Summary
Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.
Abstract
Le trappole extracellulari neutrophil (NET), composte da DNA privo di cellule (cfDNA) e proteine come gli istoni e l'elastasi dei neutrofili (NE), vengono rilasciate dai neutrofili in risposta all'infiammazione sistemica o agli agenti patogeni. Anche se in precedenza i NET hanno dimostrato di aumentare la formazione di coaguli e inibire la fibrinolisi negli esseri umani e nei cani, il ruolo dei NET nei gatti con tromboembolismo arterioso cardiogenico (CATE), una complicazione pericolosa per la vita secondaria alla cardiomiopatia ipertrofica , non è noto. Un metodo standardizzato per identificare e quantificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici nei gatti farà progredire la nostra comprensione del loro ruolo patologico in CATE. Qui, descriviamo una tecnica per identificare i NET nei trombi di formaldeide-fissi e di paraffina-embedded all'interno della biforcazione aortica, estratta durante la necropsia. Dopo la deparaffinazione con lo xilene, le sezioni aortiche sono sottoposte al recupero indiretto dell'antigene indotto dal calore. Le sezioni sono state poi bloccate, permeabilizzate e i NET ex vivo sono stati identificati mediante la co-localizzazione del DNA privo di cellule (cfDNA), il citrullinato l'istone H3 (citH3) e l'elastasi neutrofila (NE) usando la microscopia immunofluoresce. Per ottimizzare l'immunorilevamento dei NET nei trombi, l'autofluorescenza degli elementi tissutali è stata limitata utilizzando un processo di spegnimento dell'autofluorescenza prima della microscopia. Questa tecnica potrebbe essere uno strumento utile per studiare NET e trombosi in altre specie e offre nuove intuizioni sulla fisiopatologia di questa complessa condizione.
Introduction
I gatti con cardiomiopatia ipertrofica sono a rischio di complicazioni tromboemboliche pericolose per la vita1,2. Nonostante l'elevata morbilità e mortalità associata al trombboembolismo arterioso cardiogenico felino (CATE), la fisiopatologia sottostante di CATE nei gatti è poco compresa. Ci sono anche strumenti diagnostici e terapeutici limitati per trattare e identificare i gatti a rischio di questa condizione devastante3.
Oltre al suo ruolo nell'immunità innata, i neutrofili hanno dimostrato di svolgere un ruolo nella trombosi rilasciando trappole extracellulari neutrofiche (NET), che sono reti simili a reti di DNA privo di cellule (cfDNA) incrostate di istoni e proteine granulari come elastasi neutrofili (NE) e mieloperossia. Neutrofili sottoposti formazione NETs in risposta all'infiammazione sistemica, incontro diretto con gli agenti patogeni, e l'interazione con piastrine attivate4,5,6,7. Nei cani, il DNA derivato dal neutrofia ha dimostrato di inibire la lisi del coagulo, mentre le proteine NET accelerano la formazione di coaguli. La capacità dei NET di intrappolare le cellule circolanti e i componenti di coagulazione è anche fondamentale per le loro proprietà trombogene8,9,10,11,12.
I NET sono rilevati dalla co-localizzazione di proteine neutrofili extracellulari, istoni e cfDNA. Per questo motivo, l'identificazione e la quantificazione di NET nei tessuti fissi mediante immunofluorescenza dei tessuti deparaffinati è superiore alla tradizionale ematossia (H&E) macchia utilizzando la microscopia a campo luminoso4,5. Diversi studi umani che utilizzano la microscopia immunofluorescenza hanno identificato i NET come componenti strutturali dei trombi coronarici, dei trombi dell'ictus cerebrale, dell'atrombromosi e dei trombi venosi13,14,15,16,17. Ad oggi, non è stato descritto un metodo standardizzato per rilevare e quantificare i NET nei trombi felini. Poiché l'identificazione dei NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini può facilitare la futura ricerca traslazionale in NET e trombosi, descriviamo tecniche di identificazione e valutazione della rete nei trombi arteriosi incorporati nella paraffina nei gatti.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della California, Davis. Necropsie e biopsie dei tessuti sono state eseguite con il consenso dei proprietari.
1. Fissaggio, incorporamento e sezionamento dei tessuti
- Dissezionare la biforcazione aortica, tra cui l'aorta discendente, l'arteria femorale e le arterie iliache comuni(Figura 1A), poco dopo l'eutanasia umana o la morte. Blunt sezionare la fascia (Figura 1B) prima di immergerla completamente in formalina 10% neutro-bufferper un minimo di 24 h e non più di 48 h.
- Per disidratare il campione, immergere prima in formalina al 10% neutra mente riscaldata a 37 gradi centigradi per 1 h. Quindi, immergersi in concentrazioni crescenti di etanolo riscaldato a 37 gradi centigradi (70%, 95%, 100%) 2x per 1 h ciascuno. Infine, senza risciacquare, sommergere 2x nel 100% di toluene riscaldato a 37 gradi centigradi per 1 h ciascuno.
- Aggiungere la paraffina riscaldata a 62 gradi centigradi e lasciare che la paraffina si solidifichi completamente durante la notte.
- Sezione 2-3 del tessuto incorporato in paraffina utilizzando un microtoma e collocata su vetrini di vetro caricati positivamente. Conservare i tessuti sezionati a -80 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.
2. Deparaffinazione, reidratazione e recupero di antigeni indotti dal calore
- Per eseguire la deparaffinazione e la reidratazione delle sezioni su vetrini, posizionare i vetrini in rack ed elaborare nel seguente ordine:
- Immergere completamente in 100% xilene per 3 min. Ripetere questo passaggio 2x. Non risciacquare tra i passaggi.
- Immergere completamente in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 95%, 70%) temperatura ambiente (RT), 3x per 3 min ciascuno. Non risciacquare tra i passaggi.
- Immergere completamente in acqua deionizzata per 2 min. Ripetete.
- Inserire le sezioni nella salina con una salina da 0,1% (TBST, pH - 7,6) per 2-3 min.
- Riempire il serbatoio con acqua deionizzata riscaldata a 100 gradi centigradi. Lasciare che la camera a vapore equilimi per 20 min.
NOTA: il recupero dell'antigene indotto dal calore viene eseguito al meglio con il riscaldamento indiretto generato da un piroscafo con un'impostazione di temperatura preimpostata, ad esempio un piroscafo alimentare. - Riscaldare la soluzione di recupero dell'antigene disponibile in commercio che contiene Tris ed EDTA (pH n. 9) a 95-97 gradi centigradi su una piastra calda a temperatura controllata con agitazione costante. Assicurarsi che non ebollizione.
NOTA: La soluzione dovrebbe diventare torbida una volta riscaldata. - Versare la soluzione di recupero dell'antigene riscaldato in un contenitore di slitta e posizionare il contenitore nella camera del piroscafo. Lasciare che la soluzione di recupero dell'antigene equilichi alla temperatura del piroscafo per 3-4 min. Assicurarsi che la temperatura della camera sia di 95 gradi centigradi.
- Immergere completamente i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene riscaldato e continuare l'applicazione del riscaldamento esterno tramite il piroscafo per 20 min.
- Togliere il contenitore scorrevole dal piroscafo e lasciare raffreddare i vetrini e la soluzione di recupero dell'antigene in RT. Memorizzare la soluzione di recupero dell'antigene diluito a 4 gradi centigradi e riutilizzare fino a 2x se necessario.
- Lavare i vetrini 3x con TBST per 5 min.
3. Immunolabeling e spegnimento autofluorescenza
NOTA: la tabella 1 descrive in dettaglio la composizione dei buffer di blocco utilizzati nei passaggi seguenti.
- Incubare le sezioni in Blocking Buffer 1 per 2 h a RT a dondolo delicato (30-50 rpm). Sigillare con pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione.
- Senza lavaggio, applicare immediatamente 100 l of diluito coniglio policlonale anti-umano citrullied istone H3 (citH3) anticorpo (0,03 mg/mL diluito nel buffer di blocco 1) direttamente sul vetrino.
- Posizionare un coperchio (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) su ciascuna sezione per consentire una distribuzione uniforme della miscela di anticorpi.
- Incubare per 12-16 h a 4 gradi centigradi con dondolo delicato (30-50 giri/min). Sigillare con pellicola parafilm per evitare l'essiccazione.
- Lavare 3x con TBST per 5 min.
- Applicare 100 l di anticorpi anti-coniglio di capra coniugati ad Alexa Fluor 488 (diluito a una concentrazione finale di 0,04 mg/mL o 1:50 in Buffer di blocco 1) come descritto al punto 3.3. Incubare per 1 h a RT sotto dondolo delicato (30-50 rpm). Proteggere i vetrini dalla luce.
- Lavare con TBST 3x per 5 min.
- Incubare le sezioni in Blocking Buffer 2 durante la notte a 4 gradi centigradi sotto dondolo delicato (30-50 giri/min). Proteggere dalla luce.
- Lavare con TBST 3x per 5 min.
- Sezioni di blocco in Blocco buffer 3 come descritto nel passaggio 3.3 a RT per 2 h sotto dolce dondolo (30-50 rpm).
- Sezioni di incubatura con anticorpo NE del coniglio policlonale biotinylato (concentrazione finale : 0,2 g/mL nel buffer di blocco 3) a 4 gradi centigradi per 12–16 h come descritto nei passaggi da 3.2 a 3.4.
- Lavare con TBST 3x per 5 min.
- Incubare con Alexa Fluor 594 coniugato streptavidin (diluire a 1:100 o 0,02 mg/mL in Blocking Buffer 3) come descritto nei passaggi da 3,2 a 3,3 per 1 h a RT. Proteggere dalla luce e sigillare con paraffina per evitare l'essiccazione.
- Lavare con TBST 1x per 5 min.
- Applicare 100 l'l di miscela di soluzione di spegnimento dell'autofluorescenza direttamente sulle sezioni per 1 min come indicato dal produttore.
- Lavare immediatamente i vetrini con TBST 6x per 10 min.
- Coprire ogni vetrino con 100 gradi l- 300 nM DAPI per 5 min al buio.
- Lavare con TBST per 3 min. Ripetere questo per un totale di 5x.
- Applicare una goccia (50 dollari) di supporto di montaggio antifade, parte del kit di spegnimento autofluorescenza, direttamente sullo scivolo di vetro che circonda la sezione. Posizionare delicatamente una vestra (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) sulla sezione senza creare bolle.
- Lasciare che i campioni si guariscano durante la notte al buio a 4 gradi centigradi fino a quando il supporto di montaggio non si è indurito per l'analisi microscopica con lenti ad immersione.
4. Identificazione trappola extracellulare Neutrophil
NOTA: Il protocollo seguente utilizza un microscopio a epifluorescenza invertito con una telecamera CCD digitale 1.280 x 960 (vedere Tabella dei materiali).
- Per individuare i trombi, scansionare cranicamente lungo la lunghezza dell'aorta, la biforcazione aortica e ogni arteria femorale utilizzando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 10x. Un trombo è un conglomerato di tessuto contenente globuli rossi, globuli bianchi e piastrine adiacenti all'endotelio sul contrasto di fase e microscopia del campo luminoso (Figura 2A, Figura 2B).
- Esaminare innanzitutto le sezioni per i NET utilizzando il canale DAPI (eccitazione 357/44 nm) con obiettivi 10x e 20x (Figura 2C). Si noti che il cfDNA appare come DNA decondensato che non è all'interno dei confini del citoplasma di una cellula quando visto sul contrasto di fase o microscopia campo luminoso.
- Identificare extracellular NE e citH3 sui canali Texas Red (eccitazione - 585/29 nm, emissione di 628/32 nm) e il canale proteico fluorescente verde (eccitazione : 470/22 nm, emissione - 525/50 nm), rispettivamente con obiettivi 10, 20 e 40x.
- Valutare e analizzare i FORMATI di rete all'interno di un trombo utilizzando il software disponibile, ad esempio Image J (NIH). La formazione della rete è identificata in base alla co-localizzazione di cfDNA, extracellular citH3 e NE come descritto in precedenza18. Mantenere un tempo di esposizione coerente e guadagni di ogni canale durante l'acquisizione di immagini per evitare la saturazione in intensità di pixel.
- Mappare ogni trombo in base alla sua vicinanza all'aorta discendente dividendolo in tre zone uguali, con la zona 1 più vicina all'aorta, la zona 3 più lontana dall'aorta e la zona 2 tra le zone 1 e 3). Con l'operatore accecato alle condizioni mediche di ogni soggetto, prendere almeno dieci campi casuali in ogni zona. Caratterizzare la distribuzione di NET nei trombi calcolando la media del numero di campi con NET in ogni zona o calcolando l'area media che occupa la rete per zona.
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo per la deparaffinizzazione, il recupero di antigeni indotti dal calore e la doppia immunoetichettatura dei trombi incorporati nella paraffina, abbiamo identificato per la prima volta i NET in felino CATE. I trombi all'interno della biforcazione aortica sono stati localizzati mediante microscopia a fluorescenza e microscopia a campo luminoso utilizzando la colorazione H&E standard e la microscopia a contrasto di fase. Sulla microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini consistevano in globuli rossi, leucociti, fibrina e piastrine (Figura 3A). Sebbene H&E non possa macchiare specifici componenti NET, i NET sono apparsi frequentemente come reti di fili viola tenocchi di varie lunghezze che circondano gli eritrociti e i leucociti vicini(Figura 3A, contorno tratteggiato). Un trombo è stato caratterizzato come una struttura ben delimitata all'interno dello spazio vascolare sulla microscopia a contrasto di fase (Figura 2A, Figura 4B). Abbiamo ulteriormente confermato la presenza di NET all'interno di queste aree mediante microscopia immunofluorescenza (Figura 3B). L'ingrandimento di queste aree ha rivelato grandi aggregati di NET, composti da cfDNA, extracellulare citH3 e NE (Figura 2C, Figura 3B, contorno punteggiato bianco). Utilizzando la stessa tecnica per cercare trombi e NET nei gatti senza CATE, abbiamo scoperto che fogli di neutrofili lized potrebbero essere rilevati occasionalmente in prossimità dell'endotelio. Anche se questi neutrofili hanno mostrato alcune caratteristiche morfologiche della formazione della rete, non dovrebbero essere associati ad alcun trombo organizzato. Non è stato identificato alcun trombi in nessuno dei campioni di controllo (Figura 4A).
La figura 5A dimostra una profonda autofluorescenza di elementi di coaguli come eritrociti e collagene quando viene guardata alla lunghezza d'onda verde (488 nm), che ha ostacolato la nostra capacità di rilevare il DNA cf e la co-localizzazione delle proteine. Abbiamo scoperto che il breve autofluorescenza che si sta placando utilizzando un kit disponibile in commercio dopo l'immunoetichettatura ha aumentato significativamente la sensibilità della co-localizzazione delle proteine e del rilevamento della rete, anche in aree con un'abbondanza di eritrociti (Figura 5B, punte di freccia).
Figura 1: Fotografie necrofunzionali rappresentative di una biforcazione aortica sezionata da un gatto con trombboembolismo arterioso cardiogenico. (A) L'aorta discendente è stata sezionata 4-5 cm cranial (Cr) alla biforcazione aortica. (B) La Fascia è stata accuratamente sezionata fino a quando l'aorta discendente (1) e le arterie iliac (2,3) erano chiaramente visibili all'aspetto caudale (Cd). Si noti il trombo all'interno della biforcazione aortica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Contrasto di fase rappresentativo e immagini di immunofluorescenza di NET in un trombo trovato all'interno di una biforcazione aortica felina. (A) La microscopia a contrasto di fase ha rivelato un trombo come una struttura discreta e ben delimitata vicino all'aorta. Il contrasto di fase combinato e la colorazione della fluorescenza del DNA (blu) hanno mostrato la presenza di leucociti e DNA privo di cellule all'interno del trombo. L'area inscatolata è costituita da una grande concentrazione di DNA privo di cellule. Ingrandimento originale 10x; Barra della scala - 400 m. (B) L'area in scatola (A) è stata ulteriormente ingrandita a 20x. Il DNA privo di cellule e il DNA intracellulare macchiato con DAPI (blu), elastasi neutrofili (NE), e citrullinate istone H3 (citH3) apparivano rispettivamente di verde e rosso. (ingrandimento originale 20x; Barra della scala: 100 m). (C) SONO stati delineati i NET, identificati sulla base della co-localizzazione del DNA privo di cellule, extracellulare NE e citH3 (linea tratteggiata). Ingrandimento originale 40x; Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagine rappresentativa di un trombo arterioso felino con h&E e colorazione immunofluorescenza. (A) Sulla macchia H&E, era visibile una grande concentrazione di neutrofili ed eritrociti. Le cromate extracellulari apparivano come fili viola profondi di varie lunghezze circondati da eritrociti e neutrofili (contorno punteggiato, freccia nera). (B) Le trappole extracellulari Neutrophil sono state facilmente visualizzate utilizzando la microscopia immunofluorescenza sullo stesso trombo (contorno punteggiato, freccia bianca). I NET sono stati identificati come colocalizzazione di cfDNA (blu), NE (verde) e citH3 (rosso). Ingrandimento originale 20x; Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Contrasto di fase rappresentativo e immagini immunofluorescenza delle biforcazioni aortiche. (A) Immagini di contrasto di fase e immunofluorescenza di biforcazioni aortiche in un gatto senza trombosi arteriosa. Si noti l'assenza di trombi o aggregati di neutrofili all'interno del lume della biforcazione aortica dal gatto senza trombosi arteriosa. (B) Immagini di contrasto di fase e immunofluorescenza di biforcazioni aortiche in un gatto con diagnosi di tromboembolismo arterioso cardiogenico. Le biforcazioni aortiche sono state macchiate per il DNA (blu), l'elastasi neutrofilo (verde) e l'istone citrullistato H3 (rosso). In questo caso, un trombo ben delimitato sporgente nella parete vascolare e occupando la maggior parte del lume aortico è stato notato nel gatto con troboembolismo arterioso cardiogenico. I NET, caratterizzati dalla co-localizzazione di cfDNA, NE e citH3, sono stati identificati all'interno del trombo (contorno punteggiato). Ingrandimento originale 10x; Barra di scala - 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Contrasto di fase rappresentativo (PC) e immagini immunofluoreescenze di trombi arteriosi di due gatti. Le diapositive sono state macchiate per citH3, NE, e DNA e immagine a 488 nm (rosso), 595 nm (verde), e 357 nm (blu) lunghezze d'onda, rispettivamente, a ingrandimento 40x. I trombi arteriosi cardiogenici nei gatti avevano un'abbondanza di eritrociti. (A) L'autofluorescenza dagli eritrociti è stata più prominente in tutta la lunghezza d'onda di 488 nm, diminuendo l'individuazione del segnale di co-localizzazione e l'identificazione dei NET. (B) L'attenuazione significativamente ha ridotto l'autofluorescenza alla lunghezza d'onda di 488 nm, soprattutto nelle aree con un'alta concentrazione di eritrociti (a, linea tratteggiata). Ha migliorato il rilevamento di proteine colocalizzate, citH3, e elastasi neutrofili (punta di freccia), in presenza di eritrociti (barra di scala - 200 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplemento Figura 1: Immagini immunofluorenze rappresentative di trombi arteriosi da un gatto. Le sezioni sono state macchiate per il DNA (blu), citH3 (rosso) e mieloperossia (A) o neutrofessa elastasi (B). (A) Nonostante l'utilizzo di un anticorpo mieloperossia specifico per felino (MPO, 1:5), l'intensità di colorazione di MPO è rimasta scarsa. (B) Utilizzando un anticorpo di elastasi di neutrofilo policlonale (NE), noto per reagire tra più specie, l'immunoreattività e l'intensità delle macchie erano significativamente più elevate. Nota i caratteristici nuclei lobulati di neutrofili circondati da NE (frecce). Ingrandimento originale 40x; Barra della scala : 100 m. Fare clic qui per scaricare questa figura.
| Buffer di blocco | Composizione | |
| 1 | TBS con 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% siero di capra | |
| 2 | TBS con 0,1% Tween-20, 10% siero di coniglio, 0,1% NP-40 | |
| 3 | TBS con 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabella 1: Composizione dei buffer di blocco utilizzati per l'immunofluorescenza.
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Discussion
Descriviamo un protocollo per identificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi utilizzando un protocollo di doppia immunoetichettatura e la microscopia immunofluorescenza. Anche se solo i trombi arteriosi cardiogenici sono stati macchiati, in teoria questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie. L'identificazione di NET all'interno del trombbi arterioso felino suggerisce che i NET possono svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti.
La rilevazione di NET mediante immunofluorescenza nel tessuto fisso e incorporato in paraffina è superiore alle macchie istologiche convenzionali come H&E, che spesso mostra fili di cromatina circondati da neutrofili13. L'immunosofochimica e l'immunofluorescenza dei trombi arteriosi fissi consentono il rilevamento simultaneo di cfDNA e altre proteine extracellulari come citH3, noto per essere specifico per la formazione diNET18,19. Poiché i criopreparati sono non ottimali per il rilevamento della rete nei tessuti e nei trombi, abbiamo conservato i nostri campioni in formalina al 10% nel buffer neutro, che contiene il 4% di formaldeide e il 10% di metanolo. Gli acidi nucleici privi di cellule non sono fissati direttamente dalla formaldeide. Invece, sono immobilizzati all'interno di strutture proteiche fisse, che sono alterate da collegamenti incrociati del ponte di metilene parzialmente reversibili indotti dalla formaldeide20. Per limitare ulteriormente i manufatti e l'autofluorescenza causata dall'acido formico e dai chetoni generati dall'ossidazione della formaldeide, gli investigatori possono scegliere di utilizzare la paraformaldeide priva di metanolo diluita nel buffer per la fissazione. Poiché la durata della fissazione influisce sull'immunoreattività, si consiglia la fissazione per non più di 24 h prima della disidratazione e dell'incorporamento della paraffina. I tessuti o i coaguli incorporati nella paraffina possono quindi essere conservati per la deparaffinizzazione e la colorazione.
La fissazione chimica mediante formaldeide e paraformaldeide altera la struttura terziaria delle proteine, mascherando gli antigeni di interesse e impedendo il legame degli anticorpi a specifici epitopi21. Il recupero dell'antigene, un processo che rompe gli interlink del ponte di metilene, è essenziale prima di eseguire l'immunorilevamento nei tessuti fissati alla formalina. Sulla base dell'esperienza degli autori, il recupero di antigene indotto dal calore utilizzando una soluzione di recupero alcalina (pH 9 nel buffer Tris/EDTA) con un lieve riscaldamento indiretto migliora il rilevamento di proteine e NET riducendo al minimo artefatti e autofluorescenza. La temperatura della soluzione di recupero dell'antigene non dovrebbe raggiungere il punto di ebollizione (>100 gradi C), perché la devogliamento delle proteine può portare a legame non specifico e rumore di fondo.
Una limitazione dell'identificazione NET nei coaguli fissi è che l'immunofluorescenza colorazione può essere altamente variabile in diverse condizioni di recupero dell'antigene18. Paragonabile ai risultati trovati da Brinkmann et al., abbiamo scoperto che temperature di incubazione più elevate (>55 ) hanno portato a una colorazione ottimale degli istoni nei nuclei e alla cromatina dedensata19. Tuttavia, abbiamo scoperto che l'intensità di colorazione della mieloperossia, una proteina granulare presente nei neutrofili e nei NET, era bassa nelle condizioni proposte. La scarsa immunoreattività della mieloperossia era coerente nonostante l'uso di un anticorpo felino specifico (Supplement Figura 1). Pertanto, incoraggiamo gli investigatori a modificare la durata e le condizioni (ad esempio, pH, temperatura) del processo di recupero dell'antigene per produrre un segnale soddisfacente basato sull'antigene di interesse.
Una delle sfide dell'identificazione delle NET nelle specie veterinarie è la mancanza di anticorpi specifici per le specie. Per evitare l'interferenza incontrata quando si utilizzano anticorpi primari provenienti dalla stessa specie, abbiamo incluso un ulteriore passo di blocco utilizzando un'alta concentrazione di immunoglobuine di coniglio per saturare eventuali siti di legame rimanenti sugli anticorpi secondari anti-coniglio. Uno svantaggio principale di questa tecnica è che richiede molto tempo, perché richiede più passaggi di incubazione. I ricercatori dovrebbero includere due diversi controlli che escludono uno degli anticorpi primari nella seconda fase di immunolabeling per garantire che l'anticorpo secondario sia da una delle due fasi di immunolabelling si lega specificamente al suo anticorpo primario. La specificità delle strutture NET identificate può essere ulteriormente verificata dalla digestione di DNase o dall'inclusione di controlli biologici costituiti da biforcazioni aortiche da gatti senza CATE(Figura 5). Inoltre, i controlli negativi costituiti dalla stessa concentrazione di anticorpi di controllo dell'isotipo degli anticorpi primari devono essere inclusi per escludere interazioni non specifiche degli anticorpi, legandosi non specifica ai recettori Fc e autofluorescenza cellulare. Si consiglia agli investigatori di modificare questo protocollo in base alla disponibilità di anticorpi specifici per specie. Se non sono disponibili anticorpi specifici per specie, consigliamo di valutare prima l'immunoreattività degli anticorpi che utilizzano l'immunocitochimica o valutare la trascrizione proteica della specie di interesse per l'omologia alle trascrizioni a cui si fa riferimento.
Fattori come la fissazione del campione, la deparaffinizzazione inadeguata e la presenza di specifici componenti tissutali possono portare all'autofluorescenza nei trombi. Durante la fissazione dell'aldeide, le ammine possono combinarsi con aldeidi per formare complessi di base Schiff, che emettono fluorescenza22. La deparaffinazione incompleta può anche modificare chimicamente le proteine nel tessuto, creando autofluorescenza23. Componenti extracellulari in campioni vascolari come collagene, elastina, e globuli rossi sono segnalati per fluorescenza naturale nei mammiferi24,25. Poiché l'autofluorescenza naturale o iatrogenica è più evidente nelle lunghezze d'onda verde (eccitazione : 488 nm, emissione, 500-550 nm), l'uso di fluorofori di colore rosso estremo può ridurre al minimo alcune autofluorescenza26. Nel protocollo attuale, abbiamo utilizzato un kit di spegnimento dell'autofluorescenza disponibile in commercio progettato per legarsi elettrostaticamente agli elementi dei tessuti autofluorescenti. Raccomandiamo ai ricercatori di ottimizzare la durata dello spegnimento dell'autofluorescenza, perché la raccomandazione del produttore di 5 min può diminuire l'immunoreattività delle proteine meno abbondanti. In alternativa, gli investigatori possono anche smorzare l'autofluorescenza utilizzando Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine o trypan blu27.
Poiché i NET sono distribuiti eterogeneamente all'interno di un trombo, si raccomanda una mappatura approfondita dell'intera aorta e delle arterie iliache. Le regioni positive per cfDNA, citH3 e NE vengono quindi ingrandite. La colocalizzazione di cfDNA, citH3 e NE è stata ampiamente utilizzata per identificare la formazione della rete e differenziare la formazione della rete da altre forme di morte cellulare. A differenza di un recente studio umano che ha trovato NET da concentrare alla periferia dei trombi coronarici, la maggior parte dei NET in trombi arteriosi felini sono stati raggruppati all'aspetto cranico del coagulo28. Anche se abbiamo usato un protocollo standardizzato per identificare i NET, la valutazione microscopica e la quantificazione delle NET rimane soggettiva. Qui, abbiamo utilizzato un metodo cieco e sistematico per ridurre al minimo la distorsione dell'osservatore durante l'analisi microscopica. Poiché il numero di NET in un campione può essere influenzato dal numero di neutrofili, i ricercatori possono quantificare i NET rispetto al numero di neutrofili identificando i neutrofili basati sulla morfologia nucleare, il diametro cellulare e l'espressione di proteine specifiche per i neutrofili. Un'altra sfida dell'identificazione della rete con la microscopia è che i NET hanno margini mal definiti e tendono a fondersi, formando strutture nebulose. Ciò potrebbe portare a una sottostima o a una sopra500 del numero di NET in un dato campione. Pertanto, invece di DAPI, i NET possono essere macchiati utilizzando Sytox Green per un'identificazione e una denotazione più chiare del DNA delle cellule che aggiunge le cellule dalla formazione di NETs.
Abbiamo sviluppato un doppio protocollo di immunoetichettatura per identificare i NET nei trombi arteriosi felini incorporati in paraffina. La deparaffinazione, la reidratazione e il recupero dell'antigene devono avvenire prima dell'immunoetichettatura di citH3 e NE. Questo saggio può essere uno strumento prezioso per lo studio della formazione della rete nei gatti e fornire una migliore comprensione della fisiopatologia del CATE nei gatti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da fondi dell'Università della California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Gli autori vorrebbero riconoscere il Dr. Kevin Woolard per l'uso del microscopio a fluorescenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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