר שברירי ועשוי להימשך שבועות אחדים כדי לבסס.
צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם כדלקמן. השתמש בפריטים חד פעמיות סטרילי (במיוחד קטטר העורקים ומחבר הצינורות) כדי למנוע גירוי החיסון לא רצוי. להימנע אובדן דם כשלב היתר יכול להיות בלתי נשלט. השתמש בצינורית קטנה למדידת לחץ דם או להפחית את לומן כדי למנוע ריפלוקס דם. תקן את צינור האוורור, כמו גם את צינורית העורקים כדי למנוע פריקה בעת הפיכת העכבר או במהלך פעילות התפיסה. חור הקידוח אינו חייב להיות בעל קצוות חדים ואינו אמור להיות גדול מדי. קטטר הבלון צריך להיות בקשר עם הקידוח. אחרת רקמת המוח עלול לבלוט ולעכב את העלאת המיועד בלחץ פנים-גולגולתי. במהלך הזמן BD, לנהל נוזל ורידי בהתמדה. אם העכברים הופכים מוקדם מדי בתהליך (MAP < 50 mmHg לאחר 2 עד 3 שעות), החייאה נוזלים נוספים לא סביר לספק תחזוקה מתמשכת של לחץ דם.
רוב הבעיות אירעו במהלך האינדוקציה BD באמצעות קטטר הבלון עצמו או התברר במשך תקופת BD. נקודת הקצה המשותפת של כל אי-דיוקים תהיה יתר לחץ דם למרות מינהל הנוזלים. בהתאם ליציבות לחץ הדם, BD-משך יכול להיות ממושך או מקוצר. בספרות, תקופות שונות החל מ 3 עד 6 h יושמו6,7,8. ההצלחה של האינדוקציה BD יכול גם להשתנות בין זנים שונים העכבר. למרות משתנים אנטומיים בין העכברים זנים צריך להיות מוגבל, לא היינו מסוגלים להקים את אותו מודל בעכברים BALB/c. למרות המאמץ היה מוגבל רק עכברים מעטים ולא זנים אחרים נבדקו, אנו ממליצים על השימוש C57BL/6, אשר נעשה שימוש ברוב המחקר הקודם8,9. למחברים אין הסבר משביע רצון מדוע המודל לא עבד במתח BALB/c. רק פרסום אחד עד כה הפגינו מודל BD באמצעות גדול (35 g) נקבה של-1 עכברים6.
לסיכום, מודל העכבר המתואר כאן מייצג כלי רב ערך ללמוד מגוון של שינויים פתופסלוגיים שנגרמו על ידי BD. למרות מאתגרת, המודל יכול להיות אופטימיזציה בתוך פרק זמן סביר ומבוצע באופן מתוקננת עם שיעור הצלחה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
n.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19 (2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
