Summary
Ce protocole présente une façon simple et cohérente de mettre en place transitoirement un gène d’intérêt à l’aide de modRNA après l’infarctus du myocarde chez la souris.
Abstract
L’infarctus du myocarde (MI) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde occidental. Au cours de la dernière décennie, la thérapie génique est devenue une option de traitement prometteuse pour les maladies cardiaques, en raison de son efficacité et des effets thérapeutiques exceptionnels. Dans un effort pour réparer les tissus endommagés post-MI, diverses études ont employé la thérapie génique basée sur l’ADN ou virale, mais ont fait face à des obstacles considérables en raison de l’expression pauvre et incontrôlée des gènes livrés, œdème, arythmie, et l’hypertrophie cardiaque. L’ARNm synthétique modifié (modRNA) présente une nouvelle approche de thérapie génique qui offre une livraison élevée, transitoire, sûre, non immunisée et contrôlée d’ARNm au tissu cardiaque sans aucun risque d’intégration génomique. En raison de ces caractéristiques remarquables combinées avec sa pharmacocinétique en forme de cloche dans le cœur, modRNA est devenu une approche attrayante pour le traitement des maladies cardiaques. Toutefois, pour accroître son efficacité in vivo, une méthode de livraison cohérente et fiable doit être suivie. Par conséquent, pour maximiser l’efficacité de livraison modRNA et la cohérence de rendement dans l’utilisation modRNA pour les applications in vivo, une méthode optimisée de préparation et de livraison de l’injection intracardiaque modRNA dans un modèle mi souris est présenté. Ce protocole rendra la livraison de modRNA plus accessible pour la recherche fondamentale et translationnelle.
Introduction
La thérapie génique est un outil puissant impliquant la livraison d’acides nucléiques pour le traitement, la guérison ou la prévention des maladies humaines. Malgré les progrès dans les approches diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies cardiaques, il y a eu un succès limité dans la livraison des gènes dans l’infarctus du myocarde (MI) et l’insuffisance cardiaque (HF). Aussi simple que le processus de thérapie génique semble, il s’agit d’une approche nettement complexe compte tenu des nombreux facteurs qui doivent être optimisés avant d’utiliser un véhicule de livraison particulier. Le vecteur de livraison correct doit être non immunogène, efficace et stable à l’intérieur du corps humain. Les efforts déployés dans ce domaine ont généré deux types de systèmes de prestation : le virus ou le non-viral. Les systèmes viraux largement utilisés, y compris le transfert de gènes par adénovirus, rétrovirus, lentivirus ou le virus adéno-associé, ont montré une capacité de transduction exceptionnelle. Cependant, leur utilisation dans les cliniques est limitée en raison de la réponse immunitaire forte induite1, le risque de tumorigenesis2, ou la présence d’anticorps neutralisants3, qui restent tous un obstacle majeur à l’application large et efficace des vecteurs viraux dans la thérapie génique humaine. D’autre part, en dépit de leur modèle d’expression impressionnant, la livraison de l’ADN plasmide nu affiche une faible efficacité de transfection, tandis que le transfert d’ARNm présente une immungénicité élevée et la susceptibilité à la dégradation par RNase4.
Avec la recherche approfondie dans le domaine de l’ARNm, modRNA est devenu un outil attrayant pour la livraison de gènes au cœur et divers autres organes en raison de ses nombreux avantages par rapport aux vecteurs traditionnels5. Le remplacement complet de l’uridine par la pseudouridine naturelle entraîne une expression protéique plus robuste et transitoire, avec une induction minimale de la réponse immunitaire innée et un risque d’intégration génomique6. Les protocoles récemment établis utilisent une quantité optimisée d’analogique anti-plafond inversé (ARCA) qui améliore encore la traduction des protéines en augmentant la stabilité et la transabilité del’ARNm synthétique 7.
Des rapports précédents ont montré l’expression de divers gènes reporter ou fonctionnels livrés par modRNA dans le myocarde de rongeur après MI. Avec les applications modRNA, des secteurs significatifs du myocarde, y compris les cardiomyocytes et les noncardiomyocytes, ont été transfectés avec succès des dommages post-cardiaques8 pour induire l’angiogenèse9,10, survie de cellules cardiaques11, et la prolifération cardiomyocyte12. Une seule administration de modRNA codée pour la follistatine humaine mutée-like 1 induit la prolifération des CM adultes de souris et augmente de manière significative la fonction cardiaque, diminue la taille de cicatrice, et augmente la densité capillaire 4 semaines après-MI12. Une étude plus récente a rapporté la fonction cardiaque améliorée après MI avec l’application de VEGFA modRNA dans un modèle de porc10.
Ainsi, avec la popularité accrue de modRNA dans le domaine cardiaque, il est essentiel de développer et d’optimiser un protocole pour la livraison de modRNA au cœur post-MI. Voici un protocole décrivant la préparation et la livraison de modRNA purifié et optimisé dans une formulation citrate-solution biocompatible qui fournit robuste, expression stable de protéine sans stimuler aucune réponse immunitaire. La méthode montrée dans ce protocole et vidéo démontre la procédure chirurgicale standard d’une souris MI par ligature permanente de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), suivie de trois injections intracardiaques de site de modRNA. L’objectif de cet article est de définir clairement une méthode très précise et reproductible de livraison modRNA au myocarde murine pour rendre l’application modRNA largement accessible pour la thérapie génique cardiaque.
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Protocol
Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du Comité des soins et de l’utilisation des établissements du Mont Sinaï.
1. Synthèse de modRNA
NOTE : Les détails de la synthèse de modRNA peuvent être trouvés dans Kondrat et al.13.
- Commandez les modèles plasmides (Table des matériaux)et générer un produit PCR propre à utiliser comme modèle d’ARNm.
- Préparer les modARN par transcription in vitro avec un mélange ribonucléoside personnalisé de ce qui suit (Tableau des matériaux):Kit de transcription T7, 6 mM anti-reverse cap analogique (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine triphosphate, 75 mM adénosine triphosphate, 75 mM cytidine triphosphate, 100 mM pseudouridine-5-triphosphate, et T7 DNase enzyme.
- Purifier le modRNA fait à l’étape 1.2 avec un kit de nettoyage de transcription (Table des matériaux) et traiter avec la phosphatase antarctique. Ensuite, réutiliser le modRNA avec le kit de nettoyage de transcription et le quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Précipitez le modRNA avec de l’éthanol et de l’acétate d’ammonium et resuspendez en 10 mM Tris-HCl et 1 mM EDTA.
- Concentrer le modRNA pour la livraison in vivo par des filtres centrifuges et mesurer la qualité à l’aide d’une plate-forme automatisée d’électrophorèse (Table des matériaux).
2. Préparation de l’injection de modRNA pour la livraison in vivo
- Calculer le volume nécessaire pour 100 μg d’injection de luciferase (Luc)/Cre modRNA en fonction de la concentration de modRNA.
- Mélanger le volume calculé de modRNA avec des parties égales de la solution de saccharose préparée dans de l’eau libre de nucléase (0,3 g/mL) et la solution de citrate de 0,1 M (pH = 7) (20 μL chacun recommandé).
- Porter le volume final de l’injection à 60 μL en ajoutant une solution saline.
3. Chirurgie d’infarctus du myocarde
- Anesthésie et préparation de l’animal
REMARQUE : Cette étude utilise des souris CFW mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines.- Anesthésier la souris avec 2% d’isoflurane à l’aide d’une chambre à induction et placer l’animal sur son dos dans une position dorsale avec un masque facial sur son nez et la bouche pour maintenir l’anesthésie. Maintenir l’anesthésie par ventilation mécanique à l’aide d’un respirateur équipé d’un tube des voies respiratoires de 7 à 8 mm et d’un filtre.
- Pour immobiliser la souris sur la plate-forme chirurgicale, fixer ses membres avec du ruban adhésif chirurgical. raser la région du cou et le côté gauche de la cage thoracique et désinfecter à l’aide de 70% d’éthanol et d’iode povidone. Répétez l’étape de désinfection deux fois. Vérifiez ses réflexes, en pinçant la queue et les pieds arrière pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.
- Surveiller et maintenir en permanence la température corporelle centrale à la normothermie (37,5−38 °C).
- Maintenir une voie aérienne ouverte en effectuant l’intubation intratrachéale. Pour ce faire, placez la souris dans une position ventrale avec sa bouche orientée vers l’expérimentateur et retirez doucement la langue. Ajuster l’angle du cou et redresser le chemin d’intubation et pousser dans la canule d’intubation.
- Dans le cas où l’animal est incapable de respirer à travers elle, la trachéotomie peut être effectuée. Effectuer une incision cervicale le long de la ligne médiane isolant la peau, le muscle et le tissu décrivant la trachée à l’aide d’un microscope. Lorsque la trachée est clairement visible, insérez le tube endotrachéal dans le tissu entre deux anneaux de cartouche sous la glotte en faisant un petit trou et en maintenant la partie crânienne de la trachée à l’aide de forceps microchirurgicales.
- Observez le mouvement thoracique de la souris pour vérifier que les deux poumons reçoivent de l’oxygène. La fréquence respiratoire (RR) devrait être d’environ 120 respirations par minute, avec une pression inspiratrice de 17−18 cm H2O.
- Ligature de l’artère descendante antérieure gauche (LAD)
- Pour effectuer la ligature LAD, tournez la souris soigneusement de sorte qu’elle est couchée sur son côté droit. Soulevez la peau et effectuez une thoracotomie latérale gauche entre la 3ème et la 4ème côte et disséquez soigneusement le tissu et le muscle. Utilisez une cautérise pour prévenir les saignements.
- Ouvrez soigneusement le thorax et une fois qu’il est ouvert, trouver le cœur, sans toucher le poumon avec un objet pointu. Placez les rétractateurs dans l’incision pour garder la cavité thoracique ouverte et avoir une vue claire du cœur. Maintenant, déplacez les poumons au bord de l’incision et enlever la partie du sac péricardique qui recouvre le cœur pour accéder à la surface antérieure du cœur.
- Identifiez soigneusement le LAD, qui peut être considéré comme un vaisseau rouge clair profond situé entre l’artère pulmonaire et l’auricule gauche. Lier la proximité LAD avec une seule suture d’une suture de soie 7-0. Placer un tube thoracique (28 G, cathéter vénal), entre la 4e et la 5e côte.
- Fermez l’incision thoracique en couches. Utilisez les sutures de soie 6-0 pour adapter les côtes et utilisez des sutures en soie 5-0 pour fermer la peau. Assurez-vous de laisser une fenêtre appropriée pour la mesure échocardiographique future.
- Égoutter soigneusement le thorax avec une solution isotonique chaude (9 g de chlorure de sodium dans 1 L d’eau) à l’aide d’une seringue de 2 mL. Placez la souris sur son dos. Si vous effectuez une trachéotomie, sortez le tube endotrachéal et à l’aide de sutures de soie 7-0, adaptez les anneaux de cartouche trachéale d’un seul point. Placez le masque sur la souris et fermez la peau à l’aide de sutures en soie 5-0.
- Pour la phase de récupération, déconnectez la canule d’intubation du ventilateur et permettez une respiration spontanée. Placez l’animal sous une lampe thermique jusqu’à ce qu’il atteigne la conscience. Ne laissez pas l’animal sans surveillance après la chirurgie jusqu’à ce qu’il soit complètement éveillé.
- Gérez la thérapie de la douleur avec de la buprénophine à 0,1 mg/kg de poids corporel, injecté sous-cutanée pendant les 3 prochains jours à intervalles de 12 h.
4. Livraison cardiaque de modRNA
- Délivrer un total de 60 μL du modRNA préparé à l’étape 2.3 intramusculaire (IM) à l’aide d’une seringue à insuline (31 G) à la suite d’une MI.
- Injectez 20 μL du modRNA à trois endroits différents du muscle cardiaque entourant la zone infarctus (deux de chaque côté de la ligature et un dans l’apex). Effectuez les injections immédiatement après le LAD, avant de fermer la poitrine.
REMARQUE : Des images représentatives des sites d’injection modRNA peuvent être vues dans la figure 1.
- Injectez 20 μL du modRNA à trois endroits différents du muscle cardiaque entourant la zone infarctus (deux de chaque côté de la ligature et un dans l’apex). Effectuez les injections immédiatement après le LAD, avant de fermer la poitrine.
5. Validation d’expression de protéine dans le poteau de coeur MI
- Expression de Luciferase modRNA à l’aide d’un système d’imagerie en bioluminescence
REMARQUE : Un total de 100 μg d’ARNm de Luc préparé dans 60 μL du tampon de citrate de saccharose est directement injecté dans le cœur des souris cfw après l’IM.- À 24 h après l’injection de MI et de modRNA, anesthésiez les souris avec 2% d’isoflurane à l’aide d’une chambre d’induction et intraperitonone injectez de la luciferine (150 mg/g de poids corporel) pour valider le signal Luc in vivo.
- Imagez les souris à l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence toutes les 2 minutes jusqu’à ce que le signal Luc atteigne la saturation.
- Quantifier les données d’imagerie recueillies à l’une des données d’imagerie. Utilisez les souris injectées avec de la solution saline uniquement comme lecture de base pour l’expression de Luc et soustrayez le signal d’arrière-plan recueilli sur les souris salines injectées.
REMARQUE : Le signal luc est exprimé en p/s/cm2/sr x 106.
- Immunostaining pour la validation de transfection Cre
- Pour valider la transfection avec Cre, sacrifiez les animaux 24 h post-injection à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine suivie d’une luxation cervicale. Avant de faire une incision, désinfecter la poitrine et l’abdomen à l’aide d’un écouvillon 70% d’alcool.
- Ouvrez la cavité thoracique en faisant une incision transversale ~1 cm plus bas que le sternum et déplacez les ciseaux vers la tête, en coupant à travers la cage thoracique.
- Ouvrez la poitrine et injectez 1 mL de PBS stérile dans la chambre ventriculaire droite pour enlever l’excès de sang. Exciser le cœur immédiatement et le placer dans le PBS stérile pour laver le sang restant.
- Fixer le cœur en 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 24 h, suivi de l’incubation de nuit dans une solution de saccharose à 30% à 4 °C. Le lendemain, incorporer les cœurs dans un milieu de température de coupe optimal et les sectionr à une épaisseur de 10 μm à l’aide d’un cryostat.
- Tacher les sections avec un anticorps primaire contre la troponine cardiaque I (cTNI) et les étiqueter avec un anticorps secondaire fluorescent. Pour identifier le noyau, tacher avec 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Image les diapositives à l’aide d’un microscope fluorescent.
6. Analyse statistique
- Tracez un graphique à barres basé sur l’expression luc chez les souris salines et luc-injectées et signalez les valeurs comme moyennes ± SEM. Comparez les deux groupes à l’aide d’un t-test non apparié (****p < 0,0001).
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Representative Results
Huit à dix semaines-vieux souris ont été anesthésiés avec l’isoflurane et intubé. Après que l’animal ait été sous anesthésie, la région thoracique gauche a été rasée et stérilisée avec l’éthanol, et le coeur a été exposé pour la ligature de LAD. L’artère coronaire gauche a été occluse en nouant fermement la suture sous l’artère (représentation du diagramme figure 1A). Après un infarctus réussi (indiqué par la paling de la paroi libre ventriculaire gauche), une injection directe de 100 μg de Luc ou Cre modRNA dissous dans le tampon de citrate de saccharose a été livrée directement dans le myocarde à trois sites différents (figure 1B) entourant la zone de blessure à l’aide d’une seringue d’insuline. La procédure MI avec des injections de modRNA a duré 30−45 min par animal. Les animaux ont montré environ 90% de taux de survie postprocedure. Après la procédure, la poitrine et la peau ont été fermement suturées en couches et l’animal a été retiré de la ventilation dès qu’il a commencé à respirer normalement.
Après avoir effectué la ligature LAD et la livraison subséquente de Luc modRNA injection, nous avons validé la transfection Luc modRNA en vérifiant l’expression de la protéine Luc 24 h post-injection à l’aide d’un système d’imagerie bioluminescence (Figure 2A). Nous avons établi dans des publications précédentes que bien que l’expression de protéine peut être vu jusqu’au jour 6 posttransfection, l’efficacité de transfection la plus élevée de modRNA est observée à 24 h8. De même, nous avons détecté avec succès le signal Luc dans le cœur traité avec l’injection de Luc modRNA (1,76 x 108) par rapport aux souris injectées avec tampon de citrate de saccharose après MI (3.0 x 105) (Figure 2B).
En outre, nous avons cherché à valider l’expression modRNA en vérifiant sa traduction et la biodistribution dans une souris transgénique Rosa26mTmG. Ce système de modèle de souris exprime l’expression de fluorescence tdTomato (mT) localisée par membrane cellulaire dans toutes les cellules/tissus du corps et les changements à l’expression de fluorescence egfp (mG) localisée par membrane cellulaire lors de la recombinaison de Cre. Ainsi, pour observer l’expression de la Cre modRNA, 100 μg Cre modRNA a été injecté directement dans le myocarde post-MI chez Rosa26mTmG souris mâles et femelles, et les animaux ont été sacrifiés 24 h postsurgery. Les cœurs ont été fixés et traités pour l’immunostaining avec le marqueur de cardiomyocyte cTNI et le marqueur nucléaire DAPI (Figure 3A). L’expression réussie de Cre était évidente en raison de l’apparition des cellules de couleur verte (Figure 3B), qui étaient le résultat de la recombinaison avec le modRNA de Cre livré à la souris, représenté par le changement de la couleur tdTomato à EGFP autour du site d’injection de Cre (Figure 3C).
Figure 1 : Ligature lad et livraison cardiaque de modRNA. (A) Diagramme schématique montrant la zone de ligature de LAD et trois emplacements d’injection de modRNA. (B) Images représentatives de l’ensemble du cœur de la souris après un IM réussie induite par la ligature permanente (a) et les sites d’injection modRNA suivant l’IM. Les 100 μg de modRNA dissous dans 60 μL de tampon de citrate de saccharose ont été livrés dans la zone frontalière entourantl’infarctus,deux de chaque côté de la ligature (b,c) et un dans l’apex ( d ). Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Analyse d’expression de Luc après injection de modRNA. Tampon de citrate de saccharose contenant 100 μg de Luc modRNA a été injecté directement dans le myocarde des souris cfw dans une chirurgie à poitrine ouverte. Le système d’imagerie de bioluminescence a été utilisé pour calculer l’expression de la protéine Luc à 24 heures après l’injection. (A) Images bioluminescentes comparatives de souris témoins (transfectées avec tampon seulement) par rapport aux souris injectées avec Luc modRNA. (B) Quantification du signal de Luc par rapport aux souris témoins mesurées après 24 heures à l’aide d’un imageur de bioluminescence. La barre d’erreur représente SEM avec p < 0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Validation de l’expression Cre in vivo. Images représentatives de sections transversales de coeur transfectées (vue à axe court) validant l’expression de Cre modRNA dans la souris Rosa26mTmG 24 heures après l’injection. (A) Les cardiomyocytes immunostained avec cTNI (rouge). (B) Les cellules de couleur verte représentent les cellules transfectées de Cre. (C) Image fusionnée montrant les cellules activées de Cre autour des deux injections. Le bleu est la tache nucléaire DAPI. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La thérapie génique a montré un potentiel énorme pour faire progresser de manière significative le traitement des maladies cardiaques. Cependant, les outils traditionnels utilisés dans les essais cliniques initiaux pour le traitement de la HF ont montré un succès limité et sont associés à des effets secondaires graves. L’ARN modifié présente une livraison de gène nonviral qui gagne continuellement en popularité en tant qu’outil de transfert de gènes dans le cœur. ModRNA ne nécessite aucune localisation nucléaire des gènes pour la traduction, et offre ainsi une expression efficace et rapide de la protéine. De plus, comme l’ARNm ne s’intègre pas dans l’hôte du génome, la livraison de gènes par modRNA élimine le risque de mutagenèse. Par conséquent, en raison de ses avantages par rapport aux vecteurs conventionnels de distribution de gènes, modRNA est devenu l’une des plates-formes les plus attrayantes pour la livraison de gènes uniques ou de combinaisons de gènes au cœur. Cependant, à ce jour, il n’y a pas de protocole normalisé pour la préparation et le transfert de l’ARN modrna dans le postinjury de coeur. Ainsi, l’objectif ici était d’établir un protocole standard et optimisé pour la livraison intracardiaque de modRNA dans le coeur de rongeur pour améliorer l’utilisation de modRNA comme outil de thérapie génique et pour le rendre approprié à des fins thérapeutiques.
Dans ce protocole, modRNA est préparé en remplaçant l’uridine par la pseudouridine, suivie d’un plafonnement par ARCA à la fin de 5'. Ces changements dans la structure secondaire de l’ARNm ont été montrés pour rendre une traduction plus élevée de protéines par rapport à diverses autres modifications de nucléotide8. En outre, cette structure modifiée d’ARNm échappe à l’immunogénicité après les injections de MESSAGERIE instantanée chez les souris en limitant sa reconnaissance par des récepteurs et des nucléases de péage6. Ici, nous avons montré que la livraison d’ARNm nu avec tampon de citrate de saccharose produit la traduction forte de protéine dans le coeur utilisant un modèle de MI de souris. Dans nos études précédentes, nous avons établi la supériorité de modRNA livré avec le tampon de citrate de saccharose dans le coeur par rapport à l’encapsulation de modRNA dans les nanoparticules, telles que la fectamine in vivo ou in vivo jetPEI, qui peut entraver la traduction modRNA dans la protéine8. La forte préservation de l’ARN par le citrate et l’énergie supplémentaire fournie par le saccharose pour l’endocytose en plus de sauver l’agglutination modRNA à brin unique pourrait être la raison de l’augmentation marquée de la traduction de modRNA livré dans le tampon de citrate de saccharose.
Bien que l’utilisation de modRNA ait augmenté dans les études précliniques et cliniques10,14 au cours de la dernière décennie, certains secteurs doivent être étudiés pour le succès amélioré de modRNA dans la clinique. Tout d’abord, la synthèse de l’ARN mod dans les quantités élevées requises pour les investigations thérapeutiques peut être coûteuse. Ainsi, il est essentiel de développer le modRNA de qualité clinique et rentable pour déplacer le champ vers une phase clinique de thérapie d’ARN chez l’homme. Deuxièmement, une méthode d’administration cliniquement applicable pour modRNA doit être identifiée. Compte tenu des dommages causés par les injections cardiaques de GI, les méthodes moins invasives d’administration à base de cathéter pourraient être plus plausibles dans le transfert de la grande quantité de modRNA nécessaire pour transfecter de grands coeurs.
En conclusion, ce travail a démontré la livraison réussie de l’ARN contenant des modifications de pseudouridine dans le poteau de coeur de souris MI. La livraison de modRNA dans le tampon de citrate de saccharose a donné une expression forte de protéine 24 heures après l’injection. Ce protocole permet aux chercheurs de suivre une livraison normalisée et l’évaluation des protéines dans le cœur après la blessure et ainsi fournir plus d’accessibilité dans la préparation et la livraison de modRNA pour leur recherche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent Ann Anu Kurian pour son aide avec ce manuscrit. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage en cardiologie accordée au laboratoire Zangi ainsi que par la subvention des NIH R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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