Summary
该协议提供了一种简单和连贯的方法，在小鼠心肌梗死后，使用modRNA暂时调节感兴趣的基因。
Abstract
心肌梗死（MI）是西方世界发病率和死亡率的主要原因。在过去十年中，基因治疗因其效率和卓越的治疗效果而成为心脏病的一种有前途的治疗选择。为了修复MI后受损的组织，各种研究采用了基于DNA或病毒基因疗法，但由于传递基因表达不力且不受控制，因此面临相当大的障碍。水肿、心律失常和心脏肥大。合成改性mRNA（modRNA）是一种新型的基因治疗方法，为心脏组织提供高、瞬态、安全、非免疫和受控的mRNA传递，没有任何基因组整合的风险。由于这些显著的特点，结合其钟形药代动力学在心脏，modRNA已成为一个有吸引力的方法治疗心脏病。然而，为了提高其在体内的有效性，需要遵循一致和可靠的交付方法。因此，为了最大限度地提高modRNA在体内应用中的modRNA输送效率和屈服一致性，提出了小鼠MI模型中一种优化的modRNA心脏内注射制备和传递方法。该协议将使modRNA交付更容易获得基础和转化研究。
Introduction
基因治疗是一种强大的工具，涉及核酸的传递，用于治疗、治愈或预防人类疾病。尽管在心脏病的诊断和治疗方法方面取得了进展，但在心肌梗死（MI）和心力衰竭（HF）的基因传递方面，成功程度有限。与基因治疗过程一样简单，考虑到在使用特定交付工具之前需要优化的许多因素，这种方法显然很复杂。正确的传递载体应该是非免疫性、高效性和稳定的人体内部。这一领域的努力产生了两种类型的输送系统：病毒或非病毒。广泛使用的病毒系统，包括腺病毒、逆转录病毒、扁病毒或腺相关病毒的基因转移，都显示出了特殊的转导能力。然而，由于诱导的强免疫反应1、肿瘤发生的风险2或中和抗体3的存在，这些抗体在诊所的使用是有限的，所有这些都仍然是病毒载体在人类基因治疗中广泛和有效应用的主要障碍。另一方面，尽管其令人印象深刻的表达模式，裸质质质DNA的传递显示低转染效率，而mRNA转移表现出高免疫原性和易退化的RNase4。
随着mRNA领域的广泛研究，modRNA因其比传统载体5具有许多优势，已成为将基因输送到心脏和各种其他器官的诱人工具。用自然产生的伪尿丁完全取代尿氨酸，导致更健壮和瞬态的蛋白质表达，与自然免疫反应的最小诱导和基因组整合的风险6。最近建立的协议使用优化量的抗反向帽模拟（ARCA），通过提高合成mRNA7的稳定性和可转换性，进一步增强蛋白质的转化。
以前的报告已经表明，在MI之后，modRNA在啮齿动物心肌中传递的各种报告器或功能基因的表达。在ModRNA应用方面，心肌病的显著区域，包括心肌细胞和非心肌细胞，已成功转染后心肌损伤8，诱导血管生成9,9，10，心脏细胞生存11，和心肌细胞增殖12。单次为突变的人类卵泡素1编码的modRNA，可诱导小鼠成年CM的增殖，并显著增加心脏功能，减少疤痕大小，并增加MI12后4周的毛细管密度。最近的一项研究报告说，在MI之后，在猪模型10中应用VEGFA modRNA，心脏功能有所改善。
因此，随着modRNA在心脏领域的日益普及，开发和优化一种将modRNA输送到MI后心脏的协议至关重要。 Herein是一种描述生物相容性酸碱制剂中纯化和优化的modRNA制备和输送的协议，提供健壮、稳定的蛋白质表达，而不会刺激任何免疫反应。本协议和视频中所示的方法演示了小鼠MI的标准外科程序，通过左前部下部动脉（LAD）的永久连接，然后是三个部位的心肌注射modRNA。本文旨在明确定义一种高度准确和可重复的modRNA输送方法，以达到小鼠心肌，使modRNA的应用在心脏基因治疗中广泛普及。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里概述的所有动物程序都已获得西奈山机构护理和使用委员会的伊坎医学院的批准。
1. 模RNA的合成
注：modRNA合成的细节可以在Kondrat等人13中找到。
- 订购质粒模板 （材料表），并生成干净的 PCR 产品用作 mRNA 模板。
- 通过体外转录准备modRNA，并定制如下核苷混合物（材料表）：T7转录试剂盒， 6 mM 抗反向帽模拟 （ARCA） 30-O-Me-m7G （50） ppp（50）G，75 mM 三磷酸冠氨酸，75 mM 腺苷三磷酸，75 mM 西丁三磷酸，100 mM伪尿丁-5-三磷酸盐，T7 DNase酶。
- 用转录清理试剂盒（材料表）净化步骤1.2中制造的modRNA，用南极磷酸酶进行治疗。接下来，使用转录清理套件重新纯化 modRNA，并使用分光度计进行量化。
- 用乙醇和醋酸铵沉淀模核，并在10mTris-HCl和1 mM EDTA中重新悬浮。
- 通过离心滤波器集中modRNA进行体内输送，并使用自动电泳平台（材料表）测量质量。
2. 准备用于体内分娩的modRNA注射
- 根据模RNA浓度计算100μg的透明酶（Luc）/Cre modRNA注射所需的体积。
- 将计算出的modRNA体积与用无核酸水（0.3克/mL）和0.1M西酸溶液（pH = 7）（每个推荐20μL）制备的蔗糖溶液等部分混合。
- 通过添加盐水溶液，将注射的最终体积增加到 60 μL。
3. 心肌梗死手术
- 动物的麻醉和准备
注：本研究使用8-12周大的雄性和雌性CFW小鼠。- 使用感应室用2%异氟拉苯麻醉小鼠，并将动物的背部放在背部位置，在鼻子和嘴上带有面罩，以保持麻醉。使用配备 7-8 mm 气道管和过滤器的呼吸器通过机械通风来保持麻醉。
- 要在手术平台上固定鼠标，请用手术胶带固定其四肢。用70%乙醇和波维酮碘对颈部区域和肋骨左侧进行消毒。重复消毒步骤两次。检查其反射，捏住尾巴和后脚以评估麻醉的深度。
- 持续监测并维持核心体温，温度维持在标准温度（37.5~38 °C）。
- 通过执行气管内插管来保持露天通道。为此，将鼠标置于腹腔位置，嘴朝向实验者，轻轻拉出舌头。调整颈部角度，拉直插管路径，推入插管。
- 如果动物无法通过呼吸，可以进行气管切开术。沿中线进行颈椎切口，用显微镜隔离皮肤、肌肉和组织，勾勒出气管。当气管清晰可见时，通过制造一个小孔，并使用显微外科钳子握住气管的颅部部分，将内切管插入glottis下方两个弹壳环之间的组织。
- 观察小鼠的胸腔运动，以验证两个肺是否接受氧气。呼吸速率 （RR） 应约为每分钟 120 次呼吸，吸气压力为 17-18 厘米 H2O。
- 左前部下降 （LAD） 动脉连接
- 要执行 LAD 连接，请小心转动鼠标，使其位于右侧。抬起皮肤，在第三和第四肋骨之间进行左侧胸腔切除术，并仔细解剖组织和肌肉。使用烧灼土防止出血。
- 小心地打开胸腔，一旦打开，找到心脏，不要用任何尖锐的物体触摸肺。将缩回器放入切口，以保持胸腔打开，并清晰查看心脏。现在，将肺部移到切口的边缘，并取出覆盖心脏的食囊部分，以进入心脏的前表面。
- 仔细识别 LAD，这可被视为位于肺动脉和左动脉之间的深浅红色血管。用一个单一缝合线7-0丝缝合线对LAD近端进行立门。将胸管（28 G，静脉导管）放在第4根和第5根肋骨之间。
- 将胸腔切口合上。使用 6-0 丝质跑步缝合线来调整肋骨，并使用 5-0 丝质跑步缝合线闭合皮肤。确保为将来的回声心动测量留出一个合适的窗口。
- 使用 2 mL 注射器小心地使用热等同溶液（1 L 水中 9 克氯化钠）排出胸部。将鼠标放在其背面。如果进行气管切开术，则将内切管拿出来，并使用 7-0 丝缝合线，只需一针即可调整气管盒环。将面罩放在鼠标上，并使用 5-0 丝质跑步缝合线关闭皮肤。
- 在恢复阶段，断开管状管与呼吸机的连接，并允许自发呼吸。将动物放在热灯下，直到它获得知觉。手术后不要让动物无人看管，直到它完全清醒。
- 以0.1mg/kg体重管理使用布丙诺啡的疼痛治疗，以12小时间隔为下3天注射。
4. modRNA 心脏分娩
- 在MI之后使用胰岛素注射器（31 G）在步骤2.3中制备的modRNA共60μL。
- 在梗塞区域周围的心肌的三个不同部位（两个在结扎两侧，一个在顶点）注射20μL的modRNA。在 LAD 之后立即进行注射，然后关闭胸部。
注：在图1中可以看到modRNA注射位点的代表性图像。
- 在梗塞区域周围的心肌的三个不同部位（两个在结扎两侧，一个在顶点）注射20μL的modRNA。在 LAD 之后立即进行注射，然后关闭胸部。
5. MI后心脏蛋白表达验证
- 使用生物发光成像系统进行路西法默默
注：在MI之后，在蔗糖酸缓冲液60μL中制备的共100μg的Luc mRNA直接注入CFW小鼠的心脏。- 在MI和modRNA注射后的24小时，使用诱导室和腹内注射露素（150mg/g体重）对小鼠进行2%的等氟酶麻醉，以验证体内的Luc信号。
- 每2分钟使用生物发光成像系统对小鼠进行成像，直到 Luc 信号达到饱和。
- 使用成像分析软件量化收集的成像数据。仅使用注射盐水的小鼠作为 Luc 表达的基线读数，并减去从盐水注入小鼠中收集的背景信号。
注： Luc 信号以 p/s/cm2/sr x 106表示。
- 用于克里转染验证的免疫染色
- 为了验证与Cre的转染，牺牲动物24小时注射后使用腹内注射100毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克xylazine，然后宫颈脱位。在进行切口之前，使用 70% 的酒精拭子对胸部和腹部进行消毒。
- 打开胸腔，使一个横向切口比胸骨低1厘米，将剪刀朝头部移动，穿过肋骨笼。
- 打开胸部，在右心室中注射1 mL无菌PBS，以去除多余的血液。立即切除心脏，并将其放入无菌PBS中，以洗去剩余的血液。
- 将心脏固定在4%甲醛（PFA）中24小时，随后在4°C下在30%蔗糖溶液中过夜孵育。第二天，将心脏嵌入最佳切割温度介质中，并用低温塔将其以 10 μm 的厚度进行剖面。
- 用原发抗体对心脏肌钙蛋白I（cTNI）染色部分，用荧光二次抗体标记它们。为了识别细胞核，用4'，6-二胺酰胺-2-苯胺酚（DAPI）染色5分钟。使用荧光显微镜对幻灯片进行成像。
6. 统计分析
- 根据盐水和 Luc 注入小鼠中的 Luc 表达式绘制条形图，并将值报告为平均值 = SEM。 使用未配对的 t 检验（\p < 0.0001）比较两个组。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
八到十周大的老鼠被麻醉了二分线素和插管。动物麻醉后，左胸区被用乙醇进行扫描和消毒，心脏被暴露为LAD结扎。左冠状动脉被动脉下缝合牢固地缝合（图表示图1A）。成功进入后（由左心室自由壁的支爱表示），直接注射100μg的Luc或Cre modRNA溶解在蔗糖酸液中，使用胰岛素注射器直接输送到三个不同部位的心肌（图1B）。使用modRNA注射的MI程序每只动物持续30~45分钟。动物在手术后表现出大约90%的存活率。手术后，胸部和皮肤被牢牢地缝合成层，动物一开始正常呼吸就从通风中取出。
在进行LAD连接和随后的Luc modRNA注射后，我们验证了Luc modRNA转染，使用生物发光成像系统检查Luc蛋白表达24 h后注射（图2A）。我们在以前的出版物中证实，虽然蛋白质表达在转染后的第6天之前都能看到，但modRNA的最高转染效率在24小时8分被观察到。同样，我们与MI（3.0 x 105）（图2B）后注射蔗糖酸缓冲液的小鼠相比，成功地检测到了使用Luc modRNA注射治疗的心脏中的Luc信号（1.76 x 108）。
此外，我们试图通过检查其转基因罗莎26mTmG小鼠的转化和生物分布来验证modRNA表达。此小鼠模型系统表示所有身体细胞/组织中的细胞膜局部tdMmm（mT）荧光表达，并在Cre重组时改变细胞膜局部EGFP（mG）荧光表达。因此，为了观察Cre modRNA的表达，在Rosa26mTmG雄性小鼠和雌性小鼠中，100μg Cre modRNA直接注射到MI后心肌，动物在手术后24小时被牺牲。心脏被固定和处理，用心肌细胞标记cTNI和核标记DAPI进行免疫染色（图3A）。成功的克雷表达是显而易见的，因为绿色细胞的出现（图3B），这是与提供给小鼠的Cre modRNA重组的结果，表现为tdTomatom颜色在克里注射部位周围向EGFP的变化（图3C）。
图1：LAD结扎和多德RNA心脏传递。（A） 显示 LAD 连接区域和三个 modRNA 注射部位的原理图。（B） 代表显示整个小鼠心脏的图像后，一个成功的MI诱导永久结扎 （a） 和 MODRNA 注射位点后 MI.溶解在60μL蔗糖镇酸盐缓冲液中的100 μg在梗塞周围的边境地区，两个在结扎（b，c）的两侧，一个在顶点（d）中。c比例尺 = 1 厘米。请点击这里查看此图形的较大版本。
图2：Luc表达分析后modRNA注射。在开胸手术中，含有100μgLuc modRNA的蔗糖酸缓冲液直接注射到CFW小鼠的心肌中。生物发光成像系统用于在注射后24小时计算Luc蛋白表达。（A） 对照小鼠（仅转用缓冲剂）与注射Luc modRNA的小鼠的比较生物发光图像。（B） 与使用生物发光成像仪在24小时后测量的控制小鼠相比，Luc信号的定量化。误差条表示 SEM，带 p < 0.0001。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：在体内验证 Cre 表达式。转染心脏横截面（短轴视图）的代表性图像，验证了在注射后 24 小时在 Rosa26mTmG小鼠中表达的 Cre modRNA。（A） 心肌细胞免疫染色的cTNI（红色）。（B） 绿色细胞代表克里转染细胞.（C） 合并的图像显示两次注射周围的克里激活细胞。蓝色是核污渍DAPI。比例尺 = 1 厘米。请点击这里查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
基因治疗在显著推进心脏病治疗方面显示出巨大的潜力。然而，在治疗HF的最初临床试验中使用的传统工具已证明成功有限，并与严重的副作用有关。修饰RNA呈现非病毒基因传递，作为心脏的基因转移工具越来越受欢迎。ModRNA不需要基因的核定位进行翻译，因此提供有效和快速的蛋白质表达。此外，由于mRNA不集成到基因组宿主中，modRNA的基因传递跳过了诱变的风险。因此，由于其比传统的基因传递工具的优势，modRNA已成为向心脏输送单一基因或基因组合最有吸引力的平台之一。然而，到目前为止，还没有标准化的规程，准备和转移到心脏后损伤。因此，这里的目标是建立一个标准和优化的协议，在啮齿动物心脏的modRNA的心脏内传递，以改善使用modRNA作为基因治疗工具，并使之适合治疗目的。
在此协议中，modRNA 的制备是将尿碱替换为伪尿碱，随后在 5' 末端用 ARCA 封顶。与其它核苷酸修饰8相比，mRNA二次结构的这些变化已经证明具有更高的蛋白质转化率。此外，这种改变的mRNA结构通过限制其识别收费样的受体和核酸酶6，在小鼠的IM注射后，它逃脱了免疫原性。在这里，我们显示，裸mRNA交付与蔗糖酸液缓冲液产生强大的蛋白质翻译在心脏使用小鼠MI模型。在以前的研究中，我们建立了在心脏中用蔗糖镇酸盐缓冲液提供的modRNA的优越性，与纳米颗粒中模RNA的封装相比，如体内粪便或体内jetPEI，这可能阻碍模RNA转化为蛋白质8。通过西酸和蔗糖为内分泌提供的额外能量，以及拯救单链模RNA结块，高保存RNA可能是在蔗糖酸缓冲液中传递的modRNA翻译显著增加的原因。
虽然莫德RNA的使用在过去十年中在临床前和临床研究中已经升级了10，14,14个，但某些领域需要研究，以提高modRNA在临床上的成功。首先，在治疗性调查所需的高量中合成modRNA可能成本高昂。因此，开发临床级和具有成本效益的modRNA对于将该领域推向人类临床RNA治疗阶段至关重要。其次，需要确定模RNA的临床适用输送方法。考虑到心脏IM注射造成的损伤，在转移转染大心脏所需的大量modRNA时，侵入性较低的导管输送方法可能更合理。
最后，这一工作证明在小鼠心脏后MI中成功传递了含有伪尿碱修饰的RNA。在蔗糖酸化剂缓冲液中输送modRNA在注射后24小时产生强蛋白表达。该协议使研究人员能够遵循心脏损伤后标准化的分娩和蛋白质评估，从而为他们的研究提供更多的modRNA制备和交付的可及性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢安·阿努·库里安帮助这份手稿。这项工作由授予赞吉实验室的心脏病学启动赠款以及NIH授予R01 HL142768-01资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
