Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتماسكة لتشفير جين من الاهتمام بشكل عابر باستخدام modRNA بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. في العقد الماضي، أصبح العلاج الجيني خيار علاج واعد لأمراض القلب، نظرا لكفاءته وآثاره العلاجية الاستثنائية. في محاولة لإصلاح الأنسجة التالفة بعد MI، استخدمت دراسات مختلفة العلاج الجيني القائم على الحمض النووي أو الفيروسية ولكن واجهت عقبات كبيرة بسبب التعبير الفقير وغير المنضبط للجينات المسلمة، وذمة، وعدم انتظام ضربات القلب، وضمور القلب. الاصطناعية تعديل مرنا (MODRNA) يقدم نهج العلاج الجيني رواية التي تقدم عالية, عابرة, آمنة, غير مناعة, والسيطرة على تسليم مرنا إلى أنسجة القلب دون أي خطر من التكامل الجينومي. بسبب هذه الخصائص الرائعة جنبا إلى جنب مع الدوائية على شكل جرس في القلب، أصبحت وزارة الدفاع الأميركية نهج جذاب لعلاج أمراض القلب. ومع ذلك، لزيادة فعاليتها في الجسم الحي، يجب اتباع طريقة تسليم متسقة وموثوقة. وبالتالي، لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التسليم MODRNA والاتساق العائد في استخدام MODRNA في التطبيقات في مجال المعلومات الحية، يتم تقديم طريقة الأمثل لإعداد وتسليم حقن داخل القلب modRNA في نموذج MI ماوس. وهذا البروتوكول سيجعل من تسليم وزارة الدفاع الأمريكية أكثر سهولة للأبحاث الأساسية والترجمة.
Introduction
العلاج الجيني هو أداة قوية تنطوي على تقديم الأحماض النووية لعلاج, علاج, أو الوقاية من الأمراض البشرية. على الرغم من التقدم المحرز في الأساليب التشخيصية والعلاجية لأمراض القلب، كان هناك نجاح محدود في توصيل الجينات في احتشاء عضلة القلب (MI) وفشل القلب (HF). كما واضحة كما يبدو عملية العلاج الجيني، بل هو نهج معقد بشكل ملحوظ بالنظر إلى العديد من العوامل التي تحتاج إلى تحسين قبل استخدام وسيلة تسليم معينة. يجب أن يكون ناقل التسليم الصحيح غير مناعيًا وفعالًا ومستقرًا داخل جسم الإنسان. وقد أدت الجهود المبذولة في هذا المجال إلى توليد نوعين من نظم الإيصال: الفيروسية أو غير الفيروسية. وقد أظهرت النظم الفيروسية المستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك نقل الجينات عن طريق الفيروس الغدي، أو الفيروس الرجعي، أو فيروس العدس، أو الفيروس المرتبط بالغدد الهضمية، قدرة تحويلية استثنائية. ومع ذلك، يقتصر استخدامها في العيادات بسبب استجابة المناعة القوية الناجمة1، خطر ورميجانيس2، أو وجود الأجسام المضادة تحييد3، وكلها لا تزال عقبة رئيسية أمام تطبيق واسع وفعال من ناقلات الفيروسية في العلاج الجيني البشري. من ناحية أخرى ، على الرغم من نمط التعبير المثير للإعجاب ، فإن تسليم الحمض النووي البلازمي العاري يعرض كفاءة منخفضة في نقل الحيوانات ، في حين أن نقل مرنا يقدم درجة عالية من المناعة وقابلية التدهور بواسطة RNase4.
مع البحث المكثف في مجال مررنا، أصبحت وزارة الدفاع الأمريكية أداة جذابة لتوصيل الجينات إلى القلب والأعضاء الأخرى المختلفة نظراً لمزاياها العديدة على ناقلات5التقليدية . الاستبدال الكامل للريدين مع نتائج الزائفة التي تحدث بشكل طبيعي في تعبير بروتين أكثر قوة وعابرة ، مع الحد الأدنى من الحث على الاستجابة المناعية الفطرية وخطر الاندماج الجينومي6. بروتوكولات المنشأة مؤخرا استخدام كمية الأمثل من مكافحة عكس الغطاء التناظرية (ARCA) أن يعزز أكثر من ترجمة البروتين عن طريق زيادة استقرار وtransability من الحمض النووي الاصطناعية7.
وقد أظهرت التقارير السابقة التعبير عن مختلف المراسلين أو الجينات الوظيفية التي ألقاها MODRNA في عضلة القلب القوارض بعد MI. مع تطبيقات MODRNA, مناطق كبيرة من عضلة القلب, بما في ذلك كل من cardiomyocytes و noncardiomyocytes, وقد تم بنجاح نقل العدوى بعد إصابة القلب8 للحث على تولد الأوعية9,10, بقاء الخلايا القلبية11, وdydmyocyte تكاثر12. A إدارة واحدة من MODRNA ترميز لحور البصيلاتاتين البشرية مثل 1 يدفع انتشار الماوس الكبار CMs ويزيد بشكل كبير وظيفة القلب، ويقلل من حجم ندبة، ويزيد من كثافة الشعيرات الدموية 4 أسابيع بعد MI12. وأفادت دراسة أكثر حداثة تحسين وظيفة القلب بعد MI مع تطبيق VEGFA MODRNA في نموذج الخنازير10.
وهكذا، مع زيادة شعبية وزارة الدفاع في مجال القلب، فمن الضروري لتطوير وتحسين بروتوكول لتسليم MODRNA إلى القلب بعد MI. هنا هو بروتوكول يصف إعداد وتسليم modRNA المنقى والمحسن في صياغة السيترات المالحة القابلة للتكفو الحيوي التي توفر قوية، تعبير البروتين مستقرة دون تحفيز أي استجابة مناعية. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول والفيديو يوضح الإجراء الجراحي القياسي للفأر MI عن طريق الربط الدائم للشريان الخلفي السفلي الأيسر (LAD) ، يليه ثلاثة حقن داخل القلب من مودرنا. والهدف من هذه الورقة هو تحديد واضح طريقة دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ من تسليم مودرنا إلى عضلة القلب مورين لجعل تطبيق MODRNA يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للعلاج الجيني القلبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية في جبل سيناء.
1. توليفة من وزارة الدفاع
ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل توليف MODRNA في كوندرات وآخرون13.
- طلب القوالب plasmid(جدول المواد)وتوليد منتج PCR نظيفة لاستخدامها كقالب مرنا.
- إعداد modRNAs عن طريق النسخ في المختبر مع مزيج ribonucleoside مخصصة من التالي (جدول المواد):T7 النسخ عدة، 6 mM المضادة للتآكل تناظري (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G، 75 mM guanosine ثلاثي الفوسفات، 75 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات، 75 mM cytidine ثلاثي الفوسفات، 100 mM pseudouridine-5-ثلاثي الفوسفات، وانزيم T7 DNase.
- تنقية modRNA المحرز في الخطوة 1.2 مع مجموعة تنظيف النسخ (جدول المواد) وعلاج مع phosphatase القطب الجنوبي. بعد ذلك ، إعادة تطهير MODRNA مع مجموعة تنظيف النسخ وتحديدها باستخدام مقياس الطيف.
- عجلت MODRNA مع الإيثانول وخلات الأمونيوم و resuspend في 10 mM تريس-HCl و 1 mM EDTA.
- تركز وزارة الدفاعRNA لفي تسليم الجسم الحي من قبل المرشحات الطرد المركزي وقياس الجودة باستخدام منصة الكهربائية الآلي(جدول المواد).
2. إعداد حقن MODRNA لفي تسليم الجسم الحي
- حساب حجم اللازمة ل 100 ميكروغرام من لوسيفيراز (لوك)/كري مودرنا حقن استناداً إلى تركيز MODRNA.
- اخلطي الحجم المحسوب من مودرنا مع أجزاء متساوية من محلول السكروز المعدة في الماء الخالي من النوى (0.3 جم/مل) و 0.1 M citrate حل (درجة حِوية = 7) (20 ميكرولتر لكل من الموصى بها).
- جلب حجم النهائي من الحقن إلى 60 ميكرولتر بإضافة محلول ملحي.
3. جراحة احتشاء عضلة القلب
- تخدير وإعداد الحيوان
ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة ذكوراً وأنثى فئران CFW بعمر 8−12 أسبوعاً.- تخدير الماوس مع isoflurane 2٪ باستخدام غرفة التعريفي ووضع الحيوان على ظهره في موقف الظهر مع قناع الوجه على الأنف والفم للحفاظ على التخدير. الحفاظ على التخدير عن طريق التهوية الميكانيكية باستخدام جهاز التنفس مجهزة أنبوب مجرى الهواء 7-8 مم ومرشح.
- لشل الماوس على منصة الجراحة، وتأمين أطرافه مع الشريط الجراحي. حلق منطقة الرقبة والجانب الأيسر من القفص الصدري وتطهير باستخدام 70٪ الإيثانول واليود povidone. كرر خطوة التطهير مرتين. تحقق من ردود الفعل ، معسر الذيل والقدمين الخلفيتين لتقييم عمق التخدير.
- مراقبة مستمر والحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية في normothermia (37.5-38 درجة مئوية).
- الحفاظ على مجرى الهواء المفتوح عن طريق إجراء النوبات داخل منطقة التنفّاض داخل منطقة التّرَك. للقيام بذلك، ضع الماوس في موقف البطن مع فمه التي تواجه نحو المجرب وسحب بلطف من اللسان. ضبط زاوية الرقبة وتصويب مسار الاحتضان ودفع في قنية الاحتضان.
- في حالة الحيوان غير قادر على التنفس من خلال ذلك، يمكن إجراء استئصال القصبة الهوائية. إجراء شق عنق الرحم على طول خط الوسط عزل الجلد, العضلات, والأنسجة الخطوط العريضة القصبة الهوائية باستخدام المجهر. عندما تكون القصبة الهوائية مرئية بوضوح، أدخل أنبوب البطاية في الأنسجة بين حلقتين خرطوشتين تحت الجلوتيس عن طريق إحداث ثقب صغير وعقد الجزء القحفي من القصبة الهوائية باستخدام ملقط مجهرية.
- مراقبة حركة الصدر من الماوس للتحقق من أن كلا الرئتين تلقي الأوكسجين. يجب أن يكون معدل التنفس (RR) حوالي 120 نفسًا في الدقيقة ، مع ضغط ملهم يبلغ 17-18 سم H2O.
- الربط الشريان تنازلي (LAD) اليسار
- لتنفيذ ربط LAD، بدوره الماوس بعناية حتى أنها ملقاة على جانبها الأيمن. ارفعي الجلد وقمي بإجراء استئصال الصدر من الجانب الأيسر بين الضلعين الثالث والرابع وتشريح الأنسجة والعضلات بعناية. استخدم الكيوتي لمنع النزيف.
- افتح الصدر بعناية وبمجرد فتحه ، ابحث عن القلب ، دون لمس الرئة بأي جسم حاد. ضع الداخرات في الشق للحفاظ على التجويف الصدري مفتوحًا وافتح رؤية واضحة للقلب. الآن نقل الرئتين إلى حافة شق وإزالة جزء من كيس البريكاردي الذي يغطي القلب للوصول إلى السطح الأمامي للقلب.
- حدد بعناية LAD، والتي يمكن أن ينظر إليها على أنها وعاء أحمر فاتح عميق يقع بين الشريان الرئوي والوعاء الأيسر. Ligate و LAD في نطاق صغير مع خياطة واحدة واحدة من خياطة الحرير 7-0. ضع أنبوب الصدر (28 G، قسطرة الوريدي)، بين الضلع الرابع والضلع الخامس.
- أغلق الشق الصدري في الطبقات. استخدام خياطة الحرير 6-0 تشغيل لتكييف الأضلاع واستخدام 5-0 الحرير تشغيل الغرز لإغلاق الجلد. تأكد من ترك نافذة مناسبة لقياس صدى القلب في المستقبل.
- استنزف الصدر بعناية بمحلول متساوي التوتر الدافئ (9 جرام من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء) باستخدام حقنة 2 مل. ضع الماوس على ظهره. إذا كان إجراء استئصال القصبة الهوائية، واتخاذ أنبوب endotracheal بها واستخدام 7-0 خياطة الحرير التكيف مع حلقات خرطوشة القصبة الهوائية مع غرزة واحدة. ضع قناع الوجه على الفأرة واغلق الجلد باستخدام خياطة 5-0 حريرية.
- بالنسبة لمرحلة التعافي، افصلي عن قنية النوبات من جهاز التنفس الصناعي واسمحي بالتنفس التلقائي. وضع الحيوان تحت مصباح الحرارة حتى يصل إلى وعيه. لا تترك الحيوان دون مراقبة بعد الجراحة حتى يكون مستيقظا تماما.
- إدارة علاج الألم مع buprenophine في 0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم, حقن تحت الجلد للأيام 3 المقبلة في فترات 12 ساعة.
4. تسليم القلب من وزارة الدفاع
- تسليم ما مجموعه 60 ميكرولتر من وزارة الدفاع الأمريكية أعدت في الخطوة 2.3 العضلي (IM) باستخدام حقنة الأنسولين (31 G) بعد MI.
- حقن 20 ميكرولتر من وزارة الدفاع في ثلاثة مواقع مختلفة من عضلة القلب المحيطة منطقة نقش (اثنان على جانبي الربط وواحد في القمة). إجراء الحقن مباشرة بعد LAD, قبل إغلاق الصدر.
ملاحظة: يمكن رؤية صور تمثيلية لمواقع حقن MODRNA في الشكل 1.
- حقن 20 ميكرولتر من وزارة الدفاع في ثلاثة مواقع مختلفة من عضلة القلب المحيطة منطقة نقش (اثنان على جانبي الربط وواحد في القمة). إجراء الحقن مباشرة بعد LAD, قبل إغلاق الصدر.
5. التحقق من صحة التعبير البروتين في القلب بعد MI
- Luciferase التعبير MODRNA باستخدام نظام التصوير التخمين الحيوي
ملاحظة: يتم حقن ما مجموعه 100 ميكروغرام من Luc mRNA المعدة في 60 ميكرولتر من العازلة سيترات السكروز مباشرة في قلب الفئران CFW بعد MI.- في 24 ح آخر MI و modRNA حقن, تخدير الفئران مع 2% isoflurane باستخدام غرفة التعريفي وداخلاتونيا حقن لوسيفرين (150 ملغ / ز وزن الجسم) للتحقق من صحة إشارة لوك في الجسم الحي.
- صورة الفئران باستخدام نظام التصوير الشعاعي الحيوي كل 2 دقيقة حتى إشارة لوك تصل إلى التشبع.
- كمّيّة بيانات التصوير المجمّعة مع برنامج تحليل التصوير. استخدم الفئران التي تم حقنها بالملوحة المالحة فقط كقراءة أساسية للتعبير Luc واطرح إشارة الخلفية التي تم جمعها من الفئران المحقونة بالملوحة.
ملاحظة: يتم التعبير عن إشارة لوك في p/s/cm2/sr x 106.
- المناعة للتحقق من صحة نقل Cre
- للتحقق من صحة تروس مع Cre، تضحية الحيوانات 24 ح بعد الحقن باستخدام حقن داخل الصفتون من 100 ملغ/ كغ الكيتامين و 10 ملغ/كغ xylazine تليها خلع عنق الرحم. قبل إجراء شق، تطهير الصدر والبطن باستخدام مسحة الكحول 70٪.
- فتح تجويف الصدر عن طريق جعل شق عرضية ~ 1 سم أقل من القص وتحريك المقص نحو الرأس، وقطع من خلال القفص الصدري.
- افتح الصدر واحقن 1 مل من برنامج تلفزيوني معقمة في غرفة البطين الأيمن لإزالة الدم الزائد. اُخراج القلب فوراً ووضعها في برنامج تلفزيوني معقمة لتغسل الدم المتبقي.
- إصلاح القلب في 4٪ شبهformaldehyde (PFA) لمدة 24 ساعة، تليها حضانة بين عشية وضحاها في محلول السكروز 30٪ في 4 درجة مئوية. في اليوم التالي تضمين قلوب في المتوسط درجة الحرارة القطع الأمثل وقسم لهم بسمك 10 ميكرومتر باستخدام التبريد.
- وصمة عار المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية ضد التروبونين القلبي الأول (cTNI) وتسمية لهم مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية. لتحديد النواة، وصمة عار مع 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق. صورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت.
6 - التحليل الإحصائي
- رسم رسم بياني شريطي استناداً إلى تعبير لوك في الماوس المالحة و الماوس التي تم حقنها لوك و قم بالإبلاغ عن القيم مثل متوسط ± SEM. قارن بين المجموعتين باستخدام اختبار t غير مُزحم (****p < 0.0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تخدير الفئران التي يبلغ عمرها ثمانية إلى عشرة أسابيع باستخدام الأيزوفلوران والمخاتنة. بعد أن كان الحيوان تحت التخدير، تم حلق المنطقة الصدرية اليسرى وتعقيمها بالإيثانول، وتعرض القلب لأربطة LAD. تم انسداد الشريان التاجي الأيسر من قبل عقدة بحزم خياطة تحت الشريان (الرسم البياني الشكل 1A). بعد احتشاء ناجحة (المشار إليها من ابال الجدار الحر البطين الأيسر)، تم تسليم حقن مباشر من 100 ميكروغرام لوك أو كري MODRNA حل في عازلة سيترات السكروز مباشرة في عضلة القلب في ثلاثة مواقع مختلفة(الشكل 1B)المحيطة منطقة إصابة باستخدام حقنة الأنسولين. استمر إجراء MI مع حقن مودرنا لمدة 30−45 دقيقة لكل. وأظهرت الحيوانات ما يقرب من 90٪ معدل البقاء على قيد الحياة بعد الإجراء. بعد العملية، تم خياطة الصدر والجلد بقوة في طبقات وتم إزالة الحيوان من التهوية بمجرد أن بدأ يتنفس بشكل طبيعي.
بعد إجراء ربط LAD والتسليم اللاحق لحقن Luc modrna ، قمنا بالتحقق من نقل Luc modRNA عن طريق التحقق من تعبير بروتين Luc 24 h postinjection باستخدام نظام تصوير التخمة الحيوية (الشكل 2A). أنشأنا في المنشورات السابقة أنه على الرغم من أن التعبير عن البروتين يمكن أن ينظر إليه حتى اليوم 6 posttransfection، لوحظ أعلى كفاءة من مودرنا في 24 ح8. وبالمثل، اكتشفنا بنجاح إشارة لوك في القلب تعامل مع حقن Luc modRNA (1.76 × 108) مقارنة بالفئران التي حقنت مع محلول السكروز سيترات بعد MI (3.0 × 105) (الشكل 2B).
علاوة على ذلك ، سعينا للتحقق من صحة التعبير MODRNA من خلال التحقق من ترجمته وdisdistribution في الماوس Rosa26mTmG المعدلة وراثيا. هذا النظام نموذج الماوس يعبر عن غشاء الخلية المترجمة tdTomato (mT) التعبير الفلوري في جميع خلايا الجسم / الأنسجة والتغيرات في غشاء الخلية المترجمة EGFP (mG) التعبير الفلوري على إعادة الكومبينيشن. وهكذا، لمراقبة التعبير عن وزارة الدفاع Cre modRNA، تم حقن 100 ميكروغرام Cre modRNA مباشرة في عضلة القلب بعد MI في Rosa26mTmG ذكور وفئران إناث، والحيوانات تم التضحية بها 24 ساعة بعد الجراحة. تم إصلاح القلوب ومعالجتها للمناعة مع علامة القلب cTNI وعلامة النووية DAPI (الشكل 3A). وكان التعبير الناجح Cre واضحًا بسبب ظهور الخلايا الملونة الخضراء (الشكل 3B) ، والتي كانت نتيجة لإعادة التركيب مع Cre modRNA تسليمها إلى الماوس ، ممثلة في تغيير لون tdTomato إلى EGFP حول موقع حقن Cre (الشكل 3C).
الشكل 1: ربط LAD وتسليم القلب من وزارة الدفاع. (أ) مخطط تخطيطي يبين منطقة ربط LAD وثلاثة مواقع من حقن MODRNA. (B) صور تمثيلية لكامل الماوس القلب آخر MI ناجحة الناجمة عن الربط الدائم (أ) ومواقع حقن MODRNA بعد MI. تم تسليم 100 ميكروغرام من وزارة الدفاع MODRNA في 60 ميكرولتر من sucrose citrate العازلة في منطقة الحدود المحيطة احتشاء، واثنين على جانبي الربط (ب،ج) وواحد في قمة (د). شريط مقياس = 1 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لوك تحليل التعبير بعد حقن MODRNA. تم حقن المخزن المؤقت للسيترات السكروز الذي يحتوي على 100 ميكروغرام من Luc modrna مباشرة في عضلة القلب من فئران CFW في جراحة في الصدر المفتوح. تم استخدام نظام تصوير الإضاءة الحيوية لحساب تعبير بروتين لوك في 24 ساعة بعد الحقن. (A) الصور الإنارة الحيوية المقارنة فئران التحكم (المصابة بالمخزن المؤقت فقط) مقابل الفئران التي تم حقنها بـ Luc modRNA. (B) القياس الكمي للإشارة لوك مقارنة مع الفئران التحكم تقاس بعد 24 ساعة باستخدام التصوير الاحتياد الحيوي. يمثل شريط الخطأ SEM مع p < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق من صحة التعبير Cre في vivo. صور تمثيلية لأقسام القلب العرضية (عرض المحور القصير) التحقق من صحة التعبير من وزارة الدفاع في Rosa26mTmG الفأرة 24 ساعة بعد الحقن. (أ) القلبيةالماعَدَة بالمناعة مع cTNI (أحمر). (B) الخلايا الملونة الخضراء تمثل الخلايا العابرة للكري. (C) صورة مدمجة تظهر الخلايا النشطة كري حول الحقن اثنين. الأزرق هو وصمة عار النووية DAPI. شريط مقياس = 1 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت العلاج الجيني إمكانات هائلة لدفع كبير في علاج أمراض القلب. ومع ذلك, الأدوات التقليدية المستخدمة في التجارب السريرية الأولية لعلاج HF أظهرت نجاحا محدودا وترتبط بآثار جانبية شديدة. الحمض النووي الريبي المعدل يقدم تسليم الجينات غير الفيروسية التي تكتسب شعبية باستمرار كأداة نقل الجينات في القلب. ModRNA لا يتطلب توطين النووية الجينات للترجمة، وبالتالي يوفر تعبير فعال وسريع من البروتين. وعلاوة على ذلك، بما أن الرنا لا يندمج في مستضيف الجينوم، فإن تسليم الجينات من قبل وزارة الدفاع يتخطى خطر الطفرات. ونتيجة لذلك، ونظرا لمزاياها على مركبات تسليم الجينات التقليدية، أصبحت وزارة الدفاع الأمريكية واحدة من أكثر المنصات جاذبية لإيصال الجينات أو الجينات الفردية إلى القلب. ومع ذلك، حتى الآن لا يوجد بروتوكول موحد لإعداد ونقل وزارة الدفاع في مرحلة ما بعد ا.ا.ا.1. وهكذا، كان الهدف هنا وضع بروتوكول قياسي ومحسن لتسليم داخل القلب من مودرنا في قلب القوارض لتحسين استخدام MODRNA كأداة للعلاج الجيني وجعله مناسبًا للأغراض العلاجية.
في هذا البروتوكول، يتم إعداد MODRNA عن طريق استبدال الأريدين مع الزائفة، تليها تغطية مع ARCA في نهاية 5'. وقد ثبت هذه التغييرات في الهيكل الثانوي من مرنا لتقديم أعلى ترجمة البروتين بالمقارنة مع مختلف التعديلات النيوكليوتيدات الأخرى8. وعلاوة على ذلك، هذا الهيكل MRNA غيرت يهرب من المناعة بعد حقن الدردشة في الفئران عن طريق الحد من الاعتراف به عن طريق مستقبلات مثل حصيلة والنوى6. هنا، أظهرنا أن تسليم مرنا عارية مع sucrose citrate العازلة تنتج ترجمة بروتين قوية في القلب باستخدام نموذج MI الماوس. في دراساتنا السابقة، أنشأنا تفوق MODRNA تسليمها مع sucrose citrate العازلة في القلب بالمقارنة مع تغليف وزارة الدفاع في الجسيمات النانوية، كما هو الحال في vivo fectamine أو في الجسم الحي jetPEI، والتي قد تعوق ترجمة وزارة الدفاع الأميركية إلى البروتين8. حفظ عالية من RNA من قبل سترات والطاقة الإضافية التي تقدمها السكروز للبذاءة، بالإضافة إلى إنقاذ تكتل MODRNA واحد تقطعت بهم السبل يمكن أن يكون السبب في الزيادة الملحوظة في ترجمة وزارة الدفاع الأمريكية تسليمها في sucrose citrate العازلة.
على الرغم من أن استخدام MODRNA تصاعدت في الدراسات قبل السريرية والسريرية10,14 في العقد الماضي, بعض المناطق تحتاج إلى التحقيق لتحسين نجاح وزارة الدفاع في العيادة. أولاً، يمكن أن يكون توليف وزارة الدفاع في الكميات العالية المطلوبة للتحقيقات العلاجية باهظة التكلفة. وبالتالي، فمن الضروري لتطوير السريرية الصف وفعالة من حيث التكلفة MODRNA لتحريك الحقل نحو مرحلة العلاج بالرنا السريرية في البشر. ثانياً، يجب تحديد طريقة تسليم قابلة للتطبيق سريرياً لمودرنا. النظر في الأضرار الناجمة عن حقن IM القلب, أقل الغازية قسطرة تعتمد على طرق التسليم قد يكون أكثر معقولية في نقل كمية كبيرة من MODRNA اللازمة لنقل قلوب كبيرة.
في الختام، أظهر هذا العمل نجاح تسليم الحمض النووي الريبي التي تحتوي على تعديلات الزائفة في قلب الفأرة بعد MI. تسليم MODRNA في sucrose سيترات العازلة أسفرت عن تعبير بروتين قوي 24 ساعة بعد الحقن. هذا البروتوكول يتيح للباحثين اتباع عملية تسليم موحدة وتقييم البروتين في إصابة ما بعد القلب وبالتالي توفير المزيد من إمكانية الوصول في إعداد وتسليم وزارة الدفاع عن حقوق الإنسان لأبحاثهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفان بـ آن أنو كوريان لمساعدتها في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء أمراض القلب التي قدمت لمختبر زنجي وكذلك من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
