Summary

心筋梗塞マウスモデルにおける修飾mRNAの導入

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

このプロトコルは、マウスの心筋梗塞後にmodRNAを使用して、目的の遺伝子を一時的にアップアレートする簡単で一貫した方法を提示する。

Abstract

心筋梗塞(MI)は、西洋世界における罹患率と死亡率の主要な原因である。過去10年間で、遺伝子治療は、その効率と例外的な治療効果のために、心臓病の有望な治療法となっています。MI後の損傷した組織を修復するために、様々な研究がDNAベースまたはウイルス遺伝子治療を採用しているが、送達された遺伝子、浮腫、不整脈、および心臓肥大の貧弱で制御不能な発現のためにかなりのハードルに直面している。合成修飾mRNA(modRNA)は、ゲノム統合のリスクなしに、高、一過性、安全、非免疫性、および制御されたmRNA送達を心臓組織に提供する新しい遺伝子治療アプローチを提示する。これらの顕著な特徴と心臓の鐘状の薬物動態を組み合わせることで、modRNAは心臓病の治療のための魅力的なアプローチとなっています。しかし、生体内での有効性を高めるためには、一貫した信頼性の高い配信方法に従う必要があります。したがって、modRNA送達効率を最大化し、in vivoアプリケーションに対するmodRNA使用の一貫性を得るために、マウスMIモデルにおけるmodRNAイントラ心臓内注入の調製および送達の最適化された方法が提示される。このプロトコルは、基礎的および翻訳的研究のためにmodRNAの提供をよりアクセスしやすくする。

Introduction

遺伝子治療は、ヒト疾患の治療、治癒、または予防のための核酸の送達を含む強力なツールです。心臓病の診断および治療アプローチの進歩にもかかわらず、心筋梗塞(MI)および心不全(HF)における遺伝子の送達には限られた成功があった。遺伝子治療のプロセスが簡単に見えるように、特定の送達車両を採用する前に最適化する必要がある多くの要因を考慮すると、著しく複雑なアプローチです。正しい送達ベクターは、非免疫原性、効率的、および人体の中で安定である必要があります。この分野での取り組みは、ウイルスまたは非ウイルスの2種類の送達システムを生成しました。アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスによる遺伝子導入を含む広く使用されているウイルス系は、例外的な導入能力を示している。しかし、クリニックでのそれらの使用は、強い免疫応答誘発1、腫瘍形成2のリスク、または中和抗体3の存在によって制限され、そのすべてがヒト遺伝子治療におけるウイルスベクターの広範かつ効果的な適用に対する主要な障害であり続ける。一方、その印象的な発現パターンにもかかわらず、裸のプラスミドDNAの送達はトランスフェクション効率が低く、mRNA転移はRNase4による分解に対する高い免疫原性および感受性を示4す。

mRNAの分野での広範な研究により、modRNAは、従来のベクター5よりも多くの利点のために、心臓および様々な他の器官に遺伝子を送達するための魅力的なツールとなっています。天然に存在するシュード尿酸と尿酸尿素を完全に置換すると、より強く一過性のタンパク質発現が生じ、自然免疫応答の誘導とゲノム統合のリスクが最小限に抑えられる6。最近確立されたプロトコルは、合成mRNA7の安定性とトランスバビリティを高めることでタンパク質翻訳をさらに高めるアンチリバースキャップアナログ(ARCA)の最適化量を使用する。

これまでの報告では、MI後のげっ歯類心筋の中でmodRNAによって送達される様々なレポーターまたは機能性遺伝子の発現が示されている。modRNAの適用により、心筋細胞および非心筋細胞の両方を含む心筋の重要な領域は、血管新生99、10、10心筋細胞生存11、および心筋細胞増殖を誘導する心筋損傷8のトランスフェクションに成功している。変異したヒトフォリスタチン様1に対してコードされるmodRNAの単一投与は、マウス成体CMの増殖を誘導し、心機能を有意に増加させ、瘢痕サイズを減少させ、そしてMI12後4週間の毛細血管密度を増加させる。最近の研究では、豚モデル10におけるVEGFA modRNAの適用によるMI後の心臓機能の改善が報告された。

したがって、心臓フィールドにおけるmodRNAの普及率の高まりに伴い、心臓ポストMIへのmodRNAの送達のためのプロトコルを開発し最適化することが不可欠である。このプロトコルおよびビデオに示す方法は、左前下方動脈(LAD)の永久結紮によるマウスMIの標準的な外科的処置を示し、続いて3つの部位のmodRNAの心臓内注射を行う。本論文の目的は、マウス心筋へのmodRNA送達の非常に正確で再現性の高い方法を明確に定義し、modRNAの適用を心臓遺伝子治療に広く利用できるようにすることである。

Protocol

ここで概説されているすべての動物の手順は、マウントシナイ制度ケアと使用委員会でIcahn医学部によって承認されています。 1. モドRNAの合成 注:modRNA合成の詳細はKondratら13.にあります。 プラスミドテンプレート(材料表)を注文し、mRNAテンプレートとして使用するクリーンなPCR製品を生成します。 以下?…

Representative Results

生後8~10週齢のマウスをイゾフルランで麻酔し、挿管した。動物が麻酔下にあった後、左胸部領域を剃ってエタノールで殺菌し、心臓をLAD結紮のために露出させた。左冠動脈は、動脈の下に縫合糸をしっかりと結び付けることによって閉塞した(図表図1A)。梗塞が成功した後(左心室自由壁の青白で示される)、スク糖バッファーに溶解したLucまたはCre modRNAの100 μgの直接注?…

Discussion

遺伝子治療は、心疾患の治療を大幅に進める大きな可能性を示しています。しかし, HF の治療のための最初の臨床試験で採用されている従来のツールは限られた成功を示しており、重篤な副作用に関連付けられている.修飾RNAは、心臓における遺伝子導入ツールとして絶えず人気を集めている非ウイルス遺伝子の送達を提示する。ModRNAは翻訳のために遺伝子の核局在を必要としないため、タン?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、アン・アヌ・クリアンがこの原稿を助けたであることを認めている。この研究は、ザンギ研究所に授与された心臓病のスタートアップ助成金とNIH助成金R01 HL142768-01によって資金提供されました

Materials

Adenosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G TriLink Biotechnologies N-7003
Bioluminescense imaging system Perkin Elmer 124262 IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors FST 18200-09
Cardiac tropnin I Abcam 47003
Cytidine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System Harvard Apparatus 75-2001
Forceps- Adson FST 91106-12
Forceps- Dumont #7 FST 91197-00
Guanosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
In vitro transcription kit Invitrogen AMB13345 5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula Harvard Apparatus
Megaclear kit Life Technologies
Mouse ventilator Harvard Apparatus 73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081
NanoDrop Spectrometer Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors FST 12002-12
Plasmid templates GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors FST 14200-12
Stereomicroscope Zeiss
Sutures Ethicon Y433H 5.00
Sutures Ethicon Y432H 6.00
Sutures Ethicon 7733G 7.00
T7 DNase enzyme Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Tape station Aligent 4200
Transcription clean up kit Invitrogen AM1908 Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k Amicon UFC801096

References

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Cite This Article
Kaur, K., Sultana, N., Hadas, Y., Magadum, A., Sharkar, M. T. K., Chepurko, E., Zangi, L. Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model. J. Vis. Exp. (160), e60832, doi:10.3791/60832 (2020).

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