Summary
このプロトコルは、マウスの心筋梗塞後にmodRNAを使用して、目的の遺伝子を一時的にアップアレートする簡単で一貫した方法を提示する。
Abstract
心筋梗塞(MI)は、西洋世界における罹患率と死亡率の主要な原因である。過去10年間で、遺伝子治療は、その効率と例外的な治療効果のために、心臓病の有望な治療法となっています。MI後の損傷した組織を修復するために、様々な研究がDNAベースまたはウイルス遺伝子治療を採用しているが、送達された遺伝子、浮腫、不整脈、および心臓肥大の貧弱で制御不能な発現のためにかなりのハードルに直面している。合成修飾mRNA(modRNA)は、ゲノム統合のリスクなしに、高、一過性、安全、非免疫性、および制御されたmRNA送達を心臓組織に提供する新しい遺伝子治療アプローチを提示する。これらの顕著な特徴と心臓の鐘状の薬物動態を組み合わせることで、modRNAは心臓病の治療のための魅力的なアプローチとなっています。しかし、生体内での有効性を高めるためには、一貫した信頼性の高い配信方法に従う必要があります。したがって、modRNA送達効率を最大化し、in vivoアプリケーションに対するmodRNA使用の一貫性を得るために、マウスMIモデルにおけるmodRNAイントラ心臓内注入の調製および送達の最適化された方法が提示される。このプロトコルは、基礎的および翻訳的研究のためにmodRNAの提供をよりアクセスしやすくする。
Introduction
遺伝子治療は、ヒト疾患の治療、治癒、または予防のための核酸の送達を含む強力なツールです。心臓病の診断および治療アプローチの進歩にもかかわらず、心筋梗塞(MI)および心不全(HF)における遺伝子の送達には限られた成功があった。遺伝子治療のプロセスが簡単に見えるように、特定の送達車両を採用する前に最適化する必要がある多くの要因を考慮すると、著しく複雑なアプローチです。正しい送達ベクターは、非免疫原性、効率的、および人体の中で安定である必要があります。この分野での取り組みは、ウイルスまたは非ウイルスの2種類の送達システムを生成しました。アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスによる遺伝子導入を含む広く使用されているウイルス系は、例外的な導入能力を示している。しかし、クリニックでのそれらの使用は、強い免疫応答誘発1、腫瘍形成2のリスク、または中和抗体3の存在によって制限され、そのすべてがヒト遺伝子治療におけるウイルスベクターの広範かつ効果的な適用に対する主要な障害であり続ける。一方、その印象的な発現パターンにもかかわらず、裸のプラスミドDNAの送達はトランスフェクション効率が低く、mRNA転移はRNase4による分解に対する高い免疫原性および感受性を示4す。
mRNAの分野での広範な研究により、modRNAは、従来のベクター5よりも多くの利点のために、心臓および様々な他の器官に遺伝子を送達するための魅力的なツールとなっています。天然に存在するシュード尿酸と尿酸尿素を完全に置換すると、より強く一過性のタンパク質発現が生じ、自然免疫応答の誘導とゲノム統合のリスクが最小限に抑えられる6。最近確立されたプロトコルは、合成mRNA7の安定性とトランスバビリティを高めることでタンパク質翻訳をさらに高めるアンチリバースキャップアナログ(ARCA)の最適化量を使用する。
これまでの報告では、MI後のげっ歯類心筋の中でmodRNAによって送達される様々なレポーターまたは機能性遺伝子の発現が示されている。modRNAの適用により、心筋細胞および非心筋細胞の両方を含む心筋の重要な領域は、血管新生99、10、10心筋細胞生存11、および心筋細胞増殖を誘導する心筋損傷8のトランスフェクションに成功している。変異したヒトフォリスタチン様1に対してコードされるmodRNAの単一投与は、マウス成体CMの増殖を誘導し、心機能を有意に増加させ、瘢痕サイズを減少させ、そしてMI12後4週間の毛細血管密度を増加させる。最近の研究では、豚モデル10におけるVEGFA modRNAの適用によるMI後の心臓機能の改善が報告された。
したがって、心臓フィールドにおけるmodRNAの普及率の高まりに伴い、心臓ポストMIへのmodRNAの送達のためのプロトコルを開発し最適化することが不可欠である。このプロトコルおよびビデオに示す方法は、左前下方動脈(LAD)の永久結紮によるマウスMIの標準的な外科的処置を示し、続いて3つの部位のmodRNAの心臓内注射を行う。本論文の目的は、マウス心筋へのmodRNA送達の非常に正確で再現性の高い方法を明確に定義し、modRNAの適用を心臓遺伝子治療に広く利用できるようにすることである。
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Protocol
ここで概説されているすべての動物の手順は、マウントシナイ制度ケアと使用委員会でIcahn医学部によって承認されています。
1. モドRNAの合成
注:modRNA合成の詳細はKondratら13.にあります。
- プラスミドテンプレート(材料表)を注文し、mRNAテンプレートとして使用するクリーンなPCR製品を生成します。
- 以下のカスタマイズされたリボヌクレオシドブレンド(材料表):T7転写キット、 6 mM アンチリバースキャップアナログ (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM グアノシン三リン酸, 75 mM アデノシン三リン酸, 75 mM シチジン三リン酸, 100 mM シュードリジン-5-三リン酸, T7 DNase酵素.
- ステップ1.2で作られたmodRNAを転写クリーンアップキット(材料表)で精製し、南極ホスファターゼで治療します。次に、転写クリーンアップキットでmodRNAを再精製し、分光光度計を用いて定量化する。
- モドRNAをエタノールと酢酸アンモニウムで沈殿させ、10 mM Tris-HClおよび1 mM EDTAで再懸濁します。
- 遠心フィルターによる生体内送達用のmodRNAを濃縮し、自動化された電気泳動プラットフォーム(材料表)を使用して品質を測定する。
2. 生体内送達のためのmodRNA注入の調製
- モドRNA濃度に基づいて、ルシファーゼ(Luc)/Cre modRNA注入の100 μgに必要な体積を計算します。
- 計算されたモッRNAの体積をヌクレアーゼフリー水(0.3 g/mL)および0.1 Mクエン酸溶液(pH = 7)(それぞれ推奨される20 μL)で調製したスクロース溶液の等しい部分と混合します。
- 生理液を加えて、注入の最終容積を60μLにします。
3. 心筋梗塞手術
- 動物の麻酔と準備
注:この研究は、生後8〜12週の雄と雌のCFWマウスを使用しています。- 誘導室を使用して2%イ皮溶ランでマウスを麻酔し、麻酔を維持するために鼻と口の上にフェイスマスクを付けた背部位置に動物を背部に置きます。7-8 mm気道管とフィルターを装備した人工呼吸器を使用して、機械的換気によって麻酔を維持します。
- 手術プラットフォーム上でマウスを固定するには、外科用テープで手足を固定します。胸部の首の領域と左側を剃り、70%エタノールとポビドネヨウ素を使用して消毒します。消毒手順を2回繰り返します。麻酔の深さを評価するために尾と後ろ足をつまんで、その反射神経をチェックしてください。
- ノルマニア(37.5-38 °C)でコア体温を継続的に監視し、維持します。
- 気管内挿管を行うことによって、開いた気道を維持します。これを行うには、マウスを腹側の位置に置き、口を実験者に向けて置き、舌をそっと引き出します。首の角度を調整し、挿管経路をまっすぐにし、挿管カニューレを押します。
- 動物が呼吸を通して呼吸できない場合には、気管切開を行うことができる。顕微鏡を用いて、皮膚、筋肉、組織を隔離する正中線に沿って子宮頸部切開を行う。気管がはっきりと見える場合は、小さな穴を開け、微小手術鉗子を使用して気管の頭蓋部分を保持することによって、気管内チューブを、グロティスの下の2つのカートリッジリングの間の組織に挿入します。
- マウスの胸部の動きを観察し、両方の肺が酸素を受け取っていることを確認します。呼吸数(RR)は1分あたり約120回の呼吸で、吸気圧は17-18 cm H2Oです。
- 左前前降下(LAD)動脈結紮
- LADライゲーションを行うために、マウスを右側に横たわるように注意深く回します。皮膚を持ち上げ、3番目と4番目の肋骨の間で左側面の胸部切除術を行い、組織と筋肉を慎重に解剖します。出血を防ぐために焼灼を使用してください。
- 胸郭を慎重に開き、開いたら、鋭利な物体で肺に触れることなく、心臓を見つけます。胸腔を開いたままにして心臓をはっきりと見るために、切開部にレトラクタを置きます。今度は肺を切開の端に移動し、心臓を覆っている心膜嚢の一部を取り除いて心臓の前表面にアクセスする。
- 肺動脈と左耳結部の間に位置する深い光赤色の血管として見ることができるLADを慎重に特定する。7-0シルク縫合糸の単一縫合糸でLAD近位をリゲートします。胸管(28G、静脈カテーテル)を、第4肋骨と第5肋骨の間に置く。
- 胸部切開部を層で閉じます。リブを適応させるために6-0シルクランニング縫合糸を使用し、皮膚を閉じるために5-0シルクランニング縫合糸を使用してください。将来の心エコー測定のために適切なウィンドウを残してください。
- 2 mL のシリンジを使用して、温かい等張液(水1Lに塩化ナトリウム 9 g)を慎重に排出します。マウスを背面に置きます。気管切開術を行う場合は、気管内チューブを取り出し、7-0シルク縫合糸を使用すると、気管カートリッジリングを1つのステッチで調整します。フェイスマスクをマウスに置き、5-0シルクランニング縫合糸を使用して皮膚を閉じます。
- 回復段階では、挿管カニューレを人工呼吸器から切り離し、自発的な呼吸を可能にする。意識が得られるまで、動物をヒートランプの下に置きます。完全に目が覚めていくまで、手術後は動物を放置しないでください。
- ブプレノフィンを用いた疼痛療法を0.1mg/kg体重で管理し、12時間間隔で次の3日間皮下注射を行う。
4. modRNAの心臓送達
- MIに続くインスリン注射器(31G)を用いて、ステップ2.3の筋肉内(IM)で調製したmodRNAの合計60μLを送達する。
- 梗塞領域を取り囲む心筋の3つの異なる部位(ライクトの両側に2つ、頂点に1つ)でmodRNAの20 μLを注入します。胸部を閉じる前に、LADの直後に注射を行います。
注: modRNA インジェクション部位の代表的な画像は、図 1に示されています。
- 梗塞領域を取り囲む心筋の3つの異なる部位(ライクトの両側に2つ、頂点に1つ)でmodRNAの20 μLを注入します。胸部を閉じる前に、LADの直後に注射を行います。
5. 心臓ポストMIにおけるタンパク質発現の検証
- 生物発光イメージングシステムを用いたルシメラーゼmodRNA発現
注:60μLのスク糖バッファーで調製されたLuc mRNAの合計100 μgは、MIの後にCFWマウスの心臓に直接注入されます。- 24時間ポストMIおよびmodRNA注射で、誘導チャンバーを用いて2%イソフルランを用いてマウスを麻酔し、腹腔内注入ルシフェリン(150mg/g体重)をインビボでLucシグナルを検証する。
- Luc シグナルが飽和状態になるまで、2 分ごとに生物発光イメージング システムを使用してマウスを画像化します。
- 収集した画像データをイメージング解析ソフトウェアで定量化します。生理学を注射したマウスは、Luc発現のベースライン読み取り値としてのみ使用し、生理学注射マウスから収集されたバックグラウンドシグナルを差し引きます。
注意:Luc信号はp/ s / cm2/sr x 10 6で表されます。
- 遺伝子導入検証のための免疫染色
- クレでトランスフェクションを検証するには、100mg/kgケタミンと10mg/kgのキシラジンの後に頚部脱臼の腹腔内注射を使用して、24時間の注射後に動物を犠牲にします。切開する前に、70%アルコール綿棒を使用して胸部および腹部を消毒する。
- 胸骨より1cm低い横切開を行い、頭に向かってハサミを動かし、肋骨ケージを切り裂いて胸腔を開きます。
- 胸部を開き、右心室に1mLの無菌PBSを注入して余分な血液を除去します。すぐに心臓を切り出し、残りの血液を洗い流すために滅菌PBSに入れます。
- 心臓を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で24時間固定し、続いて4°Cで30%スクロース溶液中で一晩インキュベーションを行った。翌日は最適な切断温度媒体に心臓を埋め込み、クライオスタットを使用して10μmの厚さでそれらを切り離します。
- 心臓トロポニンI(cTNI)に対して一次抗体でセクションを染色し、蛍光二次抗体で標識します。核を特定するには、4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を5分間染色し、蛍光顕微鏡を使用してスライドを画像化します。
6. 統計分析
- 生理的なマウスとLuc注射マウスのLuc式に基づいて棒グラフをプロットし、平均値±SEMとして値を報告します。
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Representative Results
生後8~10週齢のマウスをイゾフルランで麻酔し、挿管した。動物が麻酔下にあった後、左胸部領域を剃ってエタノールで殺菌し、心臓をLAD結紮のために露出させた。左冠動脈は、動脈の下に縫合糸をしっかりと結び付けることによって閉塞した(図表図1A)。梗塞が成功した後(左心室自由壁の青白で示される)、スク糖バッファーに溶解したLucまたはCre modRNAの100 μgの直接注射を、インスリン注射器を用いて傷害領域を取り囲む3つの異なる部位(図1B)で直接心筋に送達した。モッズRNA注射によるMI処置は、動物1匹につき30〜45分間続いた。動物は約90%の生存率後術を示した。処置後、胸部と皮膚は層でしっかりと縫合され、動物は正常に呼吸を始めたとたんに換気から取り除かれた。
LADライゲーションとその後のLuc modRNA注入の送達を行った後、我々は、生物発光イメージングシステムを用いたLucタンパク質発現24時間のトランスフェクションを検証した(図2A)。我々は、トランスフェクション6日目までタンパク質発現が見られるが、modRNAの最も高いトランスフェクション効率は24時間8で観察されることを以前の出版物で確立した。同様に、Luc modRNA注射で治療した心臓のLucシグナル(1.76 x 108)をMI後にクエン酸スクエン酸バッファーを注射したマウスと比較して正常に検出した5(図2B)。
さらに、トランスジェニックRosa26mTmGマウスでの翻訳と生体分布をチェックして、modRNA発現を検証することを検討しました。このマウスモデルシステムは、細胞膜に局在するtdTomato(mT)蛍光発現を全ての体細胞/組織で発現し、細胞膜に局在したEGFP(mG)蛍光発現に対する遺伝子組換え時の変化を発現する。このように、Cre modRNAの発現を観察するために、100μgのCre modRNAをRosa26mTmG雄マウスおよび雌マウスの心筋ポストミのMIに直接注入し、動物を手術後24時間犠牲にした。心筋細胞マーカーcTNIおよび核マーカーDAPIによる免疫染色のために心臓を固定し、処理した(図3A)。正常なCre発現は、緑色の細胞(図3B)の出現により明らかであったが、これはマウスに送達されたCre modRNAとの再結合の結果であり、TdTomato色のCre注入部位の周囲のEGFPへの変化によって表される(図3C)。
図1:MODRNAのLADライゲーションおよび心拍送達。(A)LADライゲーションの面積と3つの部位のmodRNA注入を示す模式図。(B) マウス心臓全体の代表的な画像は、MIに続く永久結紮(a)およびモッRNA注射部位によって誘導されたMIを成功させた後述する。60μLのクエン酸スクロースバッファーに溶解したmodRNAの100μgを梗塞を取り囲む境界領域に送達し、結紮の両側に2つ(b、c)、頂点(d)に1つ。cスケールバー= 1 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:luc発現解析後modRNA注入100μgのLuc modRNAを含むクエン酸スクエン酸緩衝液を、開胸手術でCFWマウスの心筋に直接注入した。この生物発光イメージングシステムを用いて、注射後24時間でLucタンパク質発現を計算した。(A)対照マウスの比較生物発光画像(緩衝剤のみでトランスフェクト)対Luc modRNAを注射したマウス(B)生物発光イメージャーを用いて24時間後に測定した対照マウスと比較してLucシグナルの定量化。エラー バーは、P < 0.0001 の SEM を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生体内でのCre式の検証トランスフェクトされた心臓断面(短軸図)の代表的な画像は、24時間の注射後にRosa26mTmGマウスにおけるCre modRNAの発現を検証する。(A) cTNI(赤)で免疫染色された心筋細胞。(B)緑色の細胞は、Creトランスフェクトされた細胞を表す。(C) 2 回の注射の周りの Cre 活性化細胞を示すマージされた画像。青は核染色DAPIです。スケールバー= 1 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
遺伝子治療は、心疾患の治療を大幅に進める大きな可能性を示しています。しかし, HF の治療のための最初の臨床試験で採用されている従来のツールは限られた成功を示しており、重篤な副作用に関連付けられている.修飾RNAは、心臓における遺伝子導入ツールとして絶えず人気を集めている非ウイルス遺伝子の送達を提示する。ModRNAは翻訳のために遺伝子の核局在を必要としないため、タンパク質の効率的かつ迅速な発現を提供します。また、mRNAがゲノム宿主に統合されないほど、modRNAによる遺伝子送達は突然変異のリスクをスキップする。その結果、従来の遺伝子導入車に比して、modRNAは単一の遺伝子または遺伝子の組み合わせを心臓に送達する最も魅力的なプラットフォームの1つとなっています。しかし、現在までに、損傷後の心臓へのmodRNAの調製および伝達のための標準化されたプロトコルはない。したがって、ここでの目的は、遺伝子治療ツールとしてのmodRNAの使用を改善し、治療目的に適したものにするために、げっ歯類の心臓におけるmodRNAの心臓内送達のための標準および最適化されたプロトコルを確立することであった。
このプロトコルでは、モドRNAは、ウリジンをシュード尿小化物に置き換えることによって調製され、その後5'末端でARCAでキャッピングする。mRNAの二次構造におけるこれらの変化は、他の様々なヌクレオチド修飾8と比較して高いタンパク質翻訳をレンダリングすることが示されている。さらに、この変化したmRNA構造は、TOLL様受容体およびヌクレアーゼ6による認識を制限することによってマウスにおけるIM注射後の免疫原性を逃れる。ここでは、クエン酸スクロースバッファーを用いた裸のmRNA送達が、マウスMIモデルを用いて心臓で強力なタンパク質翻訳を生み出していることを示した。我々のこれまでの研究では、生体内フェクタミンやインビボjetPEIなどのナノ粒子におけるモッズRNAのカプセル化と比較して、心臓にスク糖クエン酸緩衝液を伴って送達されるmodRNAの優位性を確立し、タンパク質8へのmodRNA翻訳を妨げる可能性がある。一本鎖modRNA凝集を救出することに加えて、エンドサイトーシスのためにスクロースによって提供されるクエンチ酸塩および余分なエネルギーによるRNAの高い保存は、スク糖クエン酸塩緩衝液中に送達されたmodRNAの翻訳の著しい増加の理由となり得る。
modRNAの使用は過去10年の前臨床および臨床研究10、1414でエスカレートしているが、特定の領域は、診療所でのmodRNAの改善された成功のために調査される必要がある。まず、治療調査に必要な高量のmodRNAを合成することは、コストを高く抑えることができます。したがって、ヒトの臨床RNA療法段階に向けて現場を動かすためには、臨床グレードで費用対効果の高いmodRNAを開発することが不可欠です。第二に、modRNAに対する臨床的に適用可能な送達方法を同定する必要がある。心臓IM注射によって引き起こされる損傷を考慮すると、より侵襲性の低いカテーテルベースの送達方法は、大きな心臓をトランスフェクトするために必要な多量のmodRNAを移す上でよりもっともらしいかもしれません。
結論として、この研究は、マウス心臓ポストMIにおけるシュードリジン修飾を含むRNAの正常な送達を実証した。クエン酸スクロースバッファーでのmodRNAの送達は、注射の24時間後に強力なタンパク質発現をもたらした。このプロトコルは、研究者が心臓後損傷における標準化された送達およびタンパク質評価に従うことを可能にし、したがって、研究のためのmodRNAの調製および送達においてより多くのアクセシビリティを提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、アン・アヌ・クリアンがこの原稿を助けたであることを認めている。この研究は、ザンギ研究所に授与された心臓病のスタートアップ助成金とNIH助成金R01 HL142768-01によって資金提供されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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