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Neuroscience

Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia

Published: April 17, 2020 doi: 10.3791/60831
* These authors contributed equally

Summary

Presentiamo un modello murino di induzione della morte cerebrale al fine di valutare l'influenza dei suoi effetti patofisiologici sugli organi e su innesti consecutivi nel contesto del trapianto di organi solidi.

Abstract

Mentre sia la donazione vivente che la donazione dopo la morte circolatoria offrono opportunità alternative per il trapianto di organi, la donazione dopo la morte cerebrale del donatore (BD) rappresenta ancora la principale fonte di trapianti solidi. Sfortunatamente, la perdita irreversibile della funzione cerebrale è nota per indurre più cambiamenti patofisiologici, tra cui modifiche emodinamiche e ormonali, portando infine a una risposta infiammatoria sistemica. I modelli che consentono un'indagine sistematica di questi effetti in vivo sono scarsi. Vi presentiamo un modello murino di induzione BD, che potrebbe aiutare le indagini sugli effetti devastanti di BD sulla qualità allotrapianto. Dopo aver implementato la misurazione della pressione sanguigna intra-arteria attraverso l'arteria carotide comune e una ventilazione affidabile tramite una tracheostomia, BD è indotta da un costante aumento della pressione intracranica utilizzando un catetere a palloncino. Quattro ore dopo l'induzione di BD, gli organi possono essere raccolti per l'analisi o per ulteriori procedure di trapianto. La nostra strategia consente un'analisi completa del donatore BD in un modello murino, consentendo quindi una comprensione approfondita degli effetti correlati al BD nel trapianto di organi solidi e potenzialmente apaggendo la strada a un precondizionamento ottimizzato degli organi.

Introduction

Il trapianto è attualmente l'unico trattamento curativo per l'insufficienza degli organi allo stadio finale. Fino ad ora, i pazienti con morte cerebrale (BD) sono stati la principale fonte di donazioni di organi, anche se la donazione e la donazione viventi dopo la morte circolatoria sono alternative preziose1. BD è definito da un coma irreversibile (con una causa nota), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e apnea2. Sfortunatamente, gli organi BD dimostrano risultati inferiori nella sopravvivenza del trapianto a lungo termine indipendente mente dall'antigene leucocito umano (HLA) -mismatch e freddo ischemico tempo3. Nel frattempo, è stata eseguita un'intensa ricerca su questo fattore di rischio indipendente dall'antigene, portando a tre aspetti principali dei cambiamenti patofisiologici mediati come conseguenza di BD: emodinamica, ormonale e infiammatoria4.

Fino ad oggi, i modelli BD sperimentali nei roditori sono stati per lo più eseguiti utilizzando ratti. Al fine di ottenere una maggiore comprensione delle conseguenze immunologiche sugli organi solidi dopo la BD, abbiamo cercato di stabilire un modello murino di BD, poiché attualmente solo i modelli murini consentono indagini complete sui fattori genetici o immunologici. In questo contesto, il sistema del mouse fornisce una maggiore varietà di strumenti analitici.

Il principio di induzione di BD come descritto qui si basa su un aumento della pressione intracranica indotta dall'inflazione di un catetere di palloncino inserito sotto il cranio. L'aumento della pressione intracranica imita il meccanismo fisiologico della BD bloccando la perfusione del cervello, del cervelletto e del tronco cerebrale5,6. Per garantire una perfusione sufficiente di organi periferici, la misurazione della pressione sanguigna è obbligatoria durante la procedura. Il catetere utilizzato per questo scopo allo stesso tempo serve per la somministrazione salina al fine di stabilizzare la pressione sanguigna con la sostituzione del fluido. Poiché la BD è accompagnata da cessazione della respirazione spontanea, deve essere garantita una ventilazione sufficiente. Una coperta elettrica mantiene la temperatura corporea fisiologica del nucleo.

In sintesi, questo modello consentirà studi approfonditi sull'influenza delle lesioni indotte da BD, sulla migrazione del leucocito7,sull'attivazione delcomplimento 8, sulla lesione da reperfusione ischemica9e su altri fattori.

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Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i Principi di Laboratorio Animali Formulati dalla National Society for Medical Research e dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio preparati dalla National Academy of Science e pubblicati dai National Institutes of Health (La pubblicazione n. 86-23, rivista 1985). Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Ministero austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Cateterizzazione arteriosa

  1. Anestesizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilosina10 e un analgesico secondo la pratica locale (ad esempio buprenorphine).  Pizzicare gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia.
    NOTA: Per questo studio, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6N all'età di 8-12 settimane (peso 20-25 g). Gli autori hanno testato il maschio BALB/c della stessa età senza successo, ma non hanno provato altri ceppi (vedi Discussione).
  2. Rimuovere i capelli nelle regioni di interesse (testa, collo) utilizzando un rasoio elettrico. Assicurarsi che non rimangano capelli sciolti per prevenire la contaminazione della ferita. Successivamente disinfettare il campo chirurgico con il 70% di etanolo/clorexidina/ betadine e posizionare la supina del topo con la testa rivolta verso il chirurgo.
  3. Fare un'incisione cervicale media con forbici dissecistrici di sedzio.
  4. Dissezionare le ghiandole submandibolare e il tessuto muscolare del collo e separarli al fine di esporre l'arteria carotide comune. Utilizzare per lo più dissezione smussata tramite pinze.
  5. Mettere tre 8-0 legature di seta sotto l'arteria carotide comune destra.
  6. Posizionare un morsetto sulla legatura prossimale e portare tensione nell'arteria in modo che il flusso sia sospeso.
  7. Chiudere la legatura più dissina.
  8. Inserire il catetere arterioso attraverso un piccolo foro cutaneo preformato sull'aspetto cranico dell'incisione. Spremere e deformare il lume del catetere se appare troppo grande per ridurre il sangue. Fissare con tutte e tre le legature.
  9. Fissare il catetere sulla pelle per evitare la lussazione. Fare questo utilizzando una sutura (ad esempio, monofilamento 5-0, non assorbibile) che collega il catetere alla pelle nell'area del foro cutaneo preformato.

2. Tracheostomia

  1. Dissezionare la muscolatura pre-tracheale senza mezzi termini usando pinze.
  2. Posizionare due 8-0 legature di seta sotto la trachea.
  3. Tracheotomizza utilizzando micro forbici il più possibile proximalmente per evitare la ventilazione unilaterale. Utilizzare una linea di taglio orizzontale tra due cartilagini tracheali.
  4. Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con entrambe le legature preparate.
    NOTA: l'estremità prossimale della trachea non deve essere ligata.
  5. Chiudere la pelle con una sutura in funzione (ad esempio, monofilamento 6-0, non assorbibile).
  6. Ventilate il mouse con una frequenza di 150/min e un volume di marea di 200 l.

3. Induzione della morte cerebrale

  1. Disporre il mouse nella posizione prona.
  2. Rimuovere la pelle dal cranio utilizzando forbici chirurgiche e pinze per tenere la pelle.
  3. Forare un foro di trivellazione calibro 1 mm paradisiaca sopra la corteccia parietale sinistra. Interrompere la perforazione prima di rompere l'osso compatto interno e la dura mater.
  4. Penetrare il ponte intessuto finale del cranio con pinze smussate, rimuovendo i bordi taglienti.
  5. Inserire il catetere a palloncino, in modo che sia interamente all'interno della cavità cranica. Assicurarsi che il palloncino sia precompilato con salina e che tutta l'aria sia evacuata.
  6. Iniziate l'inflazione a 0,1 mL/min per un periodo di 10,15 min (volume totale di 0,8,1,2 mL) con l'aiuto di una pompa di siringa.
    NOTA: Il topo esporrà mioclonus, midriasi, ulteriore attività di sequestro e rantoli agonali.
  7. Pronunciare il cervello topo morto una volta che la coda del topo è andato rigido ed eretto.
    NOTA: Il BD è confermato da un caratteristico picco iniziale di pressione sanguigna (riflesso di Cushing), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e respirazione spontanea. I test regolari dell'apnea dovrebbero essere evitati durante gli esperimenti, poiché i topi possono diventare instabili circolatori a causa della mancanza di ossigeno.
  8. Fermare l'inflazione del catetere del palloncino.
  9. Mettere una coperta di riscaldamento sul mouse per evitare l'ipotermia.

4. Durante il periodo BD

  1. Monitorare e documentare regolarmente la pressione sanguigna. Escludere i topi con una fase ipotensiva prolungata (pressione arteriosa media [MAP] < 50 mmHg per >30 min).
  2. Infondere 0,1 mL di salina ogni 30 min per stabilizzare la pressione sanguigna del topo.
    NOTA: In totale è stato somministrato 0,8 mL di salina a ciascun topo in questo studio.
  3. Dopo 4 h di durata BD, raccogliere organi/tessuti per topi. Escludere il mouse dall'esperimento se il cuore del mouse non batte alla fine dell'esperimento.

5. Procedura Sham

  1. Eseguire i passaggi 1.1/3.3.
    NOTA: Non aprire l'osso compatto interno. Non inserire o gonfiare un catetere a palloncino.
  2. Stare vicino al mouse e osservare continuamente l'animale. Pizzicare ripetutamente gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia. Applicare l'anestesia aggiuntiva sottocutaneamente (circa 1/2 della dose iniziale) se il topo mostra segni di risveglio, che, per nostra esperienza, avviene approssimativamente dopo 2/3 h dopo l'anestesia.
  3. Applicare la stessa quantità di salina per via endovenosa dei topi BD.
    NOTA: Il topo farsi riacquisterà la respirazione spontanea dopo la cessazione della ventilazione. Il mouse BD non lo farà. Il test dell'apnea dovrebbe essere fatto mentre si stabilisce il modello, ma durante gli esperimenti dovrebbe essere evitato a causa di inutili stress fisiologico.

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Representative Results

Il modello murine BD è stato eseguito con successo più di 100 volte con un tasso di successo di oltre il 90%. Inoltre, il trapianto di organi post intervento di cuore e rene è stato eseguito in modo sicuro7.

BD induce una varietà di cambiamenti patofisiologici che possono essere ulteriormente studiati utilizzando questo modello. Come mostrato nella Figura 1,la pressione sanguigna mostra un picco ipertensivo iniziale seguito da una fase ipotensiva prolungata. Per evitare effetti fisiologici dannosi dell'ipotensione, sono stati esclusi topi con una pressione sanguigna insufficiente prolungata (MAP < 50 mmHg per più di 30 min).

Un'altra osservazione consolidata è che l'induzione di BD porta all'attivazione del sistema immunitario. Dopo 4 h di upregulation specifica degli organi di durata BD dei marcatori immunitari a livello di mRNA (Figura 2) e la migrazione delle cellule immunitarie è stata osservata7.

Figure 1
Figura 1: Misurazione invasiva della pressione arteriosa media (MAP) dopo l'induzione di BD o la procedura fittizia. Al momento dell'induzione di BD, la pressione sanguigna era significativamente più alta negli animali BD (quadrati bianchi) che negli animali farsi (quadrati neri) che viene spiegata attraverso la tempesta di citochine ben descritta; successivamente, la normalizzazione dei livelli di pressione sanguigna è diventata evidente seguita da un periodo di diminuzione dei livelli di pressione a partire da 90 min di induzione di BD (n - 19 animali/gruppo - SD). Differenze statisticamente significative sono state testate con ANOVA bidirezionale e il post-test Bonferroni; < 0,01,p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'induzione di BD attiva il sistema immunitario e provoca danni diretti agli organi prima del trapianto. Mostriamo risultati rappresentativi della citotossicità naturale che innesca il recettore 1 (NCR1 anche NK-p46), che aumenta nei reni come conseguenza della BD a livello di mRNA. Non sono stati osservati cambiamenti nei fegati o nei cuori. I dati sono presentati come media : SE di n - 7 -8 animali/gruppo. Le differenze statisticamente significative tra BD e sham sono state testate utilizzando il Mann-Whitney U-test; 0,0037 USD.p Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il BD, un fattore di rischio per la qualità dell'allotrapianto nei donatori multiorgano, comporta una pletora di cambiamenti patofisiologici, che possono essere valutati solo in modo sufficiente utilizzando modelli in vivo. I cambiamenti emodinamici, la tempesta di citochine, i cambiamenti ormonali e il loro impatto finale sulla qualità e sulla sopravvivenza dell'innesto degli organi non possono essere analizzati in vitro4. La maggior parte dei trapianti di base e della ricerca immunologica dipendono da sofisticati strumenti diagnostici, che sono ampiamente disponibili solo nei modelli di topi. I modelli di topi hanno già portato a una varietà di nuove intuizioni nella ricerca correlata alla BD7,8,9.

Mentre nel XX secolo i primi modelli per la ricerca BD sono stati sviluppati in babbuini, cani e maiali11,12, non è stato fino al 1996 quando il primo modello di ratto è stato descritto13. Ci sono voluti altri 14 anni prima che un modello murino di BD sia stato pubblicato per la prima volta dal gruppo di Vienna nel 20106. Anche se ogni singolo passo non è impegnativo per un microchirurgo addestrato, il modello qui descritto rimane fragile e può richiedere alcune settimane per stabilire.

I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti. Utilizzare sterili oggetti usa e getta (soprattutto il catetere arterioso e i tubi di collegamento) per evitare la stimolazione immunitaria indesiderata. Evitare qualsiasi perdita di sangue come fase ipotensiva può diventare incontrollabile. Utilizzare piccole cannule per la misurazione della pressione sanguigna o ridurre il lume per evitare il reflusso sanguigno. Fissare il tubo di ventilazione e la cannula arteriosa per evitare la lussazione quando si gira il topo o durante l'attività di convulsione. Il foro di trivellazione non deve essere tagliente e non deve essere troppo grande. Il catetere a palloncino deve essere in contatto con il foro di trivellazione. Altrimenti il tessuto cerebrale può sporgere e ostacolare l'elevazione prevista nella pressione intracranica. Durante il periodo BD, somministrare costantemente il liquido per via endovenosa. Se i topi diventano ipotensivi troppo presto nel processo (MAP < 50 mmHg dopo 2/3 h), è improbabile che la rianimazione dei fluidi supplementare fornisca un mantenimento sostenuto della pressione sanguigna.

La maggior parte dei problemi si sono verificati durante l'induzione di BD tramite il catetere a palloncino stesso o sono diventati evidenti nel corso del periodo BD. L'endpoint comune di tutte le imprecisioni sarà l'ipotensione nonostante la somministrazione di liquidi. A seconda della stabilità della pressione sanguigna, la durata di BD può essere prolungata o accorciata. Nella letteratura, sono stati implementati periodi che vanno da3-6 h, 6,7,8. Il successo dell'induzione di BD può anche variare tra diversi ceppi del mouse. Anche se le varianti anatomiche tra ceppi di topi dovrebbero essere limitate, non siamo stati in grado di stabilire lo stesso modello nei topi BALB/c. Anche se lo sforzo è stato limitato a pochi topi e non sono stati testati altri ceppi, si consiglia l'uso di C57BL/6, che è stato utilizzato nella maggior parte delle ricerche precedenti8,9. Gli autori non hanno una spiegazione soddisfacente del motivo per cui il modello non ha funzionato in ceppo BALB/c.   Solo una pubblicazione ha finora dimostrato un modello BD utilizzando topi di-1 femminili di grandi dimensioni (35 g)6.

In sintesi, il modello murino qui descritto rappresenta uno strumento prezioso per studiare una moltitudine di cambiamenti patofisiologici causati da BD. Anche se impegnativo, il modello può essere ottimizzato in un lasso di tempo ragionevole ed eseguito in modo standardizzato con un alto tasso di successo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

N.a.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G) BD 391349
Blood Pressure Transducers (APT300) Harvard Apparatus Inc. 73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 Edwards Lifesciences Corporation 120403F
Forceps FST 11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus Inc. 55-7020
Ketansol Graeub 6680110
Micro scissor FST 15018-10
Needle holder FST 12060-02
Prolene 5-0 Ethicon 8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single Harvard Apparatus Inc. 70-4500
Scissor FST 14075-11
Stereotactic microscope Olympus SZX7
Transpore Tape 3M 1527-1
Underpads Molinea.A 274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845) Harvard Apparatus Inc. 73-0043
Xylasol Graeub 7630109

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References

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Neuroscienze Numero 158 trapianto morte cerebrale donazione di organi murine misurazione della pressione sanguigna tracheostomia
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Ritschl, P. V., Hofhansel, L.,More

Ritschl, P. V., Hofhansel, L., Flörchinger, B., Oberhuber, R., Öllinger, R., Pratschke, J., Kotsch, K. Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy. J. Vis. Exp. (158), e60831, doi:10.3791/60831 (2020).

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