Summary
Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.
Abstract
O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental. Na última década, a terapia genética tornou-se uma opção promissora de tratamento para doenças cardíacas, devido à sua eficiência e efeitos terapêuticos excepcionais. Em um esforço para reparar o tecido danificado pós-MI, vários estudos têm empregado terapia genética baseada em DNA ou viral, mas enfrentaram obstáculos consideráveis devido à expressão pobre e descontrolada dos genes entregues, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. O mRNA modificado sintético (modRNA) apresenta uma nova abordagem de terapia genética que oferece alta, transitória, segura, não imunomunogênica e entrega mRNA controlada ao tecido cardíaco sem qualquer risco de integração genômica. Devido a essas características notáveis combinadas com sua farmacocinética em forma de sino no coração, o modRNA tornou-se uma abordagem atraente para o tratamento de doenças cardíacas. No entanto, para aumentar sua eficácia in vivo, um método de entrega consistente e confiável precisa ser seguido. Assim, para maximizar a eficiência de entrega do modRNA e a consistência de rendimento no uso de modRNA para aplicações in vivo, é apresentado um método otimizado de preparação e entrega de injeção intracardiac modRNA em um modelo MI de mouse. Este protocolo tornará a entrega de modRNA mais acessível para pesquisas básicas e translacionais.
Introduction
A terapia genética é uma poderosa ferramenta que envolve a entrega de ácidos nucleicos para o tratamento, cura ou prevenção de doenças humanas. Apesar do progresso nas abordagens diagnósticas e terapêuticas para doenças cardíacas, houve sucesso limitado na entrega de genes no infarto do miocárdio (MI) e insuficiência cardíaca (HF). Por mais simples que o processo de terapia genética pareça, é uma abordagem marcadamente complexa considerando os muitos fatores que precisam ser otimizados antes de empregar um determinado veículo de entrega. O vetor de parto correto deve ser não-imunogênico, eficiente e estável dentro do corpo humano. Os esforços nesse campo geraram dois tipos de sistemas de entrega: viral ou não viral. Os sistemas virais amplamente utilizados, incluindo transferência de genes por adenovírus, retrovírus, lentivírus ou vírus associado ao adeno, mostraram uma capacidade de transdução excepcional. No entanto, seu uso em clínicas é limitado devido à forte resposta imune induzida1, risco de tumorigênese2, ou a presença de anticorpos neutralizantes3, todos os quais permanecem um grande obstáculo para a aplicação ampla e eficaz de vetores virais na terapia genética humana. Por outro lado, apesar de seu impressionante padrão de expressão, a entrega de DNA plasmídeo nu exibe uma baixa eficiência de transfecção, enquanto a transferência de mRNA apresenta alta imunogenicidade e suscetibilidade à degradação pelo RNase4.
Com a extensa pesquisa no campo do mRNA, o modRNA tornou-se uma ferramenta atraente para a entrega de genes ao coração e a vários outros órgãos devido às suas inúmeras vantagens sobre os vetores tradicionais5. A substituição completa do urido por pseudouridina de ocorrência natural resulta em expressão proteica mais robusta e transitória, com indução mínima de resposta imune inata e risco de integração genômica6. Protocolos recentemente estabelecidos utilizam uma quantidade otimizada de analógico de tampa antiverré (ARCA) que aumenta ainda mais a tradução proteica aumentando a estabilidade e transabilidade do mRNA7sintético .
Relatórios anteriores mostraram a expressão de vários genes repórteres ou funcionais entregues por modRNA no miocárdio roedor após MI. Com aplicações de modRNA, áreas significativas do miocárdio, incluindo tanto cardiomiócitos quanto nãocardiomiócitos, foram transfectadas com sucesso lesão pós-cardíaca8 para induzir angiogênese9,,10, sobrevivência de células cardíacas11e proliferação de cardiomiócitos12. Uma única administração de modRNA codificada para follistatina humana mutada 1 induz a proliferação de CMs adultos de camundongos e aumenta significativamente a função cardíaca, diminui o tamanho da cicatriz e aumenta a densidade capilar 4 semanas após o MI12. Um estudo mais recente relatou melhora da função cardíaca após o MI com a aplicação de modRNA VEGFA em um modelo de suíno10.
Assim, com o aumento da popularidade do modRNA no campo cardíaco, é essencial desenvolver e otimizar um protocolo para a entrega de modRNA ao coração pós-MI. Aqui é um protocolo que descreve a preparação e a entrega de modRNA purificado e otimizado em uma formulação citrato-salina biocompatível que fornece expressão proteica robusta e estável sem estimular qualquer resposta imune. O método mostrado neste protocolo e vídeo demonstra o procedimento cirúrgico padrão de um MI de camundongos por ligadura permanente da artéria descendente anterior esquerda (LAD), seguido por três injeções intracardiac de local de modRNA. O objetivo deste artigo é definir claramente um método altamente preciso e reprodutível de entrega de modRNA ao miocárdio murine para tornar a aplicação de modRNA amplamente acessível para terapia genética cardíaca.
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Protocol
Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no Comitê de Cuidados Institucionais e De Uso do Monte Sinai.
1. Síntese de modRNA
NOTA: Os detalhes da síntese modRNA podem ser encontrados em Kondrat et al.13.
- Peça os modelos plasmídeos(Tabela de Materiais)e gere um produto PCR limpo para usar como modelo mRNA.
- Prepare os modRNAs por transcrição in vitro com uma mistura de ribonucleosídeo personalizada do seguinte(Tabela de Materiais): Kit de transcrição T7, 6 mM anti-reverso analógico (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, Triphosfato de guanosina de 75 mM, triphosfato de adenosina de 75 mM, triptosfato de citidina de 75 mM, pseudouridina de 100 mM-5-triphosfato e enzima T7 DNase.
- Purifique o modRNA feito na etapa 1.2 com um kit de limpeza de transcrição(Tabela de Materiais) e trate com fosfattase antártica. Em seguida, reaproveque o modRNA com o kit de limpeza de transcrição e quantifique-o usando um espectrômetro.
- Precipitar o modRNA com etanol e acetato de amônio e resuspend em 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA.
- Concentre o modRNA para entrega in vivo por filtros centrífugos e meça a qualidade utilizando uma plataforma automatizada de eletroforese(Tabela de Materiais).
2. Preparação da injeção de modRNA para entrega in vivo
- Calcule o volume necessário para 100 μg de injeção de luciferase (Luc)/Cre modRNA com base na concentração de modRNA.
- Misture o volume calculado de modRNA com partes iguais da solução de sacarose preparada em água livre de nuclease (0,3 g/mL) e solução de citrato de 0,1 M (pH = 7) (20 μL cada recomendado).
- Leve o volume final da injeção para 60 μL adicionando solução salina.
3. Cirurgia de infarto do miocárdio
- Anestesia e preparação do animal
NOTA: Este estudo utiliza camundongos CFW masculinos e femininos de 8 a 12 semanas de idade.- Anestesiar o rato com 2% de isoflurane usando uma câmara de indução e colocar o animal de costas em uma posição dorsal com uma máscara facial sobre o nariz e a boca para manter a anestesia. Mantenha a anestesia por ventilação mecânica usando um respirador equipado com um tubo de 7-8 mm das vias aéreas e um filtro.
- Para imobilizar o rato na plataforma de cirurgia, proteja seus membros com fita cirúrgica. raspar a área do pescoço e o lado esquerdo da caixa torácica e desinfetar usando 70% de etanol e iodo povidone. Repita o passo de desinfetante duas vezes. Verifique seus reflexos, beliscando a cauda e os pés traseiros para avaliar a profundidade da anestesia.
- Monitore e mantenha continuamente a temperatura do núcleo do corpo na normotermia (37,5-38 °C).
- Mantenha uma via aérea aberta realizando intubação intratraqueal. Para isso, coloque o rato em uma posição ventral com a boca voltada para o experimentador e puxe suavemente a língua. Ajuste o ângulo do pescoço e endireitar o caminho da intubação e empurre na cânula de intubação.
- Caso o animal não consiga respirar através dele, a traqueostomia pode ser realizada. Realize uma incisão cervical ao longo da linha média isolando a pele, músculo e tecido delineando a traqueia usando um microscópio. Quando a traqueia estiver claramente visível, insira o tubo endotraqueal no tecido entre dois anéis de cartucho abaixo do glottis fazendo um pequeno furo e segurando a parte craniana da traqueia usando fórceps microcirúrgicos.
- Observe o movimento torácico do camundongo para verificar se ambos os pulmões estão recebendo oxigênio. A taxa respiratória (RR) deve ser de aproximadamente 120 respirações por minuto, com uma pressão inspiratória de 17-18 cm H2O.
- Ligação da artéria descendente anterior (LAD) esquerda
- Para realizar a ligadura LAD, gire o mouse cuidadosamente para que ele esteja deitado no lado direito. Levante a pele e realize uma toracotomia lateral esquerda entre a 3ª e a 4ª costela e dissecar o tecido e o músculo cuidadosamente. Use um cautery para evitar sangramento.
- Abra o tórax cuidadosamente e uma vez aberto, encontre o coração, sem tocar no pulmão com qualquer objeto afiado. Coloque os retratores na incisão para manter a cavidade torácica aberta e ter uma visão clara do coração. Agora mova os pulmões para a borda da incisão e remova a parte do saco pericárdico que está cobrindo o coração para acessar a superfície anterior do coração.
- Identifique cuidadosamente o LAD, que pode ser visto como um vaso vermelho de luz profunda localizado entre a artéria pulmonar e a aurícula esquerda. Ligate o LAD proximal com uma única sutura de uma sutura de seda 7-0. Coloque um tubo torácico (28 G, cateter venal), entre a 4ª e a 5ª costela.
- Feche a incisão torácica em camadas. Use as suturas de seda 6-0 para adaptar as costelas e use suturas de seda 5-0 para fechar a pele. Certifique-se de deixar uma janela adequada para futura medição ecocardiográfica.
- Escorra cuidadosamente o tórax com solução isotônica quente (9 g de cloreto de sódio em 1 L de água) usando uma seringa de 2 mL. Coloque o rato de costas. Se realizar a traqueostomia, tire o tubo endotraqueal e use suturas de seda 7-0, adapte os anéis do cartucho traqueal com um único ponto. Coloque a máscara facial no mouse e feche a pele usando suturas de seda 5-0.
- Para a fase de recuperação, desconecte a cânula de intubação do ventilador e permita a respiração espontânea. Coloque o animal sob uma lâmpada de calor até atingir a consciência. Não deixe o animal sozinho após a cirurgia até que esteja totalmente acordado.
- Gerencie a terapia da dor com buprenofina a 0,1 mg/kg de peso corporal, injetada subcutânea pelos próximos 3 dias em intervalos de 12h.
4. Parto cardíaco de modRNA
- Entregue um total de 60 μL do modRNA preparado na etapa 2.3 intramuscularmente (IM) usando uma seringa de insulina (31 G) seguindo um MI.
- Injete 20 μL do modRNA em três locais diferentes do músculo cardíaco ao redor da área de infarto (dois em ambos os lados da ligadura e um no ápice). Faça as injeções imediatamente após o LAD, antes de fechar o peito.
NOTA: Imagens representativas de locais de injeção de modRNA podem ser vistas na Figura 1.
- Injete 20 μL do modRNA em três locais diferentes do músculo cardíaco ao redor da área de infarto (dois em ambos os lados da ligadura e um no ápice). Faça as injeções imediatamente após o LAD, antes de fechar o peito.
5. Validação da expressão proteica no coração pós MI
- Expressão de modRNA de luciferase usando um sistema de imagem de bioluminescência
NOTA: Um total de 100 μg de Luc mRNA preparado em 60 μL do tampão citrato de sacarose é diretamente injetado no coração dos camundongos CFW após o MI.- A 24 h pós MI e injeção de modRNA, anestesia os camundongos com 2% de isoflurane usando uma câmara de indução e injeção intraperitoneal de luciferina (150 mg/g de peso corporal) para validar o sinal Luc in vivo.
- Imagem dos ratos usando um sistema de imagem de bioluminescência a cada 2 minutos até que o sinal luc atinja a saturação.
- Quantifique os dados de imagem coletados com o software de análise de imagens. Use os camundongos injetados com soro fisiológico apenas como uma leitura de linha de base para a expressão de Luc e subtraia o sinal de fundo coletado dos camundongos injetados por soro fisiológico.
NOTA: O sinal de Luc é expresso em p/s/cm2/sr x 106.
- Imunostaining para validação de transfecção de Cre
- Para validar a transfecção com Cre, sacrifique os animais 24h após a injeção usando uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina seguida de luxação cervical. Antes de fazer uma incisão, desinfete o peito e o abdômen usando um cotonete de álcool de 70%.
- Abra a cavidade torácica fazendo uma incisão transversal ~1 cm mais baixa que o esterno e mova a tesoura em direção à cabeça, cortando a caixa torácica.
- Abra o peito e injete 1 mL de PBS estéril na câmara ventricular direita para remover o excesso de sangue. Extirja o coração imediatamente e coloque-o no PBS estéril para lavar o sangue restante.
- Fixar o coração em 4% de paraformaldeído (PFA) por 24 h, seguido de incubação durante a noite em solução de sacarose de 30% a 4 °C. No dia seguinte, incorpore os corações em meio de temperatura de corte ideal e selá-los a uma espessura de 10 μm usando um criostat.
- Manche as seções com anticorpos primários contra troponina cardíaca I (cTNI) e rotule-as com um anticorpo secundário fluorescente. Para identificar o núcleo, colora com 4',6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) por 5 min. Imagem os slides usando um microscópio fluorescente.
6. Análise estatística
- Plote um gráfico de barras com base na expressão luc em camundongos salinos e injetados por Luc e informe os valores como média ± SEM. Compare os dois grupos usando um teste t não pago (***p < 0,0001).
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Representative Results
Camundongos de oito a dez semanas foram anestesiados com isoflurano e entubados. Após o animal estar sob anestesia, a região torácica esquerda foi raspada e esterilizada com etanol, e o coração foi exposto para ligadura LAD. A artéria coronária esquerda foi ocluída por amarrar firmemente a sutura sob a artéria (representação diagrama Figura 1A). Após um infarto bem sucedido (indicado pela paling da parede livre ventricular esquerda), uma injeção direta de 100 μg de Luc ou Cre modRNA dissolvida em tampão citrato de sacarose foi entregue diretamente no miocárdio em três locais diferentes(Figura 1B) em torno da área de lesão usando uma seringa de insulina. O procedimento MI com injeções de modRNA durou de 30-45 min por animal. Os animais apresentaram aproximadamente 90% de taxa de sobrevivência pós-procedimento. Após o procedimento, o peito e a pele foram firmemente suturados em camadas e o animal foi removido da ventilação assim que começou a respirar normalmente.
Após a realização da ligadura LAD e posterior entrega da injeção de Luc modRNA, validamos a transfecção do modRNA de Luc verificando a expressão da proteína Luc 24 h após a injeção usando um sistema de imagem de bioluminescência(Figura 2A). Estabelecemos em publicações anteriores que, embora a expressão proteica possa ser vista até o dia 6 pós-transfecção, a maior eficiência de transfecção do modRNA é observada às 24h8. Da mesma forma, detectamos com sucesso o sinal de Luc no coração tratado com injeção de Luc modRNA (1,76 x 108) em comparação com os camundongos injetados com tampão citrato de sacarose após MI (3.0 x 105)(Figura 2B).
Além disso, buscamos validar a expressão modRNA verificando sua tradução e biodistribução em um mouse Rosa26mTmG transgênico. Este sistema de modelo de camundongo expressa a expressão de fluorescência tdTomato (mT) localizada na membrana celular em todas as células/tecidos do corpo e altera a expressão de fluorescência EGFP (mG) localizada na membrana celular após a recombinação de Cre. Assim, para observar a expressão do modRNA Cre, 100 μg Cre modRNA foi injetado diretamente no miocárdio pós-MI em camundongos machos e fêmeas Rosa26mTmG, e os animais foram sacrificados 24 horas após a cirurgia. Os corações foram fixados e processados para imunostendamento com marcador cardiomiócito cTNI e marcador nuclear DAPI(Figura 3A). A expressão cre bem sucedida ficou evidente devido ao aparecimento de células de cor verde(Figura 3B),que foram resultado da recombinação com o modRNA Cre entregue ao mouse, representado pela mudança da cor tdTomato para EGFP em torno do local de injeção de Cre(Figura 3C).
Figura 1: Ligadura LAD e parto cardíaco de modRNA. (A) Diagrama esquemático mostrando a área de ligadura LAD e três locais de injeção de modRNA. (B) Imagens representativas de todo o coração do mouse postam um MI bem sucedido induzido por ligadura permanente (a) e locais de injeção de modRNA após o MI. O 100 μg de modRNA dissolvido em 60 μL de tampão citrato de sacarose foi entregue na área da zona de fronteira em torno do infarto, dois em ambos os lados da ligadura (b,c) e um no ápice(d). Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de expressão de Luc pós-injeção de modRNA. O tampão citrato de sacarose contendo 100 μg de Luc modRNA foi injetado diretamente no miocárdio de camundongos CFW em uma cirurgia de peito aberto. O sistema de imagem de bioluminescência foi usado para calcular a expressão proteica luc em 24 horas após a injeção. (A) Imagens bioluminescentes comparativas de ratos de controle (transfectados apenas com buffer) vs. ratos injetados com luc modRNA. (B) Quantificação do sinal de Luc em comparação com os camundongos de controle medidos após 24 horas usando imager bioluminescência. A barra de erro representa a SEM com p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação da expressão Cre in vivo. Imagens representativas de seções transfeinadas de transfesol (visão de eixo curto) validando a expressão de Cre modRNA no mouse Rosa26mTmG 24 horas de postinjeção. (A) Os cardiomiócitos imunossuados com cTNI (vermelho). (B) As células de cor verde representam as células transfetadas cre. (C) Imagem mesclada mostrando células ativadas cre em torno das duas injeções. Azul é a mancha nuclear DAPI. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A terapia genética tem mostrado um enorme potencial para avançar significativamente no tratamento de doenças cardíacas. No entanto, as ferramentas tradicionais empregadas nos ensaios clínicos iniciais para o tratamento de HF têm mostrado sucesso limitado e estão associadas a efeitos colaterais graves. O RNA modificado apresenta uma entrega genética não-viral que está continuamente ganhando popularidade como uma ferramenta de transferência genética no coração. ModRNA não requer localização nuclear de genes para tradução, e assim oferece uma expressão eficiente e rápida da proteína. Além disso, como o mRNA não se integra ao hospedeiro do genoma, a entrega de genes pelo modRNA ignora o risco de mutagênese. Consequentemente, devido às suas vantagens em relação aos veículos convencionais de entrega de genes, o modRNA tornou-se uma das plataformas mais atraentes para a entrega de combinações de genes ou genes únicos ao coração. No entanto, até o momento não há um protocolo padronizado para a preparação e transferência do modRNA para o pós-lesão cardíaca. Assim, o objetivo aqui foi estabelecer um protocolo padrão e otimizado para a entrega intracardiac de modRNA no coração de roedores para melhorar o uso do modRNA como ferramenta de terapia genética e torná-lo adequado para fins terapêuticos.
Neste protocolo, o modRNA é preparado substituindo uridina por pseudouridina, seguido de capping com ARCA no final de 5'. Essas mudanças na estrutura secundária do mRNA têm sido demonstradas para tornar a tradução mais alta da proteína em comparação com várias outras modificações de nucleotídeos8. Além disso, essa estrutura alterada de mRNA escapa da imunogenicidade após injeções de IM em camundongos, limitando seu reconhecimento por receptores e núcleos semelhantes a pedágio6. Aqui, mostramos que a entrega de mRNA nu com tampão citrato de sacarose produz forte tradução de proteína no coração usando um modelo MI de rato. Em nossos estudos anteriores, estabelecemos a superioridade do modRNA entregue com tampão citrato de sacarose no coração em comparação com o encapsulamento de modRNA em nanopartículas, como in vivo fectamine ou in vivo jetPEI, o que pode dificultar a tradução modRNA em proteína8. A alta preservação do RNA por citrato e energia extra fornecida pela sacarose para endocitose, além de resgatar o motomamento de modRNA de uma única cadeia pode ser a razão para o aumento acentuado na tradução do modRNA entregue no tampão citrato de sacarose.
Embora o uso de modRNA tenha aumentado em estudos pré-clínicos e clínicos10,14 na última década, certas áreas precisam ser investigadas para melhor sucesso do modRNA na clínica. Em primeiro lugar, sintetizar o modRNA nas altas quantidades necessárias para investigações terapêuticas pode ser proibitivo de custos. Assim, é essencial desenvolver modRNA de grau clínico e econômico para mover o campo para uma fase clínica de terapia de RNA em humanos. Em segundo lugar, é necessário identificar um método de entrega clinicamente aplicável para modRNA. Considerando os danos causados pelas injeções de IM cardíaco, métodos de entrega menos invasivos baseados em cateter podem ser mais plausíveis na transferência da grande quantidade de modRNA necessária para transfetar grandes corações.
Em conclusão, este trabalho demonstrou a entrega bem sucedida de RNA contendo modificações pseudouridinas no post do coração do mouse MI. A entrega de modRNA no tampão citrato de sacarose rendeu uma forte expressão proteica 24 horas após a injeção. Este protocolo permite que os pesquisadores acompanhem uma avaliação padronizada de parto e proteína no pós-lesão cardíaca e, assim, forneçam mais acessibilidade na preparação e entrega de modRNA para sua pesquisa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Ann Anu Kurian por sua ajuda com este manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de iniciação em cardiologia concedida ao laboratório Zangi e também pela concessão do NIH R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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