Summary
Dit protocol presenteert een eenvoudige en coherente manier om een gen van belang te upreguleren met behulp van modRNA na een hartinfarct bij muizen.
Abstract
Myocardiaal infarct (MI) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld. In het afgelopen decennium is gentherapie een veelbelovende behandelingsoptie geworden voor hart- en vaatziekten, vanwege de efficiëntie en uitzonderlijke therapeutische effecten. In een poging om het beschadigde weefsel post-MI te herstellen, hebben verschillende studies gebruik genomen van DNA-gebaseerde of virale gentherapie, maar hebben aanzienlijke hindernissen ondervonden als gevolg van de slechte en ongecontroleerde expressie van de geleverde genen, oedeem, aritmie en cardiale hypertrofie. Synthetische gemodificeerde mRNA (modRNA) presenteert een nieuwe gentherapie benadering die hoge, voorbijgaande, veilige, niet-immunogenic, en gecontroleerde mRNA levering aan het hartweefsel biedt zonder enig risico van genomische integratie. Door deze opmerkelijke kenmerken in combinatie met de klokvormige farmacokinetiek in het hart is modRNA een aantrekkelijke aanpak geworden voor de behandeling van hartziekten. Om de effectiviteit ervan in vivo te vergroten, moet echter een consistente en betrouwbare leveringsmethode worden gevolgd. Om de modRNA-leveringsefficiëntie en de consistentie van modRNA voor in vivo-toepassingen te maximaliseren, wordt daarom een geoptimaliseerde methode voor voorbereiding en levering van modRNA intracardiac-injectie in een muis-MI-model gepresenteerd. Dit protocol zal modRNA levering toegankelijker maken voor fundamenteel en translationeel onderzoek.
Introduction
Gentherapie is een krachtig instrument waarbij de levering van nucleïnezuren voor de behandeling, genezing, of preventie van menselijke ziekten. Ondanks de vooruitgang in de diagnostische en therapeutische benaderingen voor hart-en vaatziekten, is er beperkt succes in de levering van genen in hartinfarct (MI) en hartfalen (HF). Zo eenvoudig als het proces van gentherapie lijkt, het is een duidelijk complexe aanpak gezien de vele factoren die moeten worden geoptimaliseerd voordat u een bepaald leveringsvoertuig in dienst neemt. De juiste toedoogd moet niet-immunogeen, efficiënt en stabiel zijn in het menselijk lichaam. Inspanningen op dit gebied hebben geleid tot twee soorten leveringssystemen: virale of niet-virale. De veelgebruikte virale systemen, met inbegrip van genoverdracht door adenovirus, retrovirus, lentivirus, of adeno-geassocieerd virus, hebben aangetoond uitzonderlijke transduction capaciteit. Het gebruik ervan in klinieken is echter beperkt als gevolg van de sterke immuunrespons geïnduceerde1, risico op tumorigenese2, of de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen3, die allemaal een groot obstakel blijven voor een brede en effectieve toepassing van virale vectoren in menselijke gentherapie. Aan de andere kant, ondanks hun indrukwekkende expressie patroon, de levering van naakte plasmiDE DNA toont een lage transfectie efficiëntie, terwijl mRNA overdracht presenteert een hoge immunogeniciteit en gevoeligheid voor afbraak door RNase4.
Met het uitgebreide onderzoek op het gebied van mRNA is modRNA een aantrekkelijk instrument geworden voor de levering van genen aan het hart en diverse andere organen vanwege de vele voordelen ten opzichte van traditionele vectoren5. Volledige vervanging van uridine door natuurlijk voorkomende pseudouridine resulteert in een robuustere en voorbijgaande eiwitexpressie, met minimale inductie van aangeboren immuunrespons en risico op genomische integratie6. Recent vastgestelde protocollen maken gebruik van een geoptimaliseerde hoeveelheid anti-reverse cap analog (ARCA) die de eiwitvertaling verder verbetert door de stabiliteit en transabiliteit van het synthetische mRNA7te verhogen.
Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de uitdrukking van verschillende verslaggever of functionele genen geleverd door modRNA in het knaagdier myocardium na MI. Met modRNA-toepassingen zijn belangrijke gebieden van het myocardium, waaronder zowel cardiomyocyten als noncardiomyocyten, met succes doorgetransfecteerd na hartletsel8 om angiogenese9,10,hartceloverleving11en cardiomyocyte proliferatie12te induceren . Een enkele toediening van modRNA gecodeerd voor gemuteerde menselijke follistatine-achtige 1 induceert de proliferatie van muis volwassen CMs en aanzienlijk verhoogt de cardiale functie, vermindert litteken grootte, en verhoogt capillaire dichtheid 4 weken na MI12. Een meer recente studie gemeld verbeterde cardiale functie na MI met toepassing van VEGFA modRNA in een varkens model10.
Dus, met de toegenomen populariteit van modRNA in het hartveld, is het essentieel om een protocol te ontwikkelen en te optimaliseren voor de levering van modRNA aan het hart post-MI. Herein is een protocol dat de voorbereiding en levering van gezuiverde en geoptimaliseerde modRNA beschrijft in een biocompatibele citraat-zoutoplossing die robuuste, stabiele eiwitexpressie biedt zonder enige immuunrespons te stimuleren. De methode in dit protocol en video toont de standaard chirurgische ingreep van een muis MI door permanente ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD), gevolgd door drie site intracardiac injecties van modRNA. Het doel van dit document is om een zeer nauwkeurige en reproduceerbare methode van modRNA levering aan murine myocardium duidelijk te definiëren om modRNA toepassing wijd toegankelijk voor hartgentherapie te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door Icahn School of Medicine op mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Synthese van modRNA
OPMERKING: De details van modRNA synthese zijn te vinden in Kondrat et al.13.
- Bestel de plasmide sjablonen(Tabel van materialen) en het genereren van een schoon PCR-product te gebruiken als de mRNA-sjabloon.
- Bereid de modRNAs door transcriptie in vitro met een aangepaste ribonucleoside mix van de volgende (Tabel van materialen): T7 transcriptie kit, 6 mM anti-reverse cap analoog (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine sfosfaat, 75 mM adenosine sfosfaat, 75 mM cytidinesfosfaat, 100 mM pseudouridine-5-triphosfat en T7 DNase enzym.
- Zuiver de modRNA gemaakt in stap 1.2 met een transcriptie cleanup kit(Tabel van materialen)en behandelen met antarctische fosforfosfatase. Vervolgens herzuiveren de modRNA met de transcriptie opruimkit en kwantificeren met behulp van een spectrofotometer.
- Precipitate de modRNA met ethanol en ammoniumacetaat en resuspend in 10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA.
- Concentreer het modRNA voor in vivo levering door centrifugale filters en meet de kwaliteit met behulp van een geautomatiseerd elektroforeseplatform(Table of Materials).
2. Voorbereiding van modRNA-injectie voor in vivo levering
- Bereken het volume dat nodig is voor 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA injectie op basis van de modRNA-concentratie.
- Meng het berekende volume modRNA met gelijke delen van sacharoseoplossing bereid in nucleasevrij water (0,3 g/mL) en 0,1 M citraatoplossing (pH = 7) (20 μL elk aanbevolen).
- Breng het uiteindelijke volume van de injectie op 60 μL door zoutoplossing toe te voegen.
3. Hartinfarct chirurgie
- Anesthesie en bereiding van het dier
OPMERKING: Deze studie maakt gebruik van mannelijke en vrouwelijke CFW muizen 8−12 weken oud.- Verdoven de muis met 2% isoflurane met behulp van een inductiekamer en plaats het dier op zijn rug in een dorsale positie met een gezichtsmasker over zijn neus en mond om de anesthesie bij te houden. Houd de anesthesie door mechanische ventilatie met behulp van een gasmasker uitgerust met een 7−8 mm luchtwegbuis en een filter.
- Om de muis te immobiliseren op het operatieplatform, beveilig je de ledematen met chirurgische tape. scheer het nekgebied en de linkerkant van de ribbenkast en ontsmet 70% ethanol en povidone jodium. Herhaal de desinfecterende stap twee keer. Controleer de reflexen, knijpen de staart en achterpoten om de diepte van anesthesie te beoordelen.
- Continu de lichaamstemperatuur van de kern bij normothermie (37,5−38 °C) monitoren en handhaven.
- Behoud een open luchtweg door intratracheale intubatie uit te voeren. Om dit te doen, plaats de muis in een ventrale positie met zijn mond naar de experimentator gericht en trek voorzichtig de tong. Pas de hoek van de nek aan en strek het intubatiepad recht en duw in de intubatie canule.
- In het geval dat het dier er niet doorheen kan ademen, kan tracheostomie worden uitgevoerd. Voer een cervicale incisie langs de middellijn isoleren van de huid, spieren, en weefsel waarin de luchtpijp met behulp van een microscoop. Wanneer de luchtpijp duidelijk zichtbaar is, steek de endotracheale buis in het weefsel tussen twee patroonringen onder de glottis door een klein gaatje te maken en het schedelgedeelte van de luchtpijp vast te houden met behulp van microchirurgische tangen.
- Let op de thoracale beweging van de muis om te controleren of beide longen zuurstof ontvangen. De ademhalingsfrequentie (RR) moet ongeveer 120 ademhalingen per minuut zijn, met een inspiratoire druk van 17−18 cm H2O.
- Linker voorste dalende (LAD) slagader ligation
- Om de LAD ligatie uit te voeren, draait u de muis voorzichtig zodat hij aan de rechterkant ligt. Til de huid op en voer een linkszijdige thoracotomie uit tussen de 3e en de 4e rib en ontleed het weefsel en de spieren zorgvuldig. Gebruik een cautery om bloedingen te voorkomen.
- Open de thorax voorzichtig en zodra het open is, vind het hart, zonder de long aan te raken met een scherp voorwerp. Plaats de oprolmechanismen in de incisie om de borstholte open te houden en een duidelijk zicht op het hart te hebben. Verplaats nu de longen naar de rand van de incisie en verwijder het deel van de hartzak die het hart bedekt om toegang te krijgen tot het voorste oppervlak van het hart.
- Identificeer de LAD zorgvuldig, dat kan worden gezien als een diep lichtrood vat tussen de longslagader en de linker oorschelp. Ligate de LAD proximale met een enkele hechting van een 7-0 zijden hechting. Plaats een borstbuis (28 G, venal katheter), tussen de 4e en de 5e rib.
- Sluit de thoracale incisie in lagen. Gebruik de 6-0 zijde lopende hechtingen om de ribben aan te passen en gebruik 5-0 zijde lopende hechtingen om de huid te sluiten. Zorg ervoor dat u een goed venster voor toekomstige echocardiografische meting te verlaten.
- Giet de thorax voorzichtig af met warme isotone oplossing (9 g natriumchloride in 1 L water) met behulp van een spuit van 2 mL. Plaats de muis op zijn rug. Als het uitvoeren van tracheostomie, neem de endotracheale buis uit en met behulp van 7-0 zijden hechtingen passen de tracheale cartridge ringen met een enkele steek. Plaats het gezichtsmasker op de muis en sluit de huid met behulp van 5-0 zijde lopende hechtingen.
- Los voor de herstelfase de intubatie canule van de ventilator los en laat spontane ademhaling toe. Plaats het dier onder een hittelamp tot het bewustzijn bereikt. Laat het dier na de operatie niet onbeheerd achter totdat het volledig wakker is.
- Beheer pijntherapie met buprenophine op 0,1 mg/kg lichaamsgewicht, onderhuids geïnjecteerd voor de komende 3 dagen bij 12 uur intervallen.
4. Cardiale levering van modRNA
- Lever in totaal 60 μL van het modRNA dat in stap 2.3 intramusculair (IM) wordt bereid met behulp van een insulinespuit (31 G) na een MI.
- Injecteer 20 μL van het modRNA op drie verschillende plaatsen van de hartspier rond het infarctgebied (twee aan weerszijden van ligatie en één in de top). Voer de injecties onmiddellijk na de LAD uit, voordat u de borst sluit.
OPMERKING: Representatieve afbeeldingen van modRNA-injectieplaatsen zijn te zien in figuur 1.
- Injecteer 20 μL van het modRNA op drie verschillende plaatsen van de hartspier rond het infarctgebied (twee aan weerszijden van ligatie en één in de top). Voer de injecties onmiddellijk na de LAD uit, voordat u de borst sluit.
5. Eiwit expressie validatie in hart post MI
- Luciferase modRNA expressie met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem
OPMERKING: Een totaal van 100 μg Luc mRNA bereid in 60 μL van de sacharose citraat buffer wordt direct geïnjecteerd in het hart van CFW muizen na de MI.- Bij 24 uur na MI en modRNA injectie verdoven de muizen met 2% isoflurane met behulp van een inductiekamer en intraperitoneally luciferin (150 mg/g lichaamsgewicht) injecteren om het Luc-signaal in vivo te valideren.
- Beeld de muizen met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem om de 2 minuten tot het Luc signaal verzadiging bereikt.
- Kwantificeer de verzamelde beeldgegevens met imaging analysesoftware. Gebruik de muizen geïnjecteerd met zoutoplossing alleen als een basislijn lezing voor Luc expressie en trek het achtergrondsignaal verzameld van de zout-geïnjecteerde muizen.
LET OP: Luc signaal wordt uitgedrukt in p/s/cm2/sr x 106.
- Immunostaining voor Cre transfection validatie
- Om de transfectie met Cre te valideren, offert u de dieren 24 uur na injectie op met behulp van een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie. Voordat u een incisie maakt, desinfecteert u de borst en buik met een 70% alcoholuitstrijkje.
- Open de borstholte door een dwarse incisie ~1 cm lager dan het borstbeen te maken en beweeg de schaar naar het hoofd, snijdend door de ribbenkast.
- Open de borst en injecteer 1 mL steriele PBS in de rechter ventriculaire kamer om overtollig bloed te verwijderen. Dlijt het hart onmiddellijk uit en leg het in de steriele PBS om het resterende bloed weg te wassen.
- Bevestig het hart in 4% paraformaldehyde (PFA) voor 24 uur, gevolgd door nachtelijke incubatie in 30% sacharoseoplossing bij 4 °C. De volgende dag verankeren de harten in optimale snijtemperatuur medium en sectie ze op een dikte van 10 μm met behulp van een cryostat.
- Bevlek de secties met primair antilichaam tegen harttroponine I (cTNI) en label ze met een fluorescerend secundair antilichaam. Om de kern te identificeren, vlek met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) voor 5 min. Beeld de dia's met behulp van een fluorescerende microscoop.
6. Statistische analyse
- Zet een staafgrafiek uit op basis van de Luc-expressie in zoute en luc-geïnjecteerde muizen en rapporteer de waarden als gemiddelde ± SEM. Vergelijk de twee groepen met behulp van een ongepaarde t-test (****p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acht tot tien weken oude muizen werden verdoofd met isoflurane en geïntubeerd. Nadat het dier onder narcose was, werd het linker thoracale gebied geschoren en gesteriliseerd met ethanol, en het hart werd blootgesteld voor LAD ligatie. De linker kransslagader werd afgesloten door stevig knopen van de hechting onder de slagader (diagram vertegenwoordiging Figuur 1A). Na een succesvol infarct (aangegeven door de paling van de linker ventriculaire vrije muur), werd een directe injectie van 100 μg van Luc of Cre modRNA opgelost in sucrose citrate buffer direct geleverd in het myocardium op drie verschillende locaties (Figuur 1B) rond het letselgebied met behulp van een insulinespuit. De MI-procedure met modRNA-injecties duurde 30−45 min per dier. De dieren vertoonden ongeveer 90% overlevingskans na de procedure. Na de procedure werden de borst en de huid stevig gehecht in lagen en werd het dier uit de ventilatie verwijderd zodra het normaal begon te ademen.
Na het uitvoeren van de LAD ligatie en de daaropvolgende levering van Luc modRNA injectie, valideerden we de Luc modRNA transfectie door te controleren op Luc eiwitexpressie 24 uur postinjectie met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem (Figuur 2A). We hebben in eerdere publicaties vastgesteld dat hoewel de eiwitexpressie tot dag 6 na de transmissie te zien is, de hoogste transfectie-efficiëntie van modRNA wordt waargenomen bij 24 uur8. Op dezelfde manier hebben we met succes het Luc-signaal in het hart ontdekt dat werd behandeld met Luc modRNA-injectie (1,76 x 108) in vergelijking met de muizen die na MI met sacharose citratebuffer werden geïnjecteerd (3,0 x 105) (figuur 2B).
Verder hebben we geprobeerd om de modRNA-expressie te valideren door de vertaling en biodistributie in een transgene Rosa26mTmG-muis te controleren. Dit muismodelsysteem drukt de celmembraan-gelokaliseerde tdTomato (mT) fluorescentieuitdrukking uit in alle lichaamscellen/weefsels en veranderingen in celmembraan-gelokaliseerde EGFP (mG) fluorescentieuitdrukking bij Cre recombinatie. Om de expressie van het Cre modRNA waar te nemen, werd 100 μg Cre modRNA direct geïnjecteerd in het myocardium post-MI in Rosa26mTmG mannelijke en vrouwelijke muizen, en werden de dieren 24 uur postchirurgie geofferd. Harten werden vastgesteld en verwerkt voor immunostaining met cardiomyocyte marker cTNI en nucleaire marker DAPI (Figuur 3A). Succesvolle Cre expressie was duidelijk te wijten aan het uiterlijk van groen gekleurde cellen (Figuur 3B), die het resultaat waren van recombinatie met de Cre modRNA geleverd aan de muis, vertegenwoordigd door de verandering van de tdTomato kleur naar EGFP rond de Cre injectie site (Figuur 3C).
Figuur 1: LAD ligatie en cardiale levering van modRNA. (A) Schematisch diagram met het gebied van LAD ligatie en drie plaatsen van modRNA-injectie. (B) Representatieve beelden van het hele muizenhart na een succesvolle MI veroorzaakt door permanente ligatie(a) en plaatsen van modRNA-injectie na de MI. De 100 μg modRNA opgelost in 60 μL van sacharose citraat buffer werd geleverd in het grensgebied gebied rond het infarct, twee aan weerszijden van de ligatie (b,c) en een in de top (d). Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Luc expression analysis post modRNA injection. Sucrose citraatbuffer met 100 μg Luc modRNA werd direct geïnjecteerd in myocardium van CFW muizen in een open borstoperatie. Het bioluminescentiebeeldvormingssysteem werd gebruikt om luc-eiwitexpressie te berekenen op 24 uur na injectie. (A) Vergelijkende bioluminescente beelden van controlemuizen (alleen doorfectt met buffer) vs. muizen geïnjecteerd met Luc modRNA. (B) Kwantificering van Luc signaal vergeleken met de controle muizen gemeten na 24 uur met behulp van bioluminescentie imager. Foutbalk vertegenwoordigt SEM met p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Validatie van de Cre-expressie in vivo. Representatieve afbeeldingen van doorsneden hartdoorsnedes (korte-asweergave) die de expressie van Cre modRNA valideren in Rosa26mTmG-muis 24 uur na injectie. (A) De cardiomyocyten immunostained met cTNI (rood). (B) Groengekleurde cellen vertegenwoordigen de Cre transfected cellen. (C) Samengevoegde afbeelding met Cre geactiveerde cellen rond de twee injecties. Blauw is de nucleaire vlek DAPI. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gentherapie heeft aangetoond enorm potentieel om aanzienlijk te bevorderen van de behandeling van hart-en vaatziekten. Echter, traditionele instrumenten die worden gebruikt in de eerste klinische studies voor de behandeling van HF hebben aangetoond beperkt succes en worden geassocieerd met ernstige bijwerkingen. Gemodificeerd RNA presenteert een niet-virale genlevering die voortdurend aan populariteit wint als een genoverdrachtsinstrument in het hart. ModRNA vereist geen nucleaire lokalisatie van genen voor vertaling, en biedt dus een efficiënte en snelle expressie van het eiwit. Verder, als het mRNA niet integreren in het genoom host, genlevering door modRNA slaat het risico van mutagenese. Als gevolg van de voordelen ten opzichte van conventionele genleveringsvoertuigen is modRNA een van de meest aantrekkelijke platforms geworden voor de levering van enkel gen- of gencombinaties naar het hart. Tot op heden is er echter geen gestandaardiseerd protocol voor de voorbereiding en overdracht van het modRNA in de hartpostinjury. Het doel hier was dus om een standaard en geoptimaliseerd protocol vast te stellen voor intracardiac levering van modRNA in knaagdierhart om het gebruik van modRNA als gentherapie-instrument te verbeteren en geschikt te maken voor therapeutische doeleinden.
In dit protocol wordt modRNA bereid door uridine te vervangen door pseudouridine, gevolgd door aftopping met ARCA aan het einde van 5.000 uur. Deze veranderingen in de secundaire structuur van mRNA hebben aangetoond dat een hogere eiwitvertaling in vergelijking met diverse andere nucleotidewijzigingen8. Bovendien ontsnapt deze veranderde mRNA-structuur aan de immunogeniciteit na IM-injecties bij muizen door de herkenning ervan door tolachtige receptoren en nucleases te beperken6. Hier hebben we aangetoond dat naakte mRNA levering met sacharose citraat buffer produceert sterke eiwit vertaling in het hart met behulp van een muis MI model. In onze vorige studies, vestigden we de superioriteit van modRNA geleverd met sacharose citraat buffer in het hart in vergelijking met inkapseling van modRNA in nanodeeltjes, zoals in vivo fectamine of in vivo jetPEI, die modRNA vertaling in eiwit8kan belemmeren . Het hoge behoud van het RNA door citraat en extra energie die door de sacharose voor endocytose wordt geleverd naast het redden van de enkelstrengse modRNA-klontering zou de reden kunnen zijn voor de duidelijke toename van de vertaling van modRNA die in de citratebuffer van sacharose wordt geleverd.
Hoewel het gebruik van modRNA is geëscaleerd in preklinische en klinische studies10,14 in het afgelopen decennium, moeten bepaalde gebieden worden onderzocht voor een beter succes van modRNA in de kliniek. Ten eerste kan het synthetiseren van modRNA in de grote hoeveelheden die nodig zijn voor therapeutische onderzoeken kosten-onbetaalbaar zijn. Zo is het essentieel om klinische en kosteneffectieve modRNA te ontwikkelen om het veld te verplaatsen naar een klinische RNA-therapiefase bij de mens. Ten tweede moet een klinisch toepasbare leveringsmethode voor modRNA worden geïdentificeerd. Gezien de schade veroorzaakt door de cardiale IM-injecties, minder invasieve katheter-gebaseerde leveringsmethoden misschien meer plausibel bij de overdracht van de grote hoeveelheid modRNA die nodig is om grote harten transfect.
Tot slot, dit werk toonde de succesvolle levering van RNA met pseudouridine wijzigingen in de muis hart post MI. De levering van modRNA in sucrose citraat buffer leverde een sterke eiwitexpressie 24 uur na de injectie. Dit protocol stelt de onderzoekers in staat om een gestandaardiseerde levering en eiwit evaluatie te volgen in het hart na letsel en dus zorgen voor meer toegankelijkheid in de voorbereiding en levering van modRNA voor hun onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Ann Anu Kurian voor haar hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een cardiologie start-up subsidie toegekend aan het Zangi laboratorium en ook door NIH subsidie R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
