Summary
Detta protokoll presenterar ett enkelt och sammanhängande sätt att övergående upregulate en gen av intresse med modRNA efter hjärtinfarkt hos möss.
Abstract
Hjärtinfarkt (MI) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i västvärlden. Under det senaste årtiondet har genterapi blivit ett lovande behandlingsalternativ för hjärtsjukdomar, på grund av dess effektivitet och exceptionella terapeutiska effekter. I ett försök att reparera den skadade vävnaden efter MI, olika studier har använt DNA-baserade eller viral genterapi men har ställts inför betydande hinder på grund av de fattiga och okontrollerade uttryck av de levererade gener, ödem, arytmi och hjärt hypertrofi. Syntetisk modifierad mRNA (modRNA) presenterar en ny genterapi metod som erbjuder hög, övergående, säker, nonimmunogenic, och kontrollerad mRNA leverans till hjärtvävnaden utan risk för genomisk integration. På grund av dessa anmärkningsvärda egenskaper i kombination med dess klockformade farmakokinetik i hjärtat, modRNA har blivit en attraktiv metod för behandling av hjärtsjukdomar. För att öka dess effektivitet in vivo måste dock en konsekvent och tillförlitlig leveransmetod följas. Därför, för att maximera modRNA leverans effektivitet och avkastning konsekvens i modRNA användning för in vivo applikationer, en optimerad metod för beredning och leverans av modRNA intracardiac injektion i en mus MI modell presenteras. Detta protokoll kommer att göra modRNA-leverans mer tillgänglig för grundläggande och translationell forskning.
Introduction
Genterapi är ett kraftfullt verktyg som innebär leverans av nukleinsyror för behandling, botemedel eller förebyggande av mänskliga sjukdomar. Trots framstegen i diagnostiska och terapeutiska metoder för hjärtsjukdomar, det har varit begränsad framgång i leveransen av gener i hjärtinfarkt (MI) och hjärtsvikt (HF). Så enkelt som processen för genterapi verkar, är det ett markant komplext tillvägagångssätt med tanke på de många faktorer som måste optimeras innan du använder ett visst leveransfordon. Rätt leveransvektor bör vara icke-immunogen, effektiv och stabil inuti människokroppen. Insatser på detta område har genererat två typer av leveranssystem: viral eller icke-viral. De allmänt använda virussystemen, inklusive genöverföring av adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-associerade virus, har visat exceptionell transduktionskapacitet. Emellertid, deras användning på kliniker är begränsad på grund av det starka immunsvaret inducerad1, risk för tumorigenesis2, eller förekomsten av neutraliserande antikroppar3, som alla förblir ett stort hinder för bred och effektiv tillämpning av viral vektorer i mänskliga genterapi. Å andra sidan, trots deras imponerande uttryck mönster, leverans av nakna plasmid DNA visar en låg transfection effektivitet, medan mRNA överföring presenterar hög immunogenicitet och känslighet för nedbrytning av RNase4.
Med den omfattande forskningen inom mRNA har modRNA blivit ett attraktivt verktyg för leverans av gener till hjärtat och olika andra organ på grund av dess många fördelar jämfört med traditionella vektorer5. Fullständig ersättning av uridin med naturligt förekommande pseudouridin resulterar i mer robust och övergående proteinuttryck, med minimal induktion av medfödd immunsvar och risk för genomisk integration6. Nyligen etablerade protokoll använder en optimerad mängd anti-reverse cap analog (ARCA) som ytterligare förbättrar proteinöversättningen genom att öka stabiliteten och transabilityen hos den syntetiska mRNA7.
Tidigare rapporter har visat uttryck för olika reporter eller funktionella gener levereras av modRNA i gnagare hjärtmuskeln efter MI. Med modRNA applikationer, betydande områden av hjärtmuskeln, inklusive både kardiomyocyter och noncardiomyocytes, har framgångsrikt transfected post-hjärt skada8 att inducera angiogenes9,10, hjärtcell överlevnad11, och kardiomyocyte spridning12. En enda administrering av modRNA kodade för muterade mänskliga follistatin-liknande 1 inducerar spridningen av mus vuxna CMs och avsevärt ökar hjärtfunktion, minskar ärr storlek, och ökar kapillärdensitet 4 veckor efter MI12. En nyare studie rapporterade förbättrad hjärtfunktion efter MI med tillämpning av VEGFA modRNA i en svin modell10.
Således, med den ökade populariteten av modRNA i hjärtfältet, är det viktigt att utveckla och optimera ett protokoll för leverans av modRNA till hjärtat post-MI. Herein är ett protokoll som beskriver beredning och leverans av renad och optimerad modRNA i en biokompatibel citrat-saltlösning formulering som ger robust, stabilt protein uttryck utan att stimulera något immunsvar. Den metod som visas i detta protokoll och video visar standard kirurgiska ingrepp av en mus MI av permanent ligering av den vänstra främre fallande gatan (LAD), följt av tre plats intracardiac injektioner av modRNA. Syftet med detta dokument är att tydligt definiera en mycket exakt och reproducerbar metod för modRNA leverans till murine hjärtmuskeln för att göra modRNA ansökan allmänt tillgänglig för hjärt genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här har godkänts av Icahn School of Medicine på Mount Sinai Institutionsvård och användning kommittén.
1. Syntes av modRNA
OBS: Detaljerna i modRNA syntes finns i Kondrat et al.13.
- Beställ plasmidmallarna (Tabell över material) och generera en ren PCR-produkt som ska användas som mRNA-mall.
- Förbered modRNAs genom transkription in vitro med en anpassad ribonucleoside blandning av följande (Tabell över material):T7 transkriptionssats, 6 mM anti-reverse cap analog (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosin triphosphate, 75 mM adenosin triphosphate, 75 mM cytidin triphosphate, 100 mM pseudouridin-5-triphosphate och T7 DNase enzym.
- Rena modRNA som gjorts i steg 1.2 med en transkriptionsrensningssats (Tabell över material) och behandla med antarktisk fosfatas. Därefter återanvända modRNA med transkriptionsrensningssatsen och kvantifiera det med hjälp av en spektrofotometer.
- Fäll ut modRNA med etanol och ammoniumacetat och resuspend i 10 mM Tris-HCl och 1 mM EDTA.
- Koncentrera modRNA för in vivo-leverans med centrifugalfilter och mät kvaliteten med hjälp av en automatiserad elektroforesplattform (Tabell över material).
2. Beredning av modRNA-injektion för in vivo-leverans
- Beräkna den volym som behövs för 100 μg luciferas (Luc)/Cre modRNA-injektion baserat på modRNA-koncentrationen.
- Blanda den beräknade volymen modRNA med lika delar sackaroslösning beredd i nukleasfritt vatten (0,3 g/ml) och 0,1 M citratlösning (pH = 7) (20 μL vardera rekommenderas).
- Ta injektionens slutliga volym till 60 μL genom att tillsätta saltlösning.
3. Hjärtinfarkt
- Anestesi och förberedelse av djuret
OBS: Denna studie använder manliga och kvinnliga CFW möss 8−12 veckor gammal.- Söva musen med 2% isofluran med hjälp av en induktionskammare och placera djuret på rygg i rygg i rygg i rygg i ryggläge med en ansiktsmask över näsan och munnen för att hålla upp anestesi. Håll anestesi genom mekanisk ventilation med hjälp av andningsskydd utrustad med ett 7−8 mm luftvägsrör och ett filter.
- För att immobilisera musen på operationsplattformen, säkra sina lemmar med kirurgisk tejp. raka halsen och vänster sida av bröstkorgen och desinficera med 70% etanol och povidone jod. Upprepa desinficerande steg två gånger. Kontrollera dess reflexer, nypa svansen och bakfötterna för att bedöma djupet av anestesi.
- Övervaka och underhåll kontinuerligt kärnkroppstemperaturen vid normoterm (37,5−38 °C).
- Upprätthålla en öppen luftväg genom att utföra intratracheal intubation. För att göra detta, placera musen i en ventral position med munnen vänd mot experimentören och försiktigt dra ut tungan. Justera vinkeln på halsen och räta intubationen och tryck in intubationskanylen.
- Om djuret inte kan andas genom det, kan trakeostomi utföras. Utför en cervikal snitt längs mittlinjen isolera huden, muskler, och vävnad beskriver luftstrupen med hjälp av ett mikroskop. När luftstrupen är tydligt synlig, sätt in endotrakealröret i vävnaden mellan två patronringar under glottis genom att göra ett litet hål och hålla kranialdelen av luftstrupen med hjälp av mikrokirurgiska pincett.
- Observera thoraxrörelsen hos musen för att kontrollera att båda lungorna tar emot syre. Andningsfrekvensen (RR) bör vara cirka 120 andetag per minut, med ett inandningstryck på 17−18 cm H2O.
- Vänster främre fallande (LAD) artär ligatur
- För att utföra LAD-ligering, vrid musen försiktigt så att den ligger på höger sida. Lyft huden och utför en vänstersidig thoracotomy mellan den 3: e och 4: e revbenet och dissekera vävnad och muskler noggrant. Använd en cautery för att förhindra blödning.
- Öppna bröstkorgen försiktigt och när den är öppen, hitta hjärtat, utan att röra lungan med något vasst föremål. Placera upprullningsdonen i snittet för att hålla brösthålan öppen och ha en klar bild av hjärtat. Nu flytta lungorna till kanten av snittet och ta bort den del av perikardvätska säcken som täcker hjärtat för att komma åt den främre ytan av hjärtat.
- Identifiera laden noggrant, som kan ses som ett djupt ljusrött kärl som ligger mellan lungartären och den vänstra öronen. Ligate LAD proximala med en enda suture av en 7-0 siden sutur. Placera ett bröströr (28 G, venkateter), mellan den 4: e och 5: e revbenet.
- Stäng bröstsnittet i lager. Använd 6-0 siden löpande suturer för att anpassa revbenen och använda 5-0 siden kör suturer för att stänga huden. Se till att lämna ett lämpligt fönster för framtida ekokardiografisk mätning.
- Töm försiktigt bröstkorgen med varm isotonisk lösning (9 g natriumklorid i 1 L vatten) med en 2 ml spruta. Placera musen på ryggen. Om du utför trakeostomi, ta endotrakeal röret ut och använda 7-0 silke suturer anpassa trakeal patron ringar med en enda söm. Placera ansiktsmasken på musen och stäng huden med 5-0 siden rinnande suturer.
- För återhämtningsfasen, koppla bort intubationskanylen från ventilatorn och låt spontan andning. Placera djuret under en värmelampa tills det uppnår medvetande. Lämna inte djuret utan uppsikt efter operationen förrän det är helt vaken.
- Hantera smärtbehandling med buprenophine med 0,1 mg/kg kroppsvikt, injiceras subkutant under de kommande 3 dagarna med 12 h intervaller.
4. Hjärtleverans av modRNA
- Leverera totalt 60 μL av modRNA som beretts i steg 2.3 intramuskulärt (IM) med hjälp av en insulinspruta (31 G) efter en hjärtinfarkt.
- Injicera 20 μL av modRNA på tre olika platser i hjärtmuskeln som omger infarktområdet (två på vardera sidan av ligering och en i spetsen). Utför injektionerna omedelbart efter LAD: n innan du stänger bröstet.
OBS: Representativa bilder av modRNA injektionsställen kan ses i figur 1.
- Injicera 20 μL av modRNA på tre olika platser i hjärtmuskeln som omger infarktområdet (två på vardera sidan av ligering och en i spetsen). Utför injektionerna omedelbart efter LAD: n innan du stänger bröstet.
5. Protein uttryck validering i hjärtat post MI
- Luciferas modRNA-uttryck med hjälp av ett bioluminescensbildssystem
OBS: Totalt 100 μg Luc mRNA som beretts i 60 μL av sackaroscitratbufferten injiceras direkt i hjärtat av CFW-möss efter felindikatorn.- Vid 24 h post MI och modRNA injektion, söva möss med 2% isofluran med hjälp av en induktionskammare och intraperitoneally injicera luciferin (150 mg/g kroppsvikt) för att validera Luc signalen in vivo.
- Bild mössen med hjälp av en bioluminescens bildsystem var 2 min tills Luc signalen når mättnad.
- Kvantifiera insamlade bilddata med bildanalysprogramvara. Använd mössen som injiceras med saltlösning endast som en baslinjeavläsning för Luc-uttrycket och subtrahera bakgrundssignalen som samlats in från de saltinförda mössen.
OBS: Luc-signalen uttrycks i p/s/cm2/sr x 106.
- Immunbehållning för Cre transfection validering
- För att validera transfection med Cre, offra djuren 24 h postinjection med hjälp av en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin följt av livmoderhalscancer störning. Innan du gör ett snitt, desinficera bröstet och buken med hjälp av en 70% alkoholkompress.
- Öppna brösthålan genom att göra ett tvärgående snitt ~1 cm lägre än bröstbenet och flytta saxen mot huvudet och skär genom bröstkorgen.
- Öppna bröstet och injicera 1 ml steril PBS i den högra ventrikulära kammaren för att avlägsna överflödigt blod. Punktskattepliktiga hjärtat omedelbart och placera det i den sterila PBS att tvätta bort det återstående blodet.
- Fixera hjärtat i 4% paraformaldehyd (PFA) för 24 timmar, följt av inkubation över natten i 30% sackaroslösning vid 4 °C. Följande dag bädda in hjärtan i optimal skärning temperatur medium och avsnitt dem med en tjocklek av 10 μm med hjälp av en cryostat.
- Färga sektionerna med primär antikropp mot hjärttroponin I (cTNI) och märk dem med en fluorescerande sekundär antikropp. För att identifiera kärnan, fläck med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 5 min. Bild bilderna med hjälp av ett fluorescerande mikroskop.
6. Statistisk analys
- Rita ett stapeldiagram baserat på Luc-uttrycket i saltlösning och Luc-injicerade möss och rapportera värdena som medelvärde ± SEM. Jämför de två grupperna med hjälp av ett opartat t-test (****p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Åtta till tio veckor gamla möss var sövda med isofluran och intubated. Efter djuret var under anestesi, var den vänstra bröst regionen rakade och steriliserade med etanol, och hjärtat exponerades för LAD ligering. Den vänstra kranskärlen var ockluderas genom att fast knyta suturen under artären (diagram representation Figur 1A). Efter en lyckad hjärtinfarkt (indikerad av paling av den vänstra ventrikulära fria väggen), en direkt injektion av 100 μg Luc eller Cre modRNA upplöstes i sackaroscitrat buffert levererades direkt i hjärtmuskeln på tre olika platser (figur 1B) som omger skadeområdet med hjälp av en insulinspruta. MI-tillvägagångssättet med modRNA injektioner varade för 30−45 minuter per djur. Djuren visade cirka 90% överlevnad efterförfarandet. Efter ingreppet var bröstet och huden ordentligt suturerade i lager och djuret togs bort från ventilationen så snart det började andas normalt.
Efter att ha utfört LAD-ligering och efterföljande leverans av Luc modRNA-injektion validerade vi Luc modRNA-transfection genom att kontrollera Luc-proteinuttryck 24 h postinjection med hjälp av ett biolumineescence imaging system (Figur 2A). Vi etablerade i tidigare publikationer att även om proteinuttrycket kan ses fram till dag 6 posttransfection, den högsta transfection effektivitet modRNA observeras vid 24 h8. På samma sätt har vi framgångsrikt upptäckt Luc-signalen i hjärtat som behandlades med Luc modRNA-injektion (1,76 x 108) jämfört med de möss som injicerats med sackaroscitratbuffert efter MI (3,0 x 105) (figur 2B).
Vidare försökte vi validera modRNA uttryck genom att kontrollera dess översättning och biodistribution i en transgen Rosa26mTmG mus. Denna mus modell system uttrycker cellmembran-lokaliserade tdTomato (mT) fluorescens uttryck i alla kroppsceller / vävnader och förändringar i cellmembran-lokaliserade EGFP (mG) fluorescens uttryck på Cre rekombination. Således, för att observera uttrycket av Cre modRNA, 100 μg Cre modRNA injicerades direkt i hjärtmuskeln post-MI i Rosa26mTmG hane och kvinnliga möss, och djuren offrades 24 h postsurgery. Hjärter fixerades och bearbetades för immunfärgning med kardiomyocytmarkör cTNI och nukleär markör DAPI (figur 3A). Framgångsrika Cre uttryck var uppenbart på grund av uppkomsten av gröna färgade celler (Figur 3B), som var ett resultat av rekombination med Cre modRNA levereras till musen, representeras av förändringen av tdTomato färg till EGFP runt Cre injektionsstället (Figur 3C).
Figur 1: LAD ligering och hjärt leverans av modRNA. (A)Schematiskt diagram som visar området LAD-ligering och tre ställen modRNA-injektion. (B)Representativa bilder av hela mushjärtat postar en framgångsrik hjärtinfarkt som framkallas av permanent ligering(a)och ställen med modRNA-injektion efter felindikatorn. Den 100 μg modRNA som löstes upp i 60 μL sackaroscitratbuffert levererades i gränsområdet kring infarkten, två på vardera sidan av ligeringen (b,c) och en i spetsen (d). Skala bar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Luc uttryck analys efter modRNA injektion. Sackaros citrat buffert som innehåller 100 μg Luc modRNA injicerades direkt i hjärtmuskeln av CFW möss i en öppen bröst kirurgi. Bioluminescens bildsystemet användes för att beräkna Luc protein uttryck vid 24 timmar efter injektion. (A)Jämförande bioluminescerande bilder av kontrollmöss (endast infekterade med buffert) jämfört med möss som injiceras med Luc modRNA. (B)Kvantifiering av Luc-signal jämfört med kontrollmöss mätt efter 24 timmar med bioluminescensbildare. Felfältet representerar SEM med p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Validering av Cre-uttryck in vivo. Representativa bilder av transfected hjärta tvärsnitt (kort axel vy) validera uttrycket av Cre modRNA i Rosa26mTmG mus 24 timmar postinjection. (A)Kardiomyocyterna immunfläckade med cTNI (röd). (B) Grön färgade celler representerar Cre transfected celler. (C)Sammanslagen bild som visar Cre-aktiverade celler runt de två injektionerna. Blå är den nukleära fläcken DAPI. Skala bar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genterapi har visat en enorm potential att avsevärt främja behandling av hjärtsjukdom. Emellertid, traditionella verktyg som används i de inledande kliniska prövningarna för behandling av HF har visat begränsad framgång och är associerade med allvarliga biverkningar. Modifierad RNA presenterar en icke-viral genleverans som ständigt ökar i popularitet som ett genöverföringsverktyg i hjärtat. ModRNA kräver ingen kärnlokalisering av gener för översättning, och erbjuder därmed ett effektivt och snabbt uttryck för proteinet. Vidare, eftersom mRNA inte integreras i genomvärden, hoppar genleverans av modRNA risken för mutagenesis. På grund av dess fördelar jämfört med konventionella genleveransfordon har modRNA därför blivit en av de mest attraktiva plattformarna för leverans av en- eller genkombinationer till hjärtat. Hittills finns det dock inget standardiserat protokoll för beredning och överföring av modRNA i hjärtat postinjury. Syftet här var således att upprätta ett standard- och optimerat protokoll för intracardiac leverans av modRNA i gnagare hjärta för att förbättra användningen av modRNA som ett genterapiverktyg och att göra det lämpligt för terapeutiska ändamål.
I detta protokoll, modRNA är beredd genom att ersätta uridin med pseudouridin, följt av tak med ARCA i 5'. Dessa förändringar i den sekundära strukturen hos mRNA har visat sig göra högre proteinöversättning jämfört med olika andra nukleotidmodifieringar8. Dessutom undgår denna förändrade mRNA-struktur immunogeniciteten efter IM-injektioner hos möss genom att begränsa dess erkännande av avgiftsliknande receptorer och nukleaser6. Här visade vi att naken mRNA leverans med sackaros citrat buffert producerar stark protein översättning i hjärtat med hjälp av en mus MI modell. I våra tidigare studier fastställde vi överlägsenheten hos modRNA levereras med sackaros citrat buffert i hjärtat i jämförelse med inkapsling av modulerRNA i nanopartiklar, såsom in vivo hungersnöd eller in vivo jetPEI, vilket kan hindra modRNA översättning till protein8. Det höga bevarandet av RNA genom citrat och extra energi från sackaros för endocytos utöver att rädda den enkelsträngade modRNA klumpar kan vara orsaken till den markanta ökningen av översättning av modRNA levereras i sackaros citrat buffert.
Även om användningen av modRNA har eskalerat i prekliniska och kliniska studier10,14 under det senaste decenniet, vissa områden måste undersökas för förbättrad framgång modRNA på kliniken. För det första kan syntetisera modRNA i de stora mängder som krävs för terapeutiska undersökningar vara kostnadsöverkomliga. Därför är det viktigt att utveckla klinisk kvalitet och kostnadseffektiv modRNA att flytta fältet mot en klinisk RNA terapi fas hos människor. För det andra måste en kliniskt tillämplig leveransmetod för modRNA identifieras. Med tanke på de skador som orsakas av hjärt IM injektioner, mindre invasivkateter-baserade leveransmetoder kan vara mer troligt att överföra den stora mängden modRNA som krävs för att transfect stora hjärtan.
Sammanfattningsvis visade detta arbete framgångsrik leverans av RNA som innehåller pseudouridin ändringar i musen hjärtat post MI. Leveransen av modRNA i sackaroscitrat buffert gav ett starkt protein uttryck 24 timmar efter injektionen. Detta protokoll gör det möjligt för forskarna att följa en standardiserad leverans- och proteinutvärdering i hjärtepostskadan och därmed ge mer tillgänglighet vid beredning och leverans av modRNA för sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Ann Anu Kurian för hennes hjälp med detta manuskript. Detta arbete finansierades av ett kardiologistartsbidrag som beviljats Zangilaboratoriet och även av NIH-stipendiet R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
