Summary
Apresentamos um modelo murina de indução de morte cerebral para avaliar a influência de seus efeitos fisiopatológicos nos órgãos, bem como em enxertos consecutivos no contexto do transplante de órgãos sólidos.
Abstract
Embora tanto a doação viva quanto a doação após a morte circulatória forneçam oportunidades alternativas para o transplante de órgãos, a doação após a morte cerebral do doador (DB) ainda representa a principal fonte de transplantes sólidos. Infelizmente, a perda irreversível da função cerebral é conhecida por induzir múltiplas alterações fisiopatológicas, incluindo hemodinâmica, bem como modificações hormonais, finalmente levando a uma resposta inflamatória sistêmica. Modelos que permitem uma investigação sistemática desses efeitos in vivo são escassos. Apresentamos um modelo murina de indução de BD, que poderia auxiliar investigações sobre os efeitos devastadores da BD na qualidade do aloenxerto. Depois de implementar a medição da pressão arterial intra-arterial através da artéria carótida comum e ventilação confiável através de uma traqueostomia, a DB é induzida pelo aumento constante da pressão intracraniana usando um cateter de balão. Quatro horas após a indução da BD, os órgãos podem ser colhidos para análise ou para novos procedimentos de transplante. Nossa estratégia permite a análise abrangente do BD doador em um modelo de murina, permitindo assim uma compreensão aprofundada dos efeitos relacionados ao BD no transplante de órgãos sólidos e potencialmente abrindo caminho para o pré-condicionamento otimizado de órgãos.
Introduction
O transplante é atualmente o único tratamento curativo para falência de órgãos em estágio final. Até agora, os pacientes com morte encefálica (BD) têm sido a principal fonte de doação de órgãos, embora a doação e a doação vivas após a morte circulatória sejam alternativas valiosas1. A DB é definida por um coma irreversível (com uma causa conhecida), a ausência de reflexos do tronco cerebral e apnéia2. Infelizmente, os órgãos bd demonstram resultados inferiores na sobrevivência do enxerto a longo prazo independente do antígeno leucócito humano (HLA)-incompatibilidade e tempo isquêmico frio3. Enquanto isso, pesquisas intensivas sobre este fator de risco independente de antígeno têm sido realizadas resultando em três aspectos principais das alterações fisiopatológicas mediadas em consequência da DB: hemodinâmica, hormonal e inflamatória4.
Até o momento, modelos experimentais de BD em roedores têm sido realizados principalmente usando ratos. A fim de obter maior visão sobre as consequências imunológicas sobre órgãos sólidos após a BD, buscou-se estabelecer um modelo murina de BD, uma vez que atualmente apenas modelos de camundongos permitem investigações abrangentes sobre fatores genéticos ou imunológicos. Neste contexto, o sistema do mouse fornece uma variedade maior de ferramentas analíticas.
O princípio da indução de BD como descrito aqui baseia-se em um aumento da pressão intracraniana induzida pela inflação de um cateter de balão inserido sob o crânio. O aumento da pressão intracraniana imita o mecanismo fisiológico da BD bloqueando a perfusão do ceêmto, cerebelo e tronco cerebral5,6. Para garantir perfusão suficiente de órgãos periféricos, a medição da pressão arterial é obrigatória durante o procedimento. O cateter usado para este fim ao mesmo tempo serve para a administração de soro estona, a fim de estabilizar a pressão arterial por substituição de fluidos. Como a BD é acompanhada pela cessação da respiração espontânea, deve-se garantir ventilação suficiente. Um cobertor elétrico mantém a temperatura fisiológica do corpo do núcleo.
Em resumo, este modelo permitirá estudos aprofundados sobre a influência da lesão induzida pelo BD, sobre a migração de leucócitos7, ativação de elogios8, lesão de reperfusão isquêmica9, e outros fatores.
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Protocol
Os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os Princípios de Cuidados Com Animais Laboratoriais formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório elaborado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NI Publication nº 86-23, revisado em 1985). Todos os experimentos foram aprovados pelo Ministério da Educação, Ciência e Cultura da Áustria (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cateterismo arterial
- Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina10 e um analgésico de acordo com a prática local (por exemplo, buprenorfina). Aperte os membros traseiros com fórceps para confirmar a profundidade correta da anestesia.
NOTA: Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6N masculinos com idade sofrícia de 8 a 12 semanas (peso 20-25 g). Os autores testaram balb/c masculino da mesma idade sem sucesso, mas não tentaram outras cepas (ver Discussão). - Remova o cabelo nas regiões de interesse (cabeça, pescoço) usando uma navalha elétrica. Certifique-se de que não restam pelos soltos para evitar a contaminação da ferida. Posteriormente desinfete o campo cirúrgico com 70% de etanol/clorexidina/betadina e coloque o camundongo supino com a cabeça voltada para o cirurgião.
- Faça uma incisão cervical da linha média com uma tesoura dissecante.
- Disseque as glândulas submandibulares e o tecido muscular do pescoço e separe-as para expor a artéria carótida comum. Use dissecção principalmente contundente através de fórceps.
- Coloque três 8-0 ligaduras de seda sob a artéria carótida comum direita.
- Coloque um grampo na ligadura proximal e coloque tensão na artéria para que o fluxo seja suspenso.
- Feche a ligadura mais distal.
- Insira o cateter arterial através de um pequeno orifício de pele pré-formado no aspecto craniano da incisão. Aperte e deforme o lúmen do cateter se parecer muito grande para reduzir o fluxo sanguíneo. Fixar-se com as três ligaduras.
- Fixar o cateter na pele para evitar luxação. Faça isso usando uma sutura (por exemplo, monofilamento 5-0, não absorvível) que conecta o cateter à pele na área do orifício de pele pré-formado.
2. Traqueostomia
- Disseque a musculatura pré-traqueal sem rodeios usando fórceps.
- Coloque dois 8-0 ligaduras de seda sob a traqueia.
- Traqueotomizar usando micro tesouras o mais proximamente possível para evitar ventilação unilateral. Use uma linha de corte horizontal entre duas cartilagens traqueais.
- Insira o tubo de ventilação e fixe-se com ambas as ligaduras preparadas.
NOTA: A extremidade proximal da traqueia não precisa ser ligada. - Feche a pele com uma sutura em execução (por exemplo, 6-0 monofilamento, não absorvível).
- Ventile o mouse com uma frequência de 150/min e um volume de maré de 200 μL.
3. Indução de morte cerebral
- Mande o mouse para a posição propensa.
- Remova a pele do crânio usando tesouras cirúrgicas e fórceps para segurar a pele.
- Fure um furo de calibre de 1 mm paramedialmente acima do córtex parietal esquerdo. Pare de perfurar antes de romper o osso compacto interno e a dura-máter.
- Penetre na ponte de tecido final do crânio usando fórceps contundentes, removendo bordas afiadas.
- Insira o cateter de balão, de modo que esteja inteiramente dentro da cavidade craniana. Certifique-se de que o balão está pré-preenchido com salina e que todo o ar seja evacuado.
- Inicie a inflação em ~0,1 mL/min durante um período de 10-15 min (volume total de 0,8-1,2 mL) com a ajuda de uma bomba de seringa.
NOTA: O rato exibirá mioclonus, miríase, atividade de apreensão adicional e suspiros agonais. - Pronuncie o cérebro do rato morto uma vez que a cauda do rato ficou dura e erguida.
NOTA: A DB é confirmada por um pico de pressão arterial inicial característico (reflexo cushing), ausência de reflexos do tronco cerebral e respiração espontânea. Testes regulares de apnéia devem ser evitados durante os experimentos, pois os camundongos podem se tornar inestáveis circulatórios devido à falta de oxigênio. - Pare a inflação do cateter de balão.
- Coloque um cobertor de aquecimento sobre o rato para evitar hipotermia.
4. Durante o período BD
- Monitore e documente a pressão arterial regularmente. Exclua camundongos com uma fase hipotensiva prolongada (pressão arterial média [MAP] < 50 mmHg para >30 min).
- Infundir 0,1 mL de salina a cada 30 min para estabilizar a pressão sanguínea do camundongo.
NOTA: No total, 0,8 mL de salina foi administrado a cada rato neste estudo. - Após 4h de duração da BD, colher órgãos/tecidos do camundongo. Exclua o mouse do experimento se o coração do rato não estiver batendo no final do experimento.
5. Procedimento sham
- Executar as etapas 1.1-3.3.
NOTA: Não abra o osso compacto interno. Não insira ou infle um cateter de balão. - Fique perto do rato e observe continuamente o animal. Belisque repetidamente os membros traseiros com fórceps para confirmar a profundidade correta da anestesia. Aplique anestesia adicional subcutânea (aproximadamente 1/2 da dose inicial) se o mouse mostrar sinais de despertar, o que, para nossa experiência, acontece aproximadamente após 2-3 h pós-anestesia.
- Aplique a mesma quantidade de salina intravenosa que nos camundongos BD.
NOTA: O rato falso recuperará a respiração espontânea após a cessação da ventilação. O mouse BD não. O teste de apnéia deve ser feito durante o estabelecimento do modelo, mas durante os experimentos deve ser evitado devido ao estresse fisiológico desnecessário.
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Representative Results
O modelo murine BD foi realizado com sucesso mais de 100 vezes com uma taxa de sucesso superior a 90%. Além disso, o transplante de órgãos pós-intervencionistas de coração e rim foi realizado com segurança7.
A DB induz uma variedade de alterações fisiopatológicas que podem ser investigadas posteriormente usando este modelo. Como mostrado na Figura 1,a pressão arterial mostra um pico hipertensivo inicial seguido de uma fase hipotensiva prolongada. Para evitar efeitos fisiológicos prejudiciais da hipotensão, foram excluídos camundongos com pressão arterial insuficiente prolongada (MAP < 50 mmHg por mais de 30 min).
Outra observação bem estabelecida é que a indução de BD leva à ativação do sistema imunológico. Após 4h de regulação específica do órgão de duração da BD dos marcadores imunológicos no nível de mRNA (Figura 2),bem como a migração de células imunes foi observada7.
Figura 1: Medição invasiva da pressão arterial média (MAP) após a indução de BD ou procedimento falso. No momento da indução da BD, a pressão arterial foi significativamente maior em animais BD (quadrados brancos) do que em animais falsos (quadrados negros), o que é explicado através da bem descrita tempestade de citocinas; a partir daí, a normalização dos níveis de pressão arterial tornou-se evidente, seguida por um período de declínio dos níveis de pressão a partir de 90 min de indução de Db (n = 19 animais/grupo ± DS). Diferenças estatisticamente significativas foram testadas com a ANOVA bidirecional e o pós-teste de Bonferroni; **p < 0.01, ***p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A indução bd ativa o sistema imunológico e causa danos diretos aos órgãos antes do transplante. Mostramos resultados representativos do receptor desencadeador de citotoxicidade natural 1 (NCR1 também NK-p46), que aumenta nos rins como conseqüência da BD no nível de mRNA. Não foram observadas alterações em fígados ou corações. Os dados são apresentados como média ± SE de n = 7-8 animais/grupo. Diferenças estatisticamente significativas entre BD e sham foram testadas usando o teste U de Mann-Whitney; **p = 0,0037. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A DB, fator de risco para a qualidade do aloenxerto em doadores multiórgãos, implica uma infinidade de alterações fisiopatológicas, que só podem ser suficientemente avaliadas utilizando modelos in vivo. Alterações hemodinâmicas, tempestade de citocinas, alterações hormonais e seu impacto final na qualidade e sobrevivência do enxerto de órgãos não podem ser analisados in vitro4. A maioria dos transplantes básicos, bem como da pesquisa imunológica, depende de ferramentas de diagnóstico sofisticadas, que estão amplamente disponíveis apenas em modelos de camundongos. Os modelos de ratos já levaram a uma variedade de novos insights em pesquisas relacionadas ao BD7,8,9.
Considerando que, no século XX, os primeiros modelos de pesquisa em BD foram desenvolvidos em babuínos, cães e porcos11,12,não foi até 1996, quando o primeiro modelo de rato foi descrito13. Demorou mais 14 anos até que um modelo murine de BD foi publicado pela primeira vez pelo grupo de Viena em 20106. Embora cada passo individual não seja desafiador para um microcirurgião treinado, o modelo descrito aqui permanece frágil e pode levar algumas semanas para ser estabelecido.
As etapas críticas deste protocolo são as seguintes. Use itens descartáveis estéreis (especialmente o cateter arterial e os tubos de conexão) para evitar estimulação imunológica indesejada. Evite qualquer perda de sangue, pois a fase hipotensiva pode se tornar incontrolável. Use pequenas cânulas para a medição da pressão arterial ou reduza o lúmen para evitar o refluxo sanguíneo. Fixar o tubo de ventilação, bem como a cânula arterial para evitar luxação ao girar o mouse ou durante a atividade convulsiva. O furo não deve ser afiado e não deve ser muito grande. O cateter de balão deve estar em contato com o furo. Caso contrário, o tecido cerebral pode se projetar e dificultar a elevação pretendida na pressão intracraniana. Durante o período BD, administre o fluido intravenoso de forma constante. Se os camundongos se tornarem hipotensivos muito cedo no processo (MAP < 50 mmHg após 2-3 h), é improvável que a ressuscitação adicional de fluidos forneça manutenção sustentada da pressão arterial.
A maioria dos problemas ocorreu durante a indução de BD através do próprio cateter de balão ou tornou-se óbvia ao longo do período BD. O ponto final comum de todas as imprecisões será a hipotensão apesar da administração de fluidos. Dependendo da estabilidade da pressão arterial, a duração da BD pode ser prolongada ou encurtada. Na literatura, foram implementados períodos variados entre 3 e 6 h6,7,8. O sucesso da indução de BD também pode variar entre diferentes cepas de mouse. Embora as variantes anatômicas entre as cepas de camundongos devam ser limitadas, não fomos capazes de estabelecer o mesmo modelo em ratos BALB/c. Embora o esforço tenha sido limitado a poucos camundongos e nenhuma outra cepa foi testada, recomendamos o uso de C57BL/6, que tem sido utilizado na maioria das pesquisas anteriores8,9. Os autores não têm explicação satisfatória por que o modelo não funcionou na cepa BALB/C. Apenas uma publicação demonstrou até agora um modelo BD usando ratos grandes (35 g) femininos OF-16.
Em resumo, o modelo de mouse descrito aqui representa uma ferramenta valiosa para estudar uma infinidade de alterações fisiopatológicas causadas pelo BD. Embora desafiador, o modelo pode ser otimizado dentro de um prazo razoável e executado de forma padronizada com uma alta taxa de sucesso.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
N.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
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