Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद मोडरना का उपयोग करके रुचि के जीन को क्षणिक रूप से अपरेगुलेट करने का एक सरल और सुसंगत तरीका प्रस्तुत करता है।
Abstract
मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) पश्चिमी दुनिया में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। पिछले एक दशक में, जीन थेरेपी हृदय रोग के लिए एक आशाजनक उपचार विकल्प बन गया है, अपनी दक्षता और असाधारण चिकित्सीय प्रभाव के कारण । क्षतिग्रस्त ऊतक पोस्ट-एमआई की मरम्मत के प्रयास में, विभिन्न अध्ययनों ने डीएनए आधारित या वायरल जीन थेरेपी को नियोजित किया है, लेकिन वितरित जीन, एडेमा, अतालता और हृदय अतिशस्त्री की खराब और अनियंत्रित अभिव्यक्ति के कारण काफी बाधाओं का सामना करना पड़ा है । सिंथेटिक संशोधित एमआरएनए (मोडरना) एक उपन्यास जीन थेरेपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है जो जीनोमिक एकीकरण के किसी भी जोखिम के बिना दिल के ऊतकों को उच्च, क्षणिक, सुरक्षित, गैर-िममुमोजेनिक और नियंत्रित एमआरएनए डिलीवरी प्रदान करता है। दिल में अपनी घंटी के आकार के फार्माकोकिनेटिक्स के साथ संयुक्त इन उल्लेखनीय विशेषताओं के कारण, मोडरना हृदय रोग के उपचार के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, वीवो में इसकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए, एक सुसंगत और विश्वसनीय वितरण विधि का पालन करने की आवश्यकता है। इसलिए, वीवो अनुप्रयोगों में मोडरना वितरण दक्षता और प्रोडर्ना उपयोग में उपज स्थिरता को अधिकतम करने के लिए, माउस एमआई मॉडल में मोडरना इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन की तैयारी और वितरण की एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत की जाती है। यह प्रोटोकॉल बुनियादी और अनुवादात्मक अनुसंधान के लिए मोडरना डिलीवरी को अधिक सुलभ बनाएगा।
Introduction
जीन थेरेपी एक शक्तिशाली उपकरण है जिसमें मानव रोगों के उपचार, इलाज या रोकथाम के लिए न्यूक्लिक एसिड की डिलीवरी शामिल है। हृदय रोग के लिए नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोणों में प्रगति के बावजूद, मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) और हार्ट फेलियर (एचएफ) में जीन के वितरण में सीमित सफलता मिली है। जीन थेरेपी की प्रक्रिया के रूप में के रूप में सीधा लगता है, यह एक स्पष्ट रूप से जटिल कई कारकों है कि एक विशेष प्रसव वाहन को रोजगार से पहले अनुकूलित करने की जरूरत पर विचार दृष्टिकोण है । मानव शरीर के अंदर सही डिलीवरी वेक्टर गैर-इम्यूनोजेनिक, कुशल और स्थिर होना चाहिए। इस क्षेत्र में प्रयासों ने दो प्रकार के वितरण प्रणालियों को उत्पन्न किया है: वायरल या गैर-वायरल। एडेनोवायरस, रेट्रोवायरस, लेंटीवायरस, या एडेनो से जुड़े वायरस द्वारा जीन हस्तांतरण सहित व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली वायरल प्रणालियों ने असाधारण ट्रांसडक्शन क्षमता दिखाई है । हालांकि, क्लीनिक में उनका उपयोग मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित1,ट्यूमरजीनेसिस2का जोखिम, या एंटीबॉडी3को बेअसर करने की उपस्थिति के कारण सीमित है, जिनमें से सभी मानव जीन थेरेपी में वायरल वैक्टर के व्यापक और प्रभावी अनुप्रयोग के लिए एक बड़ी बाधा बने हुए हैं। दूसरी ओर, उनके प्रभावशाली अभिव्यक्ति पैटर्न के बावजूद, नग्न प्लाज्मिड डीएनए का वितरण कम ट्रांसफैक्शन दक्षता प्रदर्शित करता है, जबकि एमआरएनए हस्तांतरण आरएनएसई4द्वारा उच्च इम्यूनोजेनिसिटी और क्षरण के प्रति संवेदनशीलता प्रस्तुत करता है।
एमआरएनए के क्षेत्र में व्यापक शोध के साथ, मोडरना पारंपरिक वैक्टर 5 परइसकेकई फायदों के कारण हृदय और विभिन्न अन्य अंगों में जीन के वितरण के लिए एक आकर्षक उपकरण बन गया है। स्वाभाविक रूप से होने वाली छद्म मूत्र डाइन के साथ यूरिडीन के पूर्ण प्रतिस्थापन के परिणामस्वरूप सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और जीनोमिक एकीकरण6का जोखिम कम से कम होता है। हाल ही में स्थापित प्रोटोकॉल एंटी-रिवर्स कैप एनालॉग (एआरएए) की एक अनुकूलित मात्रा का उपयोग करते हैं जो सिंथेटिक एमआरएनए 7 कीस्थिरताऔर पारणीयता को बढ़ाकर प्रोटीन अनुवाद को और बढ़ाता है।
पिछली रिपोर्टों में एमआई के बाद कृंतक मायोकार्डियम में मोडरना द्वारा दिए गए विभिन्न रिपोर्टर या कार्यात्मक जीन की अभिव्यक्ति दिखाई गई है । मोडरना अनुप्रयोगों के साथ, कार्डियोमायोसाइट्स और नॉनकार्डियोमायोसाइट्स दोनों सहित मायोकार्डियम के महत्वपूर्ण क्षेत्रों को सफलतापूर्वक हृदय की चोट के बाद8 संक्रमित किया गया है ताकि एंजियोजेनेसिस9,10,कार्डियक सेल सर्वाइवल11और कार्डियोमायोसाइट प्रसार12को प्रेरित किया जा सके।, उत्परिवर्तित मानव फोलिस्टाटिन की तरह 1 के लिए इनकोडेड मोडरना का एक प्रशासन माउस वयस्क सीएम के प्रसार को प्रेरित करता है और कार्डियक फंक्शन को काफी बढ़ाता है, निशान का आकार कम करता है, और एमआई12के बाद 4 सप्ताह के कैपरी घनत्व को बढ़ाता है। हाल ही में एक और अध्ययन में एक सूअर मॉडल10में VEGFA modRNA के आवेदन के साथ एमआई के बाद हृदय समारोह में सुधार की सूचना दी ।
इस प्रकार, हृदय क्षेत्र में मोडरना की बढ़ती लोकप्रियता के साथ, एमआई के बाद दिल में मोडरना के वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित करना आवश्यक है। इसके बाद एक प्रोटोकॉल है जो एक जैव संगत साइट्रेट-खारा निर्माण में शुद्ध और अनुकूलित मोडर्ना की तैयारी और वितरण का वर्णन करता है जो किसी भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित किए बिना मजबूत, स्थिर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल और वीडियो में दिखाई गई विधि बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (बालक) के स्थायी बंधन द्वारा माउस एमआई की मानक शल्य प्रक्रिया को दर्शाती है, जिसके बाद मोडरना के तीन साइट इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन होते हैं। इस पेपर का उद्देश्य कार्डियक जीन थेरेपी के लिए मोडरना एप्लिकेशन को व्यापक रूप से सुलभ बनाने के लिए मुरीन मायोकार्डियम को मोडरना डिलीवरी की एक अत्यधिक सटीक और प्रजनन योग्य विधि को स्पष्ट रूप से परिभाषित करना है।
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Protocol
यहां उल्लिखित सभी पशु प्रक्रियाओं को माउंट सिनाई इंस्टीट्यूशनल केयर एंड यूज कमेटी में इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा मंजूरी दी गई है ।
1. मोडरना का संश्लेषण
नोट: मोडरना संश्लेषण का विवरण कोंडरेट एट अल13में पाया जा सकता है ।
- प्लाज्मिड टेम्पलेट्स(सामग्री की तालिका) काआदेश दें और एमआरएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए एक स्वच्छ पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करें।
- निम्नलिखित(सामग्रीकी तालिका) के अनुकूलित राइबोन्यूक्लियोसाइड मिश्रण के साथ विट्रो में ट्रांसक्रिप्शन द्वारा modRNAs तैयार करें: T7 ट्रांसक्रिप्शन किट, 6 एमएम एंटी-रिवर्स कैप एनालॉग (एआरएए) 30-ओ-एम-एम-एम 7जी (50) पीपीपी (50) जी, 75 एमएमएम ग्वानोसाइन ट्राइफॉस्फेट, 75 एमएम एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट, 75 एमएम साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट, 100 एमएम स्यूडोयूडीन-5-ट्रिप्होस्फेट, और टी 7 डीनैस एंजाइम।
- एक ट्रांसक्रिप्शन क्लीनअप किट(सामग्री की तालिका)के साथ चरण 1.2 में किए गए मोडरना को शुद्ध करें और अंटार्कटिक फॉस्फेट के साथ इलाज करें। इसके बाद, ट्रांसक्रिप्शन क्लीनअप किट के साथ मोडरना को फिर से प्रमाणित करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके इसे निर्धारित करें।
- 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल और 1 एमएम ईडीटीए में इथेनॉल और अमोनियम एसीटेट और रिसिपेंड के साथ मोडरना को उपजी।
- सेंट्रलाइज फिल्टर्स द्वारा वीवो डिलीवरी में मोडरना को केंद्रित करें और एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस प्लेटफॉर्म(सामग्रियों की तालिका) काउपयोग करके गुणवत्ता को मापें।
2. वीवो डिलीवरी में मोडरना इंजेक्शन की तैयारी
- मोडरना एकाग्रता के आधार पर लूसिफ़ेरेस (ल्यूक)/क्रे मोडरना इंजेक्शन के 100 माइक्रोग्राम के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
- न्यूक्लियस मुक्त पानी (0.3 ग्राम/एमएल) और 0.1 एम साइट्रेट समाधान (पीएच = 7) (प्रत्येक अनुशंसित 20 माइक्रोन) में तैयार सुक्रोज समाधान के बराबर हिस्सों के साथ मोडरना की गणना की गई मात्रा को मिलाएं।
- खारा समाधान जोड़कर इंजेक्शन की अंतिम मात्रा 60 माइक्रोन में लाएं।
3. मायोकार्डियल इंफेक्शन सर्जरी
- संज्ञाहरण और जानवर की तैयारी
नोट: यह अध्ययन पुरुष और महिला CFW चूहों का उपयोग करता है 8−12 सप्ताह पुराना है ।- एनेस्थेटाइज माउस को एक इंडक्शन चैंबर का उपयोग करके 2% आइसोफ्लुन के साथ और एनेस्थीसिया को बनाए रखने के लिए जानवर को अपनी नाक और मुंह पर फेसमास्क के साथ एक पृष्ठीय स्थिति में रखें। 7−8 मिमी वायुमार्ग ट्यूब और एक फिल्टर से लैस श्वसन यंत्र का उपयोग करके यांत्रिक वेंटिलेशन द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें।
- सर्जरी मंच पर माउस को स्थिर करने के लिए, सर्जिकल टेप के साथ अपने अंगों को सुरक्षित करें। गर्दन क्षेत्र और रिबकेज के बाईं ओर दाढ़ी और 70% इथेनॉल और povidone आयोडीन का उपयोग कर कीटाणुरहित। कीटाणुशोकित कदम को दो बार दोहराएं। संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए पूंछ और पिछले पैरों को चुटकी लेते हुए इसकी सजगता की जांच करें।
- नॉर्मथथर्मिया (37.5−38 डिग्री सेल्सियस) पर कोर बॉडी के तापमान की लगातार निगरानी और रखरखाव करते हैं।
- इंट्राचेल इंटुबेशन करके एक खुला वायुमार्ग बनाए रखें। ऐसा करने के लिए, माउस को प्रयोगकर्ता की ओर अपने मुंह के साथ एक वेंट्रल स्थिति में रखें और धीरे-धीरे जीभ को खींचें। गर्दन के कोण को समायोजित करें और इंडबेशन पथ को सीधा करें और इंडूबेशन कैनुला में पुश करें।
- यदि जानवर इसके माध्यम से सांस लेने में असमर्थ है, तो ट्रेकोस्टोमी किया जा सकता है। एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर श्वासनली रूपरेखा त्वचा, मांसपेशियों, और ऊतक को अलग करने के लिए मिडलाइन के साथ एक ग्रीवा चीरा प्रदर्शन करते हैं। जब श्वासनली स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही हो, तो एक छोटा छेद बनाकर ग्लोटिस के नीचे दो कारतूस के छल्ले के बीच ऊतक में एंडोट्रेक्ल ट्यूब डालें और माइक्रोसर्जिकल संदंश का उपयोग करके श्वासनली के कपाल भाग को पकड़ें।
- माउस के वक्ष आंदोलन का निरीक्षण करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि दोनों फेफड़ों को ऑक्सीजन मिल रही है। श्वसन दर (आरआर) प्रति मिनट लगभग 120 साँस होनी चाहिए, जिसमें 17−18 सेमी एच2ओ का प्रेरक दबाव होना चाहिए।
- वाम पूर्वकाल उतरते (बालक) धमनी बंधन
- बालक बंधन प्रदर्शन करने के लिए, माउस को ध्यान से चालू करें ताकि यह अपनी दाईं ओर झूठ बोल रहा हो। त्वचा को उठाएं और 3 और चौथी पसली के बीच एक बाएं तरफा थोराकोटॉमी करें और ऊतक और मांसपेशियों को सावधानी से विच्छेदन करें। रक्तस्राव को रोकने के लिए एक कॉटरी का उपयोग करें।
- छाती को ध्यान से खोलें और एक बार खुला होने के बाद, किसी भी तेज वस्तु के साथ फेफड़ों को छूने के बिना दिल को ढूंढें। वक्ष गुहा को खुला रखने के लिए रिट्रैक्टर्स को चीरा में रखें और दिल का स्पष्ट दृश्य रखें। अब फेफड़ों को चीरा के किनारे ले जाएं और हृदय की पूर्वकाल की सतह तक पहुंचने के लिए हृदय को कवर करने वाली पेरिकार्डियल थैली के उस हिस्से को हटा दें।
- ध्यान से बालक की पहचान करें, जिसे फेफड़े की धमनी और बाएं अर्क के बीच स्थित एक गहरी हल्के लाल पोत के रूप में देखा जा सकता है। एक 7-0 रेशम सीवन के एक एकल सीवन के साथ बालक समीपस्थ Ligate । 4 और 5 पसली के बीच एक छाती ट्यूब (28 जी, venal कैथेटर) रखें।
- परतों में वक्ष चीरा बंद करें। पसलियों को अनुकूल बनाने के लिए 6-0 रेशम चल रहे टांके का उपयोग करें और त्वचा को बंद करने के लिए 5-0 रेशम चल रहे टांके का उपयोग करें। भविष्य इकोकार्डियोग्राफिक माप के लिए एक उचित खिड़की छोड़ना सुनिश्चित करें।
- 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करके गर्म आइसोटोनिक समाधान (1 एल पानी में 9 ग्राम सोडियम क्लोराइड) के साथ छाती को सावधानीपूर्वक छान लें। माउस को अपनी पीठ पर रखें। यदि ट्रेकोस्टोमी का प्रदर्शन करते हैं, तो एंडोट्रेक् सील ट्यूब को बाहर निकालें और 7-0 रेशम टांके का उपयोग करके एक एकल सिलाई के साथ श्वासनली कारतूस के छल्ले को अनुकूलित करें। माउस पर फेस मास्क रखें और 5-0 सिल्क रनिंग टांके का इस्तेमाल करते हुए स्किन को बंद कर दें।
- रिकवरी चरण के लिए, इंस्टुबेशन कैनुला को वेंटिलेटर से डिस्कनेक्ट करें और सहज श्वास की अनुमति दें। जानवर को एक गर्मी दीपक के नीचे रखें जब तक कि वह चेतना प्राप्त न कर ले। सर्जरी के बाद जानवर को उपेक्षित न छोड़ें जब तक कि यह पूरी तरह से जाग न जाए।
- 0.1 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन पर बुप्रेन्नोफिन के साथ दर्द चिकित्सा का प्रबंधन, 12 घंटे के अंतराल पर अगले 3 दिनों के लिए चमड़े के इंजेक्शन ।
4. मोडरना की कार्डियक डिलीवरी
- एमआई के बाद इंसुलिन सिरिंज (31 जी) का उपयोग करके चरण 2.3 इंट्रामस्क्युलरली (आईएम) में तैयार मोडरना के कुल 60 माइक्रोन वितरित करें।
- इनफार्ट क्षेत्र (दो लिगेशन के दोनों तरफ और शीर्ष में एक) के आसपास के दिल की मांसपेशियों के तीन अलग-अलग स्थलों पर मोडरना के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें। छाती बंद करने से पहले, बालक के तुरंत बाद इंजेक्शन करें।
नोट: मोडरना इंजेक्शन साइटों की प्रतिनिधि छवियां चित्र 1में देखी जा सकती हैं ।
- इनफार्ट क्षेत्र (दो लिगेशन के दोनों तरफ और शीर्ष में एक) के आसपास के दिल की मांसपेशियों के तीन अलग-अलग स्थलों पर मोडरना के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें। छाती बंद करने से पहले, बालक के तुरंत बाद इंजेक्शन करें।
5. हार्ट पोस्ट एमआई में प्रोटीन अभिव्यक्ति सत्यापन
- बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके लूसिफ़ेरेस मोडरना अभिव्यक्ति
नोट: सुक्रोज साइट्रेट बफर के 60 माइक्रोन में तैयार ल्यूक एमआरएनए के कुल 100 माइक्रोन को एमआई के बाद सीधे सीएफडब्ल्यू चूहों के दिल में इंजेक्ट किया जाता है।- 24 घंटे पोस्ट एमआई और मोडरना इंजेक्शन में, एक इंडक्शन चैंबर का उपयोग करके 2% आइसोफ्लोरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और वीवो में ल्यूक सिग्नल को मान्य करने के लिए ल्यूकेफ़ेरिन (150 मिलीग्राम/जी शरीर के वजन) को इंजेक्ट करें।
- इमेज एक बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके चूहों को हर 2 मिनट में जब तक ल्यूक सिग्नल संतृप्ति तक नहीं पहुंचता है।
- इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ एकत्र इमेजिंग डेटा की मात्रा। केवल ल्यूक अभिव्यक्ति के लिए एक बेसलाइन पढ़ने के रूप में खारा के साथ इंजेक्शन चूहों का उपयोग करें और खारा इंजेक्शन चूहों से एकत्र पृष्ठभूमि संकेत घटाना ।
नोट: ल्यूक सिग्नल पी/एस/सेमी2/एसआरएक्स १० ६ में व्यक्त कियाजाताहै ।
- क्रे ट्रांसफेक्शन सत्यापन के लिए इम्यूनोस्टेपिंग
- क्रे के साथ ट्रांसफैक्शन को मान्य करने के लिए, 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके जानवरों को 24 घंटे पोस्टिनजेक्शन का त्याग करें और इसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था होती है । चीरा लगाने से पहले, 70% शराब झाड़ू का उपयोग करके छाती और पेट को कीटाणुरहित करें।
- उरोस्थि से एक ट्रांसवर्स चीरा ~ 1 सेमी कम बनाकर वक्ष गुहा खोलें और सिर की ओर कैंची ले जाएं, रिब पिंजरे के माध्यम से काटें।
- छाती खोलें और अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए सही वेंट्रिकुलर कक्ष में बाँझ पीबीएस के 1 एमएल इंजेक्ट करें। बचे हुए खून को धोने के लिए तुरंत हार्ट को एक्साइज करें और बाँझ पीबीएस में रखें।
- 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में दिल को ठीक करें, इसके बाद रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज समाधान में इनक्यूबेशन। अगले दिन इष्टतम काटने के तापमान माध्यम में दिलों को एम्बेड करें और उन्हें क्रायोस्टेट का उपयोग करके 10 माइक्रोन की मोटाई पर अनुभाग करें।
- कार्डियक ट्रोपोनिन I (cTNI) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों को दाग दें और उन्हें फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल करें। नाभिक की पहचान करने के लिए, 5 मिनट के लिए 4',6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के साथ दाग। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइड छवि करें।
6. सांख्यिकीय विश्लेषण
- खारा और ल्यूक इंजेक्शन चूहों में ल्यूक अभिव्यक्ति के आधार पर एक बार ग्राफ प्लॉट और मतलब ± SEM के रूप में मूल्यों की रिपोर्ट । एक अकर्दे टी परीक्षण (***** पी & ०.०००१) का उपयोग कर दो समूहों की तुलना करें ।
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Representative Results
आठ से दस सप्ताह पुराने चूहों को आइसोफ्लुरेन और इंस्टुबेट के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया गया था । जानवर संज्ञाहरण के तहत होने के बाद, बाएं वक्ष क्षेत्र को मुंडा और इथेनॉल के साथ निष्फल किया गया था, और बालक लिगेशन के लिए दिल उजागर हुआ था। बाएं कोरोनरी धमनी को धमनी (आरेख प्रतिनिधित्व चित्रा 1 ए)के तहत सीवन को मजबूती से गाँठकर कम किया गया था। एक सफल इंफार्मेशन (बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार के पालिंग द्वारा इंगित) के बाद, सुक्रोज साइट्रेट बफर में भंग ल्यूक या क्रे मोडरना के 100 माइक्रोन का सीधा इंजेक्शन सीधे इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके चोट क्षेत्र के आसपास के तीन अलग-अलग साइटों(चित्रा 1 बी)पर मायोकार्डियम में वितरित किया गया था। मोडरना इंजेक्शन के साथ एमआई प्रक्रिया प्रति जानवर 30−45 मिनट तक चली। जानवरों ने लगभग 90% जीवित रहने की दर पोस्टप्रोसडरी दिखाई। प्रक्रिया के बाद, छाती और त्वचा को मजबूती से परतों में सुचर किया गया था और जैसे ही यह सामान्य रूप से सांस लेने लगा, जानवर को वेंटिलेशन से हटा दिया गया था।
बालक लिगेशन और ल्यूक मोडरना इंजेक्शन के बाद वितरण के बाद, हमने बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके ल्यूक प्रोटीन एक्सप्रेशन 24 एच पोस्टिनजेक्शन की जांच करके ल्यूक मोडरना ट्रांसफैक्शन को मान्य किया। हमने पिछले प्रकाशनों में स्थापित किया था कि हालांकि प्रोटीन अभिव्यक्ति को 6 पोस्टट्रांसफेक्शन तक देखा जा सकता है, लेकिन मोडरना की उच्चतम ट्रांसफेक्शन दक्षता 24 एच8पर देखी जाती है। इसी तरह, हमने एमआई (3.0 x 105)(चित्रा 2 बी)के बाद सुक्रोज साइट्रेट बफर के साथ इंजेक्शन चूहों की तुलना में ल्यूक मोडरना इंजेक्शन(1.76x 10 8) के साथ इलाज किए गए दिल में ल्यूक सिग्नल का सफलतापूर्वक पता लगाया।
इसके अलावा, हमने ट्रांसजेनिक रोजा26एमटीएमजी माउस में इसके अनुवाद और बायोवाइडेंब्यूशन की जांच करके मोडरना अभिव्यक्ति को मान्य करने की मांग की। यह माउस मॉडल प्रणाली शरीर की सभी कोशिकाओं/ऊतकों में कोशिका झिल्ली-स्थानीयकृत टीडीटोमाटो (एमटी) फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति और क्रे रीकॉम्बिनेशन पर कोशिका झिल्ली-स्थानीयकृत ईजीएफपी (एमजी) फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति में परिवर्तन को व्यक्त करती है। इस प्रकार, क्रे मोडरना की अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए, 100 माइक्रोन क्रे मोडरना को सीधे रोजा26एमटीएमजी पुरुष और मादा चूहों में मायोकार्डियम पोस्ट-एमआई में इंजेक्ट किया गया था, और जानवरों को 24 एच पोस्टसर्जरी का बलिदान किया गया था। कार्डियोमायोसाइट मार्कर सीटीएनआई और न्यूक्लियर मार्कर डीएपीआई(चित्रा 3 ए)के साथ इम्यूनोस्टेटिंग के लिए दिल तय और संसाधित किए गए थे। सफल क्रे अभिव्यक्ति हरे रंग की कोशिकाओं(चित्रा 3 बी)की उपस्थिति के कारण स्पष्ट थी, जो माउस को वितरित क्रे मोडर्ना के साथ पुनर्संयोजन का परिणाम था, जो क्रे इंजेक्शन साइट(चित्रा 3 सी)के आसपास EGFP के लिए tdTomato रंग के परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता था।
चित्रा 1: बालक बंधन और मोदर्ना की हृदय वितरण। (ए)योजनाबद्ध आरेख बालक लिगेशन के क्षेत्र और मोडरना इंजेक्शन की तीन साइटों को दिखाता है । (ख)पूरे माउस हार्ट की प्रतिनिधि छवियां एमआई के बाद स्थायी लिगेशन(ए)और मोडरना इंजेक्शन की साइटों द्वारा प्रेरित एक सफल एमआई पोस्ट करती हैं। सुक्रोज साइट्रेट बफर के 60 माइक्रोन में भंग मोडरना का 100 माइक्रोन इन्फेक्शन के आसपास के सीमा क्षेत्र क्षेत्र में दिया गया था, दो लिगेशन(बी,सी)के दोनों तरफ और एक शीर्ष(डी)में। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: ल्यूक अभिव्यक्ति विश्लेषण पोस्ट modRNA इंजेक्शन। ल्यूक मोडरना के 100 माइक्रोग्राम वाले सुक्रोज साइट्रेट बफर को खुली छाती की सर्जरी में सीधे सीएफडब्ल्यू चूहों के मायोकार्डियम में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में ल्यूक प्रोटीन अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया गया था। (क)नियंत्रण चूहों की तुलनात्मक बायोल्यूमिनेसेंट छवियां (केवल बफर से संक्रमित) बनाम चूहों को ल्यूक मोडरना के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (ख)बायोल्यूमिनेसेंस इमेजर का उपयोग करके 24 घंटे के बाद मापा गया नियंत्रण चूहों की तुलना में ल्यूक सिग्नल का मात्राकरण। त्रुटि बार पी एंड एलटी के साथ एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: वीवो में क्रे अभिव्यक्ति का सत्यापन। इंटर26एमटीएमजी माउस में क्रे मोडरना की अभिव्यक्ति को मान्य करने वाले ट्रांस संक्रमित हार्ट क्रॉस सेक्शन (शॉर्ट-एक्सिस व्यू) की प्रतिनिधि छवियां 24 घंटे बाद। (A)सीटीएनआई (लाल) के साथ कार्डियोमायोसाइट्स इम्यूनोटाग । (ख)हरे रंग की कोशिकाएं क्रे संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। (ग)विलय छवि दो इंजेक्शन के आसपास सीआरई सक्रिय कोशिकाओं दिखा । नीला परमाणु दाग DAPI है। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
जीन थेरेपी ने हृदय रोग के उपचार को काफी आगे बढ़ाने की जबरदस्त क्षमता दिखाई है । हालांकि, एचएफ के उपचार के लिए प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में नियोजित पारंपरिक उपकरणों ने सीमित सफलता दिखाई है और गंभीर दुष्प्रभावों से जुड़े हुए हैं। संशोधित आरएनए एक गैर-पर्यावरणीय जीन डिलीवरी प्रस्तुत करता है जो लगातार दिल में जीन हस्तांतरण उपकरण के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। ModRNA अनुवाद के लिए जीन के कोई परमाणु स्थानीयकरण की आवश्यकता है, और इस तरह प्रोटीन की एक कुशल और तेजी से अभिव्यक्ति प्रदान करता है । इसके अलावा, चूंकि एमआरएनए जीनोम होस्ट में एकीकृत नहीं होता है, इसलिए मोडरना द्वारा जीन वितरण म्यूटागेनेसिस के जोखिम को छोड़ देता है। नतीजतन, पारंपरिक जीन वितरण वाहनों पर अपने फायदों के कारण, modRNA दिल के लिए एकल जीन या जीन संयोजनों की डिलीवरी के लिए सबसे आकर्षक प्लेटफार्मों में से एक बन गया है । हालांकि, आज तक दिल के बाद की चोट में मोडरना की तैयारी और हस्तांतरण के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं है। इस प्रकार, यहां उद्देश्य एक जीन थेरेपी उपकरण के रूप में मोडरना के उपयोग में सुधार करने और इसे चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए उपयुक्त बनाने के लिए कृंतक दिल में मोडरना के इंट्राकार्डिएक डिलीवरी के लिए एक मानक और अनुकूलित प्रोटोकॉल स्थापित करना था।
इस प्रोटोकॉल में, मोडरना को यूरिडीन को छद्म डाइजेशन से बदलकर तैयार किया जाता है, जिसके बाद 5 ' अंत में एआरएए के साथ कैपिंग की जाती है । एमआरएनए की द्वितीयक संरचना में इन परिवर्तनों को विभिन्न अन्य न्यूक्लियोटाइडसंशोधनोंकी तुलना में उच्च प्रोटीन अनुवाद प्रदान करने के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, यह परिवर्तित एमआरएनए संरचना चूहों में आईएम इंजेक्शन के बाद इम्यूनोजेनिसिटी से बच जाती है, जो टोल-जैसे रिसेप्टर्स और नाभिक6द्वारा अपनी मान्यता को सीमित करती है। यहां, हमने दिखाया कि सुक्रोज साइट्रेट बफर के साथ नग्न एमआरएनए डिलीवरी माउस एमआई मॉडल का उपयोग करके दिल में मजबूत प्रोटीन अनुवाद पैदा करती है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने नैनोकणों में मोडर्ना के एनकैप्सुलेशन की तुलना में दिल में सुक्रोज साइट्रेट बफर के साथ वितरित मोडर्ना की श्रेष्ठता की स्थापना की, जैसे वीवो फेक्टामाइन या वीवो जेटपेई में, जो प्रोटीन8में मोडरना अनुवाद में बाधा डाल सकता है। एकल फंसे हुए मोडरना क्लंपिंग को बचाने के अलावा एंडोसाइटोसिस के लिए सुक्रोज द्वारा प्रदान की गई साइट्रेट और अतिरिक्त ऊर्जा द्वारा आरएनए का उच्च संरक्षण सुक्रोज साइट्रेट बफर में वितरित मोडरएनए के अनुवाद में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण हो सकता है।
यद्यपि पिछले दशक में प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन10,,14 में मोडरना का उपयोग बढ़ गया है, लेकिन क्लिनिक में मोडरना की बेहतर सफलता के लिए कुछ क्षेत्रों की जांच किए जाने की आवश्यकता है। सबसे पहले, चिकित्सीय जांच के लिए आवश्यक उच्च मात्रा में मॉडरना संश्लेषण लागत निषेधात्मक हो सकता है । इस प्रकार, मनुष्यों में नैदानिक आरएनए थेरेपी चरण की ओर क्षेत्र को स्थानांतरित करने के लिए नैदानिक-ग्रेड और लागत प्रभावी मोडरना विकसित करना आवश्यक है। दूसरा, मोडरना के लिए एक चिकित्सकीय रूप से लागू वितरण विधि की पहचान करने की आवश्यकता है। कार्डियक आईएम इंजेक्शन की वजह से नुकसान को ध्यान में रखते हुए, कम आक्रामक कैथेटर आधारित वितरण विधियों बड़े दिलों को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक modRNA की बड़ी राशि को स्थानांतरित करने में अधिक प्रशंसनीय हो सकता है ।
अंत में, इस काम ने माउस हार्ट पोस्ट एमआई में छद्म संशोधनों वाले आरएनए के सफल वितरण का प्रदर्शन किया। सुक्रोज साइट्रेट बफर में मोडरना की डिलीवरी से इंजेक्शन के 24 घंटे बाद मजबूत प्रोटीन एक्सप्रेशन हुआ । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को हृदय के बाद चोट में मानकीकृत वितरण और प्रोटीन मूल्यांकन का पालन करने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार अपने शोध के लिए मोडरना की तैयारी और वितरण में अधिक पहुंच प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक इस पांडुलिपि के साथ उसकी मदद के लिए ऐन अनु कुरियन को स्वीकार करते हैं । इस काम को एक कार्डियोलॉजी स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था जो ज़ंगी प्रयोगशाला को प्रदान किया गया था और एनआईएच ग्रांट आर01 एचएल142768-01 द्वारा भी
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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