Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

Published: March 29, 2020 doi: 10.3791/60834
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.

Abstract

מלכודות מסחטות נויטרופילים (רשתות), מורכב של DNA ללא תא (cfdna) וחלבונים כמו יסטוניים ו נויטרופילים elastase (NE), משתחררים על ידי נויטרופילים בתגובה לדלקת מערכתית או פתוגנים. למרות רשתות הוכחו בעבר להגדיל את היווצרות קריש ולעכב fibrinolysis בבני אדם וכלבים, את התפקיד של רשתות אצל חתולים עם ידע העורקים הקרדיוגנטית (קייט), סיבוך מסכנת חיים משני כדי יפרטרופית מחלת שריר הלב , אינו ידוע. שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בתרובי העורקים הקרדיוגנטית אצל חתולים, תקדם את הבנתנו את תפקידם הפתולוגי בקייט. כאן, אנו מתארים טכניקה כדי לזהות רשתות ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע הטרובי בתוך הבייון אבי העורקים, שחולצו במהלך נקרופסי. בעקבות הסיכום עם קסילן, מקטעים של אבי העורקים עברו לאיחזור אנטיגן עקיף המושרה בחום. מקטעים נחסמו אז, החדיר, ו לשעבר vivo נטס זוהו על ידי לוקליזציה של ה-dna ללא תא (cfdna), מcitH3 היסטון מH3 ה, ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. כדי לייעל את גילוי החיסוני של רשתות בתרובי, הקרינה האוטומטית של רכיבי הרקמה הוגבלה באמצעות תהליך מקושה לפני מיקרוסקופ. טכניקה זו עשויה להיות כלי שימושי לחקר רשתות ופקקת במינים אחרים ומציעה תובנות חדשות לתוך הפתופסולוגיה של מצב מורכב זה.

Introduction

חתולים עם יפרטרופית שריר הלב הם בסיכון של מסכנת חיים thromboembolic סיבוכים1,2. למרות התחלואה והתמותה הגבוהים הקשורים לידע העורקים (קייט), הפתופסולוגיה הבסיסית של קייט אצל חתולים מובנת בצורה גרועה. יש גם כלים מוגבלים אבחון וטיפולי לטפל ולזהות חתולים בסיכון זה מצב הרסני3.

בנוסף לתפקידה בחסינות מולדת, נויטרופילים הוכחו לשחק תפקיד פקקת על ידי שחרור מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות), שהם רשתות כמו רשת של DNA ללא תא (cfDNA) מצופה עם האבנים וחלבונים בעלי כגון נויטרופילים elastase (NE) ו myeloperoxidase. נויטרופילים לעבור רשתות היווצרות בתגובה לדלקת מערכתית, מפגש ישיר עם פתוגנים, אינטראקציה עם טסיות מופעל4,5,6,7. אצל כלבים, נויטרופילים הנגזר DNA הוכח לעכב את הליזה קריש, בעוד חלבונים נטו להאיץ את היווצרות קריש. היכולת של רשתות להשמנה תאים מחזורי ורכיבי קרישת דם הוא גם מפתח למאפייני thrombogenic שלהם8,9,10,11,12.

הרשתות מזוהות על ידי לוקליזציה של חלבונים נויטרופילים, האבנים, ו cfDNA. בשל כך, הזיהוי והקוונפיקציה של רשתות ברקמות קבועות על-ידי immunofluorescence מרקמות של ממחטות הנייר מעולה למטאוקסילין המסורתי ולאאוזין (H & E) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר4,5. מספר מחקרים אנושיים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מזוהה רשתות כרכיבים מבניים של תרובי עורקים בעורק כלילי, שבץ מוחי התרובי, atherothrombosis, ו בורידים ורידים13,14,15,16,17. עד כה, לא תוארה שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בקריבי חתולים. מכיוון שזיהוי רשתות בתרופני העורקים הכאותית של חתולים עשוי להקל על מחקר הטרנסשלאני העתידי ברשתות ובפקקת, אנו מתארים טכניקות של זיהוי נטו והערכה ב-פרפין-התרובי העורקים המוטבעים אצל חתולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס. שמלות וביופסיות של רקמות בוצעו עם הסכמת הבעלים.

1. קיבוע רקמה, הטבעה ושיבוץ

  1. לנתח את הבייון של אבי העורקים, כולל את אבי העורקים היורדים, עורק הירך והעורקים המשותפים (איור 1A), זמן קצר לאחר המתת חסד או מוות. בוטה לנתח את הfascia (איור 1B) לפני מיזוג זה לחלוטין ב 10% ניטרלי באגירה מלאה עבור מינימום של 24 h ולא יותר מ 48 h.
  2. כדי לחמם את הדגימה, הטבול תחילה ב-10% פורמאלין ניטרלי באגירה מחוממת עד 37 ° צ' עבור 1 h. אז, לטבול בריכוזים גוברת של אתנול מחומם ל 37 ° צ' (70%, 95%, 100%) 2x עבור 1 h כל אחד. לבסוף, ללא שטיפה, להטביע 2x ב 100% טולואן מחומם ל 37 ° צ' עבור 1 h כל אחד.
  3. הוסיפו פרפין מחומם ל-62 ° c ואפשרו לפרפין לגבש לילה לחלוטין.
  4. סעיף 2 – 3 יקרומטר של פרפין-רקמה מוטבעת באמצעות מיקרוטום ומקום על מגלשות זכוכית טעונה חיובי. אחסן את הרקמות הסבחנות ב-80 ° צ' עד לניתוח נוסף.

2. מעקב אחר התחדשות, מחדש, והשפעת אנטיגן חום

  1. לביצוע מיון והסבה של קטעים על שקופיות זכוכית, מניחים שקופיות זכוכית בארונות תקשורת ובתהליך בסדר הבא:
    1. לטבול לגמרי ב 100% קסילן עבור 3 דקות. חזור על שלב זה 2x. אין לשטוף בין שלבים.
    2. הטבול לחלוטין בריכוזים הפחתת של אתנול (100%, 95%, 70%) בטמפרטורת החדר (RT), 3x עבור 3 דקות כל אחד. אין לשטוף בין שלבים.
    3. יש לטבול לחלוטין במים מפוהים למשך 2 דקות.. אני חוזר
  2. במקום מקטעים לתוך מלוחים באגירה טריס עם 0.1% רצף (TBST, pH = 7.6) עבור 2 – 3 דקות.
  3. ממלאים את המאגר עם מים מפוהים מחוממים עד 100 ° c. הניחו לחדר הקיטור להיות מוקצב במשך 20 דקות.
    הערה: אחזור אנטיגן המושרה בחום מבוצע באופן הטוב ביותר עם חימום עקיף שנוצר על ידי קיטור עם הגדרת טמפרטורה קבועה מראש, כגון סיר מזון.
  4. מחממים את הפתרון הזמין מסחרית לאחזור אנטיגן המכיל טריס ו EDTA (pH = 9) כדי 95-97 ° צ' על צלחת חמה מבוקרת טמפרטורה עם ערבוב קבוע. ודא שהיא אינה מרתיחה.
    הערה: הפתרון צריך להיות מעונן ברגע שהוא מחומם.
  5. יוצקים את הפתרון לאחזור אנטיגן מחומם לתוך מיכל שקופית והניחו את המיכל בחדר הקיטור. אפשר את הפתרון לאחזור אנטיגן כדי להתמצא בטמפרטורת הקיטור במשך 3 – 4 דקות. ודא שטמפרטורת החדר היא ~ 95 ° c.
  6. הטבול את השקופיות לחלוטין בתמיסה לאחזור אנטיגן מחומם והמשך ביישום של חימום חיצוני דרך מסיר הקיטור במשך 20 דקות.
  7. הסר את המכל שקופית מן הקיטור ולאפשר את השקופיות ואת פתרון אחזור אנטיגן להתקרר ל RT. לאחסן את הפתרון אחזור אנטיגן מדולל ב 4 ° צ' ושימוש חוזר עד 2x אם יש צורך.
  8. שוטפים את השקופיות 3 x עם TBST עבור 5 דקות.

3. אימונוולבלינג ומוקרינה אוטומטית

הערה: טבלה 1 מפרטת את ההרכב של מאגרי החסימה המשמשים בשלבים הבאים.

  1. מקטעים דגירה במאגר חסימת 1 עבור 2 h ב RT תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). חותם עם סרט פרפין כדי להימנע מייבוש.
  2. ללא כביסה, מיד להחיל 100 μL של הארנב מדולל שבטים שבטיים H3 (citH3) הנוגדן (0.03 mg/mL מדולל מאגר חסימת 1) ישירות על השקופית.
  3. המקום coverslip (24 מ"מ x 40 מ"מ x 0.13 – 0.17 mm) על כל קטע כדי לאפשר אפילו הפצה של תערובת הנוגדן.
  4. דגירה של 12 – 16 h ב 4 ° צ' עם נדנדה עדין (30-50 סל ד). חותם עם הסרט parafilm כדי למנוע ייבוש.
  5. כביסה 3x עם TBST עבור 5 דקות.
  6. החל 100 μL של נוגדן אנטי ארנבון עז מצופנים ל אלקסה Fluor 488 (מדולל לריכוז הסופי של 0.04 mg/mL או 1:50 במאגר חסימת 1) כמתואר בשלב 3.3. דגירה עבור 1 h ב RT תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). הגנה על שקופיות מאור.
  7. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  8. מקטעי הדגירה של חסימת מאגר 2 לילה ב 4 ° c תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). . הגנה מפני אור
  9. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  10. מקטעים לחסום במאגר חסימת 3 כמתואר בשלב 3.3 בשעה RT עבור 2 h תחת נדנדה עדינה (30-50 סל ד).
  11. מקטעים דגירה עם הארנב polytinylated האנטי האדם נוגדן NE (הריכוז הסופי = 0.2 μg/mL בחסימת מאגר 3) ב 4 ° צ' עבור 12 – 16 h כפי שמתואר בשלבים 3.2 – 3.4.
  12. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  13. דגירה עם אלקסה Fluor 594 streptavidin המשלים (לדלל 1:100 או 0.02 mg/mL במאגר חסימת 3) כמתואר בשלבים 3.2 – 3.3 עבור 1 h ב RT. להגן מפני אור וחותם עם פרפין כדי למנוע ייבוש.
  14. לשטוף עם TBST 1x עבור 5 דקות.
  15. החל 100 μL של שילוב הפתרון האוטומטי של ברירת הדרך ישירות על המקטעים עבור 1 דקות כפי שהורו על ידי היצרן.
  16. שטוף מיד את השקופיות עם TBST 6x במשך 10 דקות.
  17. לכסות כל שקופית עם 100 μL של 300 ננומטר DAPI עבור 5 דקות בחושך.
  18. לשטוף עם TBST עבור 3 דקות. חזור על הפעולה עבור סכום כולל של 5x.
  19. החל טיפה (~ 50 μL) של אמצעי הרכבה אנטי-לדעוך, חלק מערכת הקוצ'ינג האוטומטית של המערכת, ישירות על שקופית הזכוכית שמקיפה את המקטע. המקום coverslip (24 מ"מ x 40 מ"מ x 0.13 – 0.17 mm) בעדינות על המקטע מבלי ליצור כל בועות.
  20. לאפשר דגימות לרפא לילה בחושך על 4 ° צ' עד המדיום ההרכבה התקשה לניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה.

4. מסחטות נויטרופילים זיהוי מלכודת

הערה: הפרוטוקול הבא מנצל מיקרוסקופ אפידלנטית הפוך עם 1,280 x 960 מצלמה דיגיטלית CCD (ראה טבלת חומרים).

  1. כדי לאתר את הקריבי, סרוק את הגולגולת לאורך העורקים, הביקטיון של אבי העורקים, וכל עורק הירך בעזרת מיקרוסקופ בניגוד פאזה עם מטרה 10x. הטרובוס הוא מבנה של רקמה המכילה תאי דם אדומים, כדוריות דם לבנות וטסיות הסמוכות לאנדותל בניגוד לפאזה ומיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2A, איור 2a).
  2. ראשית לבחון סעיפים עבור רשתות באמצעות ערוץ DAPI (עירור = 357/44 ננומטר) עם מטרות 10x ו 20x (איור 2C). שימו לב כי cfDNA מופיע כמו לפרק דנ א שאינו בתוך הגבולות של ציטופלסמה תא כאשר רואים על ניגודיות הפאזה או מיקרוסקופ שדה בהיר.
  3. זיהוי NE וcitH3 על ערוצי טקסס אדום (עירור = 585/29 nm, פליטה = 628/32 nm) וערוץ חלבון פלורסנט ירוק (עירור = 470/22 nm, פליטה = 525/50 ננומטר), בהתאמה עם 10, 20, ו 40x יעדים.
  4. הערכה וניתוח רשתות בתוך הטרובוס באמצעות תוכנה זמינה, כגון Image J (NIH). היווצרות NET מזוהה על בסיס לוקליזציה של cfDNA, מcitH3 ו-NE כמתואר בעבר18. לשמור על זמן חשיפה עקבית ורווחי של כל ערוץ במהלך רכישת תמונות כדי למנוע רוויה בעוצמת פיקסל.
  5. מפה כל הטרובוס מבוסס על קרבתו אל העורקים היורדים על ידי חלוקת אותו לשלושה אזורים שווים, עם אזור 1 הקרוב ביותר לעורקים, אזור 3 הרחוק ביותר מן העורקים, ואזור 2 בין אזורים 1 ו-3). כאשר המפעיל עיוור את המצב הרפואי של כל נושא, לקחת לפחות עשרה שדות אקראיים בכל אזור. אפיון התפלגות הרשתות בהטרובי על-ידי ממוצע מספר השדות עם הרשתות בכל אזור או חישוב השטח הממוצע הכובש בכל אזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש בפרוטוקול זה לאיתור מיקוד, לאחזור אנטיגן מושרה בחום, והחיסונית כפולה של הטרובי מוטבע, זיהינו רשתות בפעם הראשונה של החתול קייט. התרובי בתוך הבייון אבי העורקים נמצאו על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות כתמים סטנדרטיים של H & E ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה. על מיקרוסקופ שדה בהיר, הטרובי של חתולים כללה כדוריות דם אדומות, לוקיציטים, פיברומין, וטסיות (איור 3A). למרות H & E לא יכול להכתים רכיבי NET ספציפיים, רשתות הופיעו לעתים קרובות רשתות של חוטי סגול עמוק של באורכים שונים סביב אריתרופוציטים הסמוך ולוקיציטים (איור 3A, מנוקד המתאר). הטרובוס מאופיין כמבנה מורכב בתוך מרחב כלי הדם על מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 2A, איור 4b). אנו מאשרים את הנוכחות של רשתות בתוך אזורים אלה על ידי מיקרוסקופ אימונולואוורנציה (איור 3B). ההגדלה של אזורים אלה חשף אגרגטים גדולים של רשתות, מורכב cfDNA, מcitH3 ו-NE (איור 2C, איור 3b, מתאר לבן מנוקד). שימוש באותה טכניקה כדי לחפש הטרובי ורשתות אצל חתולים ללא קייט, מצאנו כי גיליונות של הנויטרופילים lyzed ניתן להבחין מדי פעם בקרבת האנדותל. למרות אלה נויטרופילים הציגו כמה מאפיינים מורפולוגיים של היווצרות נטו, הם לא צריכים להיות משויכים עם כל הטרובוס מאורגן. לא הצלחנו לזהות את כל התרובי באף אחת מדגימות הבקרה (איור 4A).

איור 5A מדגים את הקרינה האוטומטית העמוקה של אלמנטים קריש כמו אריתרופוציטים ו קולגן כאשר התמונה בירוק (488 ננומטר) גל, אשר מפריע היכולת שלנו לזהות cfdna ו חלבון לוקליזציה. מצאנו כי הקצר האוטומטי מקושת באמצעות ערכה מסחרית זמין לאחר immunolabeling הגביר באופן משמעותי את הרגישות של חלבון לוקליזציה וזיהוי נטו, אפילו באזורים עם שפע של אריתרופוציטים (איור 5B, ראשי חץ).

Figure 1
איור 1: הנציג תמונות נקרוטיות של ביפריון אבי העורקים מחתול עם ידע עורקים בעורק קרדיוגנטי. (א) אבי העורקים בירידה היה גזור 4-5 ס מ הגולגולת (Cr) לביפריון אבי העורקים. (ב) Fascia התבצעה בקפידה עד שעורק העורקים היורד (1) ו-כסל (2, 3) הוצג בבירור בהיבט הקובדל (Cd). הנכם מתבקשים לשים לב לקריבוס בתוך הבייון של אבי העורקים (*). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הניגוד הייצוגי של הפאזה ומחיסולי הרשת של רשתות בטרובוס שנמצאו בתוך הבייון של חתולי העורקים. (א) מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה חשף את הטרובוס כמבנה בדיד ומסוגר הקרוב לעורקים. ניגודיות משולבת של שלב וכתמים פלואורסצנטית של דנ א (כחול) הראו נוכחות של לוקיציטים ו-DNA ללא תא בתוך הטרובוס. האזור מורכב מריכוז גדול של דנ א ללא תא. הגדלה מקורית של 10x; סרגל קנה מידה = 400 μm. (ב) האזור הארוז ב (א) הוגדל עוד ב-20x. דנ א ללא תא ו-DNA תאיים ומוכתם עם DAPI (כחול), נויטרופילים elastase (NE), ו citסיתות H3 (citH3) הופיע ירוק ואדום, בהתאמה. (הגדלה מקורית של 20x; סרגל קנה מידה = 100 μm). (ג) נטס, מזוהה על בסיס התאמה לוקליזציה של דנ א ללא תא, מcitH3 ו, ו-, היו מתוארים (קו מנוקד). הגדלה מקורית של 40x; סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמות הנציגה של הטרובוס החתולי באמצעות H &Amp; E ו אימונוofor, כתמים. (א) על הכתםH & E, ריכוז גדול של נויטרופילים ו אריתרופוציטים היו גלויים. כרומטוציטים מורים הופיעו כמו חוטי סגול עמוק של אורכים שונים מוקף אריתרופוcytes ו נויטרופילים (מתאר מנוקד, חץ שחור). (ב) מלכודות מואורנופיל בקלות דמיינו שימוש במיקרוסקופיה חיסונית על אותו הטרובוס (מתאר מנוקד, חץ לבן). רשתות זוהו כלוקליזציה של cfDNA (כחול), NE (ירוק), ו citH3 (אדום). הגדלה מקורית של 20x; סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הניגוד הייצוגי של הפאזה והתמונות האימונולופרציה של אבי העורקים. (א) הניגודיות הפאזה ומחיסולי הדמויות של ביפריה אבי העורקים בחתול ללא פקקת עורקים. שימו לב להיעדר התרובי או אגרגטים של נויטרופילים בתוך לומן הבייון של אבי העורקים מהחתול ללא פקקת עורקים. (ב) הניגודיות הפאזה והתרופות החיסמיות של בעלי אבי העורקים בחתול שאובחן בידע עורקים בעורק קרדיוגנטי. הקטיונים של אבי העורקים היו מוכתמים ל-DNA (כחול), נויטרופילים elastase (ירוק), ו H3 לינרוציליציה היאבן (אדום). במקרה זה, היטב הטרובוס בולטות לתוך הקיר כלי הדם וכובש את רוב לומן אבי העורקים היה ציין בחתול עם ידע עורקים הקרדיוגנטית. רשתות, המאופיינת על ידי לוקליזציה של cfDNA, NE, ו citH3, זוהו בתוך הטרובוס (מנוקד החלוקה לרמות). הגדלה מקורית של 10x; סרגל בקנה מידה = 400 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניגודיות מייצגת של הפאזה (PC) ומחיסולי החיסונית של תרובי העורקים משני החתולים. השקופיות היו מוכתמות עבור citH3, NE, ו-DNA ו התמונה ב 488 nm (אדום), 595 ננומטר (ירוק), ו 357 nm (כחול) אורכי גל, בהתאמה, בהגדלה של 40x. לחתולים בעורק קרדיוגנטי יש שפע של אריתרופוציטים (*, קו מנוקד). (A) פלואורסצנטית אוטומטי של אריתרופוציטים היה בולט ביותר על פני אורך הגל 488 ננומטר, והפחיתה את גילוי האות לוקליזציה וזיהוי של רשתות. (ב) מקווטים באופן משמעותי את הקרינה האוטומטית באורך הגל 488 ננומטר, במיוחד באזורים בעלי ריכוז גבוה של אריתרופוציטים (*, קו מנוקד). זה משופר זיהוי של חלבונים colocalized, ו נויטרופילים elastase (ראש חץ), בנוכחות של אריתרופוציטים (סרגל קנה מידה = 200 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מוסף איור 1: הנציגה החיסונית של בעלי הגוון של תרובי העורקים מחתול. הסעיפים היו מוכתמים DNA (כחול), citH3 (אדום), או myeloperoxidase (א) או נויטרופילים elastase (ב). (א) למרות ניצול נוגדן myeloperoxidase ספציפי לחתולים (MPO, 1:5), עוצמת הצביעת של MPO נותרה ענייה. (ב) שימוש בנוגדן מרובה-שבטים (NE), הידוע בפני התגובה הצולבת עם מינים רבים, הפעילות החיסונית ועוצמת הצביעה היו גבוהים באופן משמעותי. שים לב גרעיני lobulated אופייני של נויטרופילים מוקף ב-NE (חיצים). הגדלה מקורית של 40x; סרגל בקנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

חסימת מאגר רכב
1 TBS עם 0.1% רצף-20, 0.1% NP40, 5% סרום עז
2 TBS עם 0.1% רצף-20, 10% סרום לארנבים, 0.1% NP-40
3 TBS עם 0.1% רצף-20, 5% BSA, 0.1% NP-40

טבלה 1: הרכב של מאגרי חסימה המשמשים לאימונולוורבורנציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי רשתות בתרובי העורקים הדו-קרדיוגנטיים הקבועים באמצעות פרוטוקול חיסוני כפול ומיקרוסקופ אימונולובורנציה. למרות שרק תרובי עורקי העורקים היו מוכתמים, בתאוריה זו ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור סוגים אחרים של התרובי ומינים וטרינריים אחרים. זיהוי רשתות בתוך תרופני חתולים בעורקים מרמז על כך שרשתות עשויות לשחק תפקיד בפקקת חתולים.

זיהוי רשתות על-ידי immunofluorescence קבוע, פרפין רקמה מוטבעת הוא מעולה כתמים היסטולוגית קונבנציונאלי כמו H & E, אשר לעתים קרובות מראה האשכולות של כרומטין מוקף נויטרופילים13. אימונוהיסטוכימיה ואימונולובורנציה של תרובי העורקים הקבועים מאפשרים זיהוי סימולטני של cfdna וחלבונים אחרים כמו citH3, ידוע להיות ספציפי לרשתות היווצרות18,19. בגלל הקריושילומים הם מיטביים עבור זיהוי נטו ברקמות ובתרובי, שמנו את הדגימות שלנו ב-10% ניטרלי באגירה, אשר מכיל 4% פורמלדהיד ו 10% מתנול. חומצות גרעין ללא תא אינם קבועים במישרין על-ידי פורמלדהיד. במקום, הם ללא קיבוע בתוך מבנים חלבון קבוע, אשר משתנים על ידי מתילן גשר הפיך באופן חלקי הנגרמת על ידי פורמלדהיד20. כדי להגביל עוד יותר את חפצי הנוי והפלואורסצנטית שנגרמו על ידי חומצה פורמית ו קטונים שנוצרו על ידי חמצון של פורמלדהיד, החוקרים יכולים לבחור להשתמש במתנול בחינם פאראפורמלדהיד מדולל במאגר עבור קיבעון. מכיוון שמשך הקיבעון משפיע על פעילות immunoreactivity אנו ממליצים על קיבוע לא יותר מ -24 שעות לפני התייבשות והטבעה של פרפין. פרפין-רקמות או קרישי דם יכולים להיות מאוחסנים לצורך הטבעה וכתמים.

קיבעון כימי על ידי פורמלדהיד ו פאראפורמלדהיד משנה את המבנה השלישוני של חלבונים, מיסוך את האנטיגנים של עניין ומניעת קשירה של נוגדנים לאפיליסקופים ספציפיים21. לאחזור אנטיגן, תהליך ששובר את הגשר מתילן הצלב, הוא חיוני לפני ביצוע זיהוי חיסוני ברקמות קבוע formalin. בהתבסס על הניסיון של המחברים, לאחזור אנטיגן המושרה בחום באמצעות פתרון האחזור אלקליין (pH = 9 ב Tris/EDTA מאגר) עם חימום עקיף מתון מגביר את הזיהוי של חלבונים ורשתות תוך מזעור חפצי האמנות והקרינה האוטומטית. הטמפרטורה של הפתרון לאחזור אנטיגן לא צריך להגיע לנקודת רתיחה (> 100 ° c), כי ההגדורים של חלבונים יכולים להוביל הכריכה לא ספציפית רעש הרקע.

מגבלה של זיהוי נטו קרישים קבועים היא כי כתמים immunofluorescence יכול להיות משתנה מאוד תחת תנאי אחזור אנטיגן שונים18. דומה לתוצאות שנמצאו על ידי בריקמן ואח ', מצאנו שטמפרטורת דגירה גבוהה יותר (> 55 ° c) הביאה לצביעת מיטבי של אבני הגרעין בגרעינים ולפירוק כרומטין19. עם זאת, מצאנו כי האינטנסיביות מכתים של myeloperoxidase, חלבון מצוי למצוא נויטרופילים ורשתות, היה נמוך תחת התנאים המוצעים. הפעילות החיסונית המסכנה של myeloperoxidase הייתה עקבית למרות השימוש בנוגדן ספציפי לחתולים (תוספת איור 1). לכן, אנו מעודדים חוקרים לשנות את המשך והתנאים (למשל, pH, טמפרטורה) של תהליך אחזור אנטיגן כדי להניב אות משביע רצון על פי אנטיגן של עניין.

אחד האתגרים של זיהוי רשתות במינים וטרינריים הוא חוסר נוגדנים ספציפיים למינים. כדי למנוע את ההפרעות שאירעו במהלך השימוש בנוגדנים העיקריים שמקורם באותו מינים, כללנו צעד חסימה נוסף באמצעות ריכוז גבוה של חיסוני הארנבים לרוויה כל אתרי הכריכה הנותרים על נוגדנים אנטי ארנבת משנית. חיסרון משמעותי בטכניקה זו הוא שהיא גוזלת זמן, משום שהיא דורשת שלבי דגירה מרובים. החוקרים צריכים לכלול שני פקדים שונים שאינם מכילים את הנוגדן העיקרי בשלב החיסונית השני כדי להבטיח את הנוגדן המשני של השלב האימונויניום נקשר במיוחד את הנוגדן העיקרי שלה. הספציפיות של מבני NET שזוהו יכולים להיות מאומתים עוד יותר על-ידי העיכול DNase או הכללת שליטה ביולוגית המורכבת מחתולים הסובלים מחתולי העורקים ללא קייט (איור 5). בנוסף, שולטת שלילית המורכבת מאותו ריכוז של נוגדנים בקרת איזוטיפ כמו נוגדנים העיקרי צריך להיות כלולים כדי לשלול את האינטראקציות הנוגדן לא ספציפי, קשירה לא ספציפית קולטני Fc, ו-פלואורסצנטית סלולרי. מומלץ לחוקרים לשנות פרוטוקול זה על בסיס הזמינות של נוגדנים ספציפיים למינים. אם אין נוגדנים ספציפיים למינים זמינים, אנו מייעצים תחילה להעריך את הפעילות החיסונית של נוגדנים באמצעות אימונוציטוכימיה או להעריך את תעתיק החלבון מהזן המעניין של הומולוגיה לתעתיקים המוזכרים.

גורמים כמו קיבעון לדוגמה, מתאים לאין מספיק, ונוכחות של רכיבי רקמות ספציפיים יכול להוביל לקרינה פלואורסצנטית בתרובי. במהלך קיבוע אלדהיד, אמינים עשוי לשלב עם אלהידס לטופס מתחמי בסיס של שיף, אשר פולטים הזריחה22. בנוסף, ניתן לשנות את החלבונים ברקמה באמצעות כימית, תוך יצירת פלואורסצנטית23. רכיבים מתכלים בדגימות כלי הדם כגון קולגן, אלסטין, ותאי דם אדומים מדווחים באופן טבעי זרוח יונקים24,25. מכיוון שניתן להבחין באופן אוטומטי טבעי או מתנוון ביותר באורכי גל ירוק (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 500 – 550 ננומטר), השימוש באדום-הרבה מאוד fluorophores עשוי למזער כמה מספר הקרינה האוטומטית26. בפרוטוקול הנוכחי, אנו משתמשים בערכה מסחרית של מערכת הפעלה אוטומטית לאחר שתוכננה לאגד אלקטרוסטטי לאלמנטים של רקמת פלורסנט אוטומטית. אנו ממליצים כי החוקרים למטב את המשך של הקונצ ' ינג אוטומטי, מכיוון ההמלצה של היצרן של 5 דקות עלול להפחית immunoreactivity של חלבונים שופע פחות. לחילופין, החוקרים יכולים גם לצנן את הקרינה האוטומטית באמצעות סודן שחור B, 3, 3 '-diaminobenzidine או טריטין כחול27.

מכיוון שהרשתות מופצות באופן הטרואני בתוך הטרובוס, מומלץ לעשות מיפוי יסודי של עורק העורקים כולו. אזורים חיוביים עבור cfDNA, citH3, ו-NE מוגדלים לאחר מכן. הלוקליזציה של cfDNA, citH3, ו-NE השתמשו באופן נרחב כדי לזהות היווצרות נטו להבדיל היווצרות נטו מצורות אחרות של מוות תאים. שלא כמו המחקר האנושי האחרון שמצא רשתות להיות מרוכז בפריפריה של התרובי כלילית, רוב הרשתות בתרובי העורקים החתולי היו מקובצים בהיבט הגולגולתי של קריש הדם28. למרות שאנו משתמשים בפרוטוקול מתוקננת כדי לזהות רשתות, הערכה מיקרוסקופית וכימות הרשתות נשארות סובייקטיבית. כאן, אנו משתמשים בשיטה עיוורת ושיטתית כדי למזער את הטיית המתבונן במהלך ניתוח מיקרוסקופי. מכיוון שמספר הרשתות במדגם יכול להיות מושפע ממספר נויטרופילים, החוקרים יכולים לכמת רשתות ביחס למספר של נויטרופילים על ידי זיהוי נויטרופילים המבוסס על מורפולוגיה גרעינית, קוטר התא, וביטוי של החלבונים ספציפיים נויטרופילים. אתגר נוסף של זיהוי נטו באמצעות מיקרוסקופ הוא כי רשתות יש שוליים מוגדרים לרעה והם נוטים להתמזג, ויוצרים מבנים עורפלים. הדבר עלול להוביל להערכת מספר הרשתות במדגם נתון או מוגזם. לכן, במקום DAPI, הרשתות יכולות להיות מוכתמות באמצעות בדיקת רעלים ירוקה לזיהוי ברור יותר של דנ א של צירוף תאים ממערך הרשתות.

פיתחנו פרוטוקול אימונוולבלינג כפול כדי לזהות רשתות בפרפין-הטרובי החתולים המוטבעים. התחדשות, התחדשות, ואחזור אנטיגן חייבים להתרחש לפני חיסולפיקציה של citH3 ו-NE. מבחן זה יכול להיות כלי רב ערך לחקר היווצרות נטו חתולים ולספק הבנה טובה יותר של הפתופסולוגיה של קייט אצל חתולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי קרנות מאוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, המרכז לבריאות בעלי חיים לוויה (CCAH 2018-30-F). המחברים רוצים להכיר בדוקטור קווין וולארד לשימוש במיקרוסקופ הזריחה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 157 מיקרוסקופ אימונולוקיליקציה H3 מיקרוצירופיל נויטרופילים פקקת עורקים מחלת שריר יפרטרופית של חתולים
זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros,… More

Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter