Summary
熱誘導抗原検索と二重免疫標識プロトコルを用いてホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みネコの心原性動脈血栓中の好中球外細胞トラップ(NET)を同定する方法について述べた。
Abstract
細胞外トラップ(NET)は、細胞を含まないDNA(cfDNA)とヒストンや好中球エラスターゼ(NE)などのタンパク質から構成され、全身性炎症や病原体に応答して好中球によって放出される。NETsは以前、ヒトや犬の血栓形成を増強し、線維化症を阻害することが示されているが、肥大性心筋症に続く生命を脅かす合併症である心原性動脈血栓塞栓症(CATE)を有する猫におけるNETsの役割は不明です。猫の心原性動脈血栓におけるNETを同定し、定量化する標準化された方法は、CATEにおける病理学的役割の理解を進める。ここでは、壊死中に抽出された大動脈分岐内のホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みトロンビ中のNETを同定する技術について述べている。キシレンとの脱パラフィン後、大動脈切片は間接的に熱誘導抗原の検索を受けた。その後、切片を遮断、透過、およびex vivo NETsを、無細胞DNA(cfDNA)、ヒストンH3(citH3)、および免疫蛍光顕微鏡を用いた好中球エラスターゼ(NE)の共局在化によって同定された。血栓中のNETの免疫検出を最適化するために、組織元素の自己蛍光は顕微鏡検査の前に自己蛍光消光プロセスを用いて制限された。この技術は、他の種のNETおよび血栓症を研究するのに有用なツールとなり、この複雑な状態の病態生理学に関する新しい洞察を提供する可能性がある。
Introduction
肥大性心筋症の猫は、生命を脅かす血栓塞栓性合併症のリスクがある 1,,2.猫の心原性動脈血栓塞栓症(CATE)に関連する高い罹患率と死亡率にもかかわらず、猫におけるCATEの基礎となる病態生理は十分に理解されていない。この壊滅的な状態の危険にさらされている猫を治療し、識別するための限られた診断および治療ツールもあります 3.
自然免疫におけるその役割に加えて、好中球は、ヒストンと好中球エラスターゼ(NE)および骨髄ペロペロキシダーゼのような顆粒タンパク質で覆われた無細胞DNA(cfDNA)のウェブのようなネットワークである好中球細胞外トラップ(NETs)を放出することによって血栓症に役割を果たすることが示されている。好中球は、全身性炎症、病原体との直接の遭遇、および活性化された血小板44、5、6、75,6との相互作用に応答してNETs形成を受ける。犬では、好中球由来のDNAが血栓溶血を阻害し、NETタンパク質が血栓形成を加速することが示されている。NETsが循環細胞および凝固成分をトラップする能力は、血栓原性特性88、9、10、11、12の鍵でもあります。,9,10,11,12
NETは細胞外好中球タンパク質、ヒストン、およびcfDNAの共局在化によって検出される。このため、脱パラフィン組織の免疫蛍光による固定組織におけるNETの同定および定量は、明視野顕微鏡44,55を用いた伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色よりも優れている。免疫蛍光顕微鏡を用いたいくつかのヒト研究では、NETsを冠状動脈血栓、脳卒中血栓、アテローム血栓症、静脈血栓13、14、15、16、17の構造成分として同定した。13,14,15,16,17現在までに、ネコ血栓中のNETを検出および定量する標準化された方法は説明されていない。ネコの心原性動脈血栓におけるNETの同定は、NETsおよび血栓症における将来の翻訳研究を促進する可能性があるため、猫におけるパラフィン埋め込まれた動脈血栓におけるNET同定および評価の技術について述べている。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、カリフォルニア大学デービス校の制度的動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われました。組織の壊死と生検は、所有者の同意を得て行われました。
1. 組織固定、埋め込み、切除
- 大動脈分岐を解剖し、下降大動脈、大腿動脈、および一般的な腸骨動脈(図1A)を含む、人道的安楽死または死亡の直後に。鈍いは、少なくとも24時間と48時間未満の10%中性緩衝ホルマリンにそれを完全に沈める前に、筋膜(図1B)を解剖します。
- 試料を脱水するために、まず10%中性緩衝ホルマリンを1時間37°Cに加熱して沈水する。その後、37°C(70%、95%、100%)に加熱されたエタノール濃度の上昇に沈水それぞれ1時間2倍。最後に、すすかずに、100%トルエンで2倍を1時間加熱して37°Cに加熱した。
- 62°Cに加熱したパラフィンを加え、パラフィンを完全に一晩固める。
- ミクロトームを使用したパラフィン埋め込み組織のセクション2~3 μmを、正に帯電したガラススライドに配置します。さらに分析するまで-80°Cで切除組織を保管してください。
2. 脱パラフィン、再水和、熱誘導抗原の検索
- ガラススライド上のセクションの分離と水分補給を実行するには、ガラススライドをラックに配置し、次の順序で処理します。
- 3分間100%キシレンで完全に沈み込む。ステップ間でリンスしないでください。
- エタノールの濃度を減少させる完全に水没 (100%, 95%, 70%)室温(RT)で、3倍の3分ずつ。ステップ間でリンスしないでください。
- 2分間、脱イオン水に完全に沈み込みます。
- 2~3 分間、0.1 % Tween (TBST, pH = 7.6) でトリスバッファー生理液線にセクションを配置します。
- 100°Cに加熱脱イオン水で貯水池を充填します。蒸気室を20分間平衡化します。
注:熱誘導抗原の検索は、食品蒸し器などの温度設定が設定されたスチーマーによって生成された間接加熱で行うのが最善です。 - トリスとEDTA(pH=9)を含む市販の抗原検索溶液を温度制御ホットプレート上で95〜97°Cに加熱し、一定の攪拌を行います。沸騰しないようにしてください。
注: ソリューションは、温めると曇りになります。 - 加熱した抗原検索液をスライド容器に注ぎ、容器を蒸し器のチャンバーに入れます。抗原検索溶液を3~4分間、蒸気器の温度に平衡化させ、チャンバーの温度が約95°Cであることを確認します。
- 熱い抗原の検索の解決にスライドを完全に水に沈め、20分間の蒸し器を介して外部加熱の適用を続ける。
- スチーマーからスライド容器を取り出し、スライドおよび抗原検索溶液を冷却してRTに冷却させ、希釈された抗原検索溶液を4°Cに保存し、必要に応じて最大2倍再利用します。
- スライド3xをTBSTで5分間洗います。
3. 免疫標識と自己蛍光のクエンチ
注:表 1は、次の手順で使用されるブロッキング バッファの構成を示しています。
- 緩やかな揺れ(30~50 rpm)の下でRTで2時間ブロックバッファ1のインキュベートセクション。乾燥を避けるためにパラフィンフィルムでシールします。
- 洗浄せずに、100μLの希釈ウサギポリクローナル抗ヒトシトルリン化ヒストンH3(citH3)抗体(0.03mg/mLをブロッキングバッファー1に希釈)をスライドに直接塗布します。
- 各セクションにカバースリップ(24 mm x 40 mm x 0.13~0.17 mm)を配置し、抗体混合物の均等な分布を可能にします。
- 穏やかな揺れ(30-50のrpm)と4 °Cで12-16時間のインキュベート。乾燥を避けるためにパラフィルムフィルムでシールします。
- TBSTで3倍の洗濯を5分間洗います。
- ステップ3.3に記載されているように、アレクサFluor 488(0.04 mg/mLまたはブロッキングバッファ1で1:50の最終濃度に希釈)に結合したヤギ抗ウサギ抗体の100 μLを適用します。RTで1時間インキュベートして、穏やかな揺れ(30~50 rpm)で行います。スライドを光から保護します。
- TBST 3xで5分間洗います。
- 緩やかな揺動(30~50 rpm)の下で4°Cでブロッキングバッファ2のセクションをインキュベートします。光から守る。
- TBST 3xで5分間洗います。
- ブロッキングバッファ3のブロックセクションは、ステップ3.3でRTで2時間(30〜50 rpm)でブロックします。
- ステップ3.2-3.4に記載されているように、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ヒトNE抗体(最終濃度=ブロッキングバッファ3の0.2 μg/mL)を4°Cで12〜16時間インキュベートしたセクション。
- TBST 3xで5分間洗います。
- ALEXA Fluor 594ストレプトアビジンコンジュゲート(ブロッキングバッファ3では1:100または0.02 mg/mLに希釈)を用いてインキュベートし、RTで1時間のステップ3.2-3.3に記載されているように、乾燥を防ぐためにパラフィンで保護します。
- TBST 1xで5分間洗います。
- 100 μLの自家蛍光焼入れ液混合物を、製造業者の指示に従って1分間、セクションに直接塗布します。
- すぐに10分間、TBST 6xでスライドを洗います。
- 各スライドに300 nM DAPIの100 μLを覆い、暗闇の中で5分間おります。
- TBSTで3分間洗います。
- 自己蛍光消光キットの一部であるアンチフェード実装媒体のドロップ(約50μL)を、セクションを囲むガラススライドに直接塗布します。カバースリップ(24 mm x 40 mm x 0.13~0.17 mm)を、泡を作成せずに、セクションにそっと置きます。
- 浸漬レンズによる顕微鏡分析のために取り付け媒体が硬化するまで、サンプルを4°Cの暗闇の中で一晩治すことができます。
4. 好中球細胞外トラップの同定
注:次のプロトコルは、1,280 x 960デジタルCCDカメラを搭載した反転性蛍光顕微鏡を利用しています(材料表を参照)。
- 血栓を見つけるには、大動脈の長さに沿って、大動脈分岐、および10倍の目的を有する位相対視による各大腿動脈に沿って、目を通してスキャンする。血栓は、赤血球、白血球、および内皮に隣接する血小板を含む組織の集まりであり、位相コントラストおよび明視野顕微鏡で(図2A、図2B)。
- 最初に、10x および 20x の目標を持つ DAPI チャネル (励起 = 357/44 nm) を使用して NET のセクションを調べます (図 2C)。cfDNAは位相コントラストや明るい視野顕微鏡で見ると細胞の細胞質の範囲内にない縮合DNAとして現れる。
- テキサス赤チャネル(励起= 585/29 nm、発光= 628/32 nm)および緑色蛍光タンパク質チャネル(励起= 470/22 nm、放出量= 525/50nm)上の細胞外NEおよびcitH3をそれぞれ10、20、および40xの目標で同定する。
- イメージ J (NIH) などの利用可能なソフトウェアを使用して、血栓内の NET を評価および分析します。NET形成は、cfDNA、細胞外citH3、およびNEの共局在化に基づいて、前述の18に基づいて同定される。ピクセルの輝度の飽和を避けるために、画像の取得を通じて各チャンネルの一貫した露出時間とゲインを維持します。
- 各血栓を降りる大間への近接度に基づいて、大間に最も近いゾーン1、大間から最も遠いゾーン3、ゾーン1と3の間のゾーン2を3つの等しいゾーンに分割してマッピングします。オペレータが各被験者の病状に目がくらんだ状態で、各ゾーンで少なくとも10個のランダムフィールドを取る。各ゾーンの NET を使用してフィールド数を平均化するか、ゾーンあたりの平均 NET 占有面積を計算することにより、血栓中の NET の分布を特徴付けます。
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Representative Results
このプロトコルを用いて、パラフィン埋め込み血栓の脱パラフィン化、熱誘導抗原検索、および二重免疫標識を行い、ネコのCATE中のNETを初めて同定した。大動脈分岐内のトロンビは、標準的なH&E染色および位相コントラスト顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡検査によって位置付けられていた。明るいフィールド顕微鏡では、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリン、および血小板で構成された(図3A)。H&E は特定の NET コンポーネントを染色することはできませんが、NETs は、近くの赤血球と白血球を囲むさまざまな長さの深い紫色の糸のネットワークとしてしばしば現れました (図 3A、点線のアウトライン)。血栓は位相対向顕微鏡における血管空間内の十分に区分された構造として特徴付けられた(図2A、図4B)。さらに、これらの領域内にNETsの存在を免疫蛍光顕微鏡法で確認した(図3B)。これらの領域の拡大は、CFDNA、細胞外citH3、およびNEで構成されるNETsの大きな凝集体を明らかにした(図2C、図3B、白色点線の輪郭)。同じ技術を用いて、CATEを使用していない猫の血栓とNETを検索すると、乾燥した好中球のシートが内皮に近い場所で時折検出されることがわかりました。これらの好中球は、NET形成のいくつかの形態学的特徴を示したが、それらは、任意の組織血栓と関連付けるべきではない。どの対照サンプルにも血栓は同定しなかった(図4A)。
図5Aは、緑色(488nm)波長で画像化した赤血球やコラーゲンなどの血栓元素の深遠な自己蛍光を示し、cfDNAおよびタンパク質共局在化を検出する能力を妨げている。免疫標識後の市販キットを用いた短時間の自己蛍光消光は、赤血球が豊富な領域でもタンパク質共局在化およびNET検出の感度を有意に増加させることがわかった(図5B、矢印)。
図1:心原性動脈血栓塞栓症を有する猫からの解剖大動脈分岐の代表的な壊死写真。(A) 下降大動脈は大動脈分岐に4〜5cmの頭蓋(Cr)を解剖した。(B) 深膜は、大動脈の降下(1)と腸骨動脈(2,3)が尾側の側面(Cd)ではっきりと見えるまで慎重に解剖された。大動脈分岐内の血栓(*)に注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ネコ大動脈分岐内で見られる血栓中のNETの代表的な相コントラストおよび免疫蛍光画像。(A)位相差顕微鏡は、大間に近い離散的で、よく分離した構造として血栓を明らかにした。DNA(青)の相コントラストと蛍光染色を組み合わせることで、血栓内に白血球および無細胞DNAが存在することを示した。箱入り領域は、無細胞DNAの大規模な濃度で構成されています。オリジナルの10倍の倍率;スケールバー=400μm(B)(A)の箱入り領域は20倍でさらに拡大した。BDAPI(青)で染色された無細胞DNAと細胞内DNA、好中球エラスターゼ(NE)、およびシトルリン化ヒストンH3(citH3)がそれぞれ緑色と赤色に現れた。(元の20倍の倍率;スケールバー= 100 μm)。(C)NETsは、無細胞DNAの共局在化に基づいて同定され、細胞外NE、およびcitH3が、輪郭(点線)に概説された。元の40倍の倍率;スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:H&Eおよび免疫蛍光染色を用いたネコ動脈血栓の代表的な画像。(A) H&E染色では、好中球と赤血球の濃度が高く見えた。細胞外クロマチンは、赤血球および好中球に囲まれた様々な長さの深い紫色の糸として現れた(点線の輪郭、黒い矢印)。(B)好中球細胞外トラップを同じ血栓(点線輪、白矢印)上の免疫蛍光顕微鏡を用いて容易に可視化した。NETsは、cfDNA(青)、NE(緑)、およびcitH3(赤)の共局在化として同定された。オリジナルの20倍の倍率;スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:大動脈分岐の代表的な位相コントラストおよび免疫蛍光画像。(A)動脈血栓症のない猫における大動脈分岐の位相コントラストおよび免疫蛍光画像動脈血栓症のない猫からの大動脈分岐の内腔内に血栓または好中球の凝集が存在しないことに注意してください。(B)心原性動脈血栓塞栓症と診断された猫における大動脈分岐の相コントラストおよび免疫蛍光画像大動脈分岐は、DNA(青)、好中球エラスターゼ(緑色)、およびヒストンH3(赤)をシトルリン化した。この場合、血管壁に膨らみ、大動脈内腔の大部分を占めるよく分かれた血栓が、心原性動脈血栓塞栓症を有する猫に注目された。CFDNA、NE、およびcitH3の共局在化を特徴とするNETsは、血栓内で同定された(点線輪)。オリジナルの10倍の倍率;スケールバー= 400 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2匹の猫からの動脈血栓の代表的な位相コントラスト(PC)および免疫蛍光画像。このスライドは、citH3、NE、およびDNAについて染色し、488nm(赤)、595nm(緑色)、および357nm(青)の波長でそれぞれ40倍の倍率で画像化した。猫の心原性動脈血栓は赤血球(*,点線)が豊富にあった。(A)赤血球からの自己蛍光は488nm波長にわたって最も顕著であり、共局在化シグナルの検出およびNETsの同定を減少させる。(B) 特に赤血球の濃度が高い領域(*,点線)において、488nm波長の自己蛍光を大幅に減少させた。赤血球(スケールバー=200μm)の存在下で共局化タンパク質、citH3、および好中球エラスターゼ(矢印頭)の検出を増強した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:猫由来の動脈血栓の代表的な免疫蛍光画像。この切片は、DNA(青)、citH3(赤)、およびミエロペルオキシダーゼ(A)または好中球エラスターゼ(B)のいずれかに染色された。(A)ネコ特異的なミエロペルオキシダーゼ抗体(MPO、1:5)を利用したにもかかわらず、MPOの染色強度は悪いままであった。(B)多種と交差反応することが知られているポリクローナル好中球エラスターゼ(NE)抗体を用いて、免疫反応性および染色強度が有意に高かった。NE(矢印)に囲まれた好中球の特徴的な結ローブ核に注意してください。元の40倍の倍率;スケールバー= 100 μm.こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
| ブロッキング バッファ | 組成 | |
| 1 | TWEEN-20、0.1%NP40、5%ヤギ血清 | |
| 2 | TWEEN-20、10%ウサギ血清、0.1%NP-40のTBS | |
| 3 | TWEEN-20、5%BSA、0.1%NP-40のTBS | |
表1:免疫蛍光に用いるブロッキング緩衝剤の組成。
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Discussion
我々は、二重免疫標識プロトコルおよび免疫蛍光顕微鏡を用いて、固定ネコ心原性動脈血栓におけるNETを同定するためのプロトコルを記述する。心原性動脈血栓のみが染色されたが、理論的には、このプロトコルは他のタイプの血栓および他の獣医種に使用することができる。ネコの動脈血栓内のNETの同定は、NETが猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。
固定およびパラフィン埋め込み組織における免疫蛍光によるNETの検出は、H&Eのような従来の組織学的染色よりも優れているが、これはしばしば好中球13に囲まれたクロマチンの糸を示す。固定動脈血栓の免疫細胞化学および免疫蛍光は、citH3のようなcfDNAおよび他の細胞外タンパク質の同時検出を可能にする、NETs形成18、19に特異的であることが知られている。19組織や血栓のNET検出には凍結製剤が最適ではないため、4%ホルムアルデヒドと10%メタノールを含む10%中性緩衝ホルマリンにサンプルを保存しました。無細胞核酸はホルムアルデヒドによって直接固定されるわけではない。代わりに、それらは、ホルムアルデヒド20によって誘導される部分的に可逆的なメチレンブリッジ架橋によって変化される固定タンパク質構造内で固定化される。ホルムアルデヒドの酸化によって生成されるギ酸およびケトンによって引き起こされるアーティファクトおよび自己蛍光をさらに制限するために、研究者は固定のために緩衝液で希釈されたメタノールフリーのパラホルムアルデヒドを使用することを選択することができる。固定の持続時間は免疫反応性に影響するため、脱水およびパラフィン埋め込み前に24時間以下の固定を推奨します。パラフィン埋め込まれた組織または血栓は、脱パラフィン化および染色のために保存することができる。
ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドによる化学的固定は、タンパク質の三次構造を変化させ、目的の抗原をマスキングし、特異的エピトープ21への抗体の結合を防止する。抗原検索はメチレンブリッジ架橋を断ち切るプロセスであり、ホルマリン固定組織で免疫検出を行う前に不可欠である。著者らの経験に基づいて、軽度の間接加熱を用いたアルカリ検索溶液(トリス/EDTAバッファーのpH = 9)を用いた熱誘導抗原検索は、人工物や自己蛍光を最小限に抑えながらタンパク質およびNETの検出を強化する。タンパク質の変性は非特異的結合およびバックグラウンドノイズを引き起こす可能性があるため、抗原検索溶液の温度は沸点(>100°C)に達してはならない。
固定血栓におけるNET同定の制限は、免疫蛍光染色が異なる抗原検索条件18の下で高い可変性を持つことができることである。Brinkmannらが見つけた結果と比較して、より高いインキュベーション温度(>55°C)が核中のヒストンの最適な染色をもたらし、縮解したクロマチン19を発見した。しかし、好中球やNETに見られる粒状タンパク質であるミエロペルオキシダーゼの染色強度は、提案された条件下で低いことがわかりました。骨髄ペルオキシダーゼの免疫反応性が悪かったのは、ネコ特異的抗体を用いたにもかかわらず一貫していた(補足図1)。したがって、我々は、対象となる抗原に基づいて満足のいくシグナルを得るために、抗原の取得プロセスの持続時間および条件(例えば、pH、温度)を変更することを研究者に奨励する。
獣医種におけるNETの同定の課題の1つは、種特異的抗体の欠如である。同種由来の一次抗体を用いた際の干渉を防ぐために、高濃度のウサギ免疫グロブリンを利用して、ヤギの抗ウサギ二次抗体上の残りの結合部位を飽和させる追加のブロッキングステップを含めた。この手法の主な欠点は、複数のインキュベーションステップを必要とするため、時間がかかることです。研究者は、いずれかの免疫標識ステップからの二次抗体がその一次抗体に特異的に結合することを確実にするために、2番目の免疫標識ステップでいずれかの一次抗体を除外する2つの異なるコントロールを含めるべきである。同定されたNET構造の特異性は、DNase消化またはCATEを含まない猫からの大動脈分岐からなる生物学的制御の包含によってさらに検証することができる(図5)。さらに、一次抗体と同じアイソタイプ対照抗体の濃度からなる陰性対照は、非特異的抗体相互作用、Fc受容体への非特異的結合、および細胞自己蛍光を排除するために含まれるべきである。研究者は、種特異的抗体の入手可能性に基づいてこのプロトコルを変更することをお勧めします。種特異的抗体が利用できない場合は、まず免疫細胞化学を用いて抗体の免疫反応性を評価するか、相同性に関心のある種から参照されるトランスクリプトまでのタンパク質転写物を評価することを勧めます。
サンプル固定、不十分な脱パラフィン、および特定の組織成分の存在などの要因は、血栓の自己蛍光につながる可能性があります。アルデヒド固定の間、アミンはアルデヒドと結合してシッフ塩基複合体を形成し、これは蛍光22を放出する。不完全な脱パラフィンは、組織中のタンパク質を化学的に修飾し、自己蛍光23を作成することもできる。コラーゲン、エラスチン、赤血球などの血管サンプル中の細胞外成分は、哺乳動物24,25,25において自然に蛍光を発すると報告されている。自然またはiatro原性の自己蛍光は、緑色の波長(励起= 488 nm、発光=500〜550 nm)で最も顕著であるため、遠赤色蛍光体の使用は、いくつかの自己蛍光を最小限に抑えることができる26。本プロトコルでは、自発蛍光組織元素に静電的に結合するように設計された市販の自己蛍光消光キットを利用した。メーカーの推奨値5 minは、タンパク質の免疫反応性が低下する可能性があるため、研究者は自家蛍光の活性化期間を最適化することをお勧めします。あるいは、調査官はまた、スーダンブラックB、3,3'-ジアミノベンジジンまたはトリパンブルー27を使用して自家蛍光を減衰させることができます。
NETは血栓内に異種で分布しているため、大動脈と腸骨動脈全体の完全なマッピングが推奨されます。cfDNA、citH3、NEに陽性の領域が拡大されます。cfDNA、citH3、NEの共局在化は、NET形成を同定し、他の形態の細胞死との間でネット形成を区別するために広く使用されてきた。NETが冠状動脈血栓の周囲に集中することを発見した最近のヒト研究とは異なり、ネコ動脈血栓中のNETの大部分は血栓28の頭蓋の側面に集結した。NET を識別するために標準化されたプロトコルを使用しましたが、NET の顕微鏡的評価と定量は主観的なままです。ここでは、微視的解析中の観察者の偏りを最小限に抑えるために、盲目で体系的な方法を用いた。サンプル中のNETの数は好中球の数によって影響を受ける可能性があるため、核形態、細胞径、好中球特異的タンパク質の発現に基づいて好中球を同定することで、好中球の数に対するNETを定量化することができます。顕微鏡を用いたネット識別のもう一つの課題は、NETが不明確なマージンを有し、それらが結合する傾向があり、ネビュラス構造を形成するということです。これにより、特定のサンプルの NET 数が過少または過大評価される可能性があります。したがって、DAPIの代わりに、NETsは、NETs形成からの細胞付加DNAのより明確な同定と表記のためにシトックスグリーンを使用して染色することができる。
我々は、パラフィン埋め込まれたネコ動脈血栓中のNETを同定するための二重免疫標識プロトコルを開発した。citH3およびNEの免疫標識の前に、脱パラフィン化、水分補給、および抗原検索を行う必要があります。このアッセイは、ネコのNET形成を研究するための貴重なツールとなり、猫におけるCATEの病態生理学をよりよく理解することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、カリフォルニア大学デービスコンパニオンアニマルヘルスセンター(CCAH 2018-30-F)からの資金によって支えられました。著者らは、ケビン・ウーラード博士が蛍光顕微鏡を使用することを認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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