Summary
우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.
Abstract
무세포 DNA(cfDNA)와 히스톤 및 호중구 엘라스타아제(NE)와 같은 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NETs)은 전신 염증이나 병원체에 반응하여 호중구에 의해 방출됩니다. NET는 이전에 인간과 개에서 혈전 형성을 증가시키고 섬유소 용해를 억제하는 것으로 나타났지만, 비대성 심근증에 이차적인 생명을 위협하는 합병증인 심인성 동맥 혈전색전증 (CATE)을 가진 고양이의 NET의 역할 을 참조하십시오. 고양이의 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하고 정량화하는 표준화된 방법은 CATE에서의 병리학적 역할에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 여기에서, 우리는 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 혈전에서 NET를 식별하는 기술을 설명합니다 대동맥 분기 내에서, 부검 중에 추출. 자일렌으로 탈파화 한 후, 대동맥 절은 간접 열 유발 항원 검색을 시행했다. 단면도는 그 때, 투과되고, ex vivo NETs는 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 무세포 DNA (cfDNA), 시트룰린화된 히스톤 H3(citH3), 및 호중구 엘라스타제(NE)의 공동 국소화에 의해 확인되었다. 혈전에서 NET의 면역 검출을 최적화하기 위해, 조직 원소의 자가형광은 현미경 검사법 전에 자가형광 담금질 과정을 사용하여 제한되었다. 이 기술은 그밖 종에 있는 NETs 그리고 혈전증을 공부하는 유용한 공구일 수 있고 이 복잡한 조건의 병리생리학에 새로운 통찰력을 제안합니다.
Introduction
비대성 심근병증을 가진 고양이는 생명을 위협하는 혈전색전성 합병증1,,2의위험이 있습니다. 고양이 심인성 동맥 혈전 색전증 (CATE)과 관련된 높은 사망률및 사망률에도 불구하고 고양이의 CATE의 근본적인 병리학은 제대로 이해되지 않습니다. 이 치명적인 상태의 위험에 고양이를 치료하고 식별하는 제한된 진단 및 치료 도구도 있습니다3.
선천성 면역에 있는 그것의 역할 이외에, 호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NETs)를 풀어 놓음으로써 혈전증에 있는 역할을 하기 위하여 보였습니다, 이는 호중구 엘라스타제 (NE) 및 골수로파소와 같은 히스톤과 과립 단백질로 둘러싸인 무세포 DNA (cfDNA)의 웹 같은 네트워크인. 호중구는 전신 염증, 병원균과의 직접적인 만남 및 활성화 된 혈소판과의 상호 작용에 대한 응답으로 NETs 형성을 겪습니다4,,5,6,,7. 개에서 호중구 유래 DNA는 응고 용해를 억제하는 것으로 나타났으며 NET 단백질은 혈전 형성을 가속화합니다. 순환 세포 및 응고 성분을 트랩하는 NET의 능력은 또한 혈전 특성8,,9,10,,11,,12의핵심입니다.,
NET는 세포외 호중구 단백질, 히스톤 및 cfDNA의 동국화에 의해 검출됩니다. 이 때문에, 탈파라핀화된 조직의 면역형광에 의한 고정된 조직에서 의한 NET의 식별 및 정량화는 밝은 필드 현미경 을 사용하여 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 얼룩보다 우수하다4,,5. 면역형광 현미경을 이용한 여러 인간 연구는 관상동맥 혈전, 대뇌 뇌졸중 혈전, 아테로스롬보증 및 정맥혈전13,,14,,15,,16,,17의구조적 성분으로 NETs를 확인하였다. 현재까지, 고양이 혈전에서 NET를 검출하고 정량화하는 표준화된 방법은 기술되지 않았다. 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하면 NET및 혈전증의 향후 번역 연구를 촉진 할 수 있기 때문에, 우리는 고양이의 파라핀 내장 동맥 혈전에서 NET 식별 및 평가의 기술을 설명합니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학교 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 조직의 부검 및 생검은 소유자의 동의하에 수행되었습니다.
1. 조직 고정, 포함 및 단면화
- 내림차순 대동맥, 대퇴 동맥 및 일반적인 선장동맥(그림1A)을포함한 대동맥 분기를 해부하고, 인도적인 안락사 또는 사망 직후에 해부한다. 무딘 근막(그림 1B)을해부하기 전에 10 % 중성 완충 포르말린에 완전히 담그기 전에 최소 24 시간 및 48 시간 이하.
- 시료를 탈수시키기 위해, 먼저 10% 중성 완충포르민에 1시간 동안 37°C로 가열하여 침수한다. 그런 다음 37 °C (70 %, 95 %, 100 %)로 가열 된 에탄올농도가 증가하면 침수됩니다. 각각 1 시간 동안 2 x. 마지막으로, 헹구지 않고, 각각 1시간 동안 37°C로 가열된 100% 톨루엔에 2x를 담급전시.
- 62°C로 가열된 파라핀을 넣고 파라핀이 밤새 완전히 굳어지도록 합니다.
- 파라핀 내장 조직의 섹션 2-3 μm는 마이크로토메를 사용하여 양전하 유리 슬라이드위에 놓습니다. 추가 분석이 될 때까지 단면 조직을 -80 °C에서 저장합니다.
2. 탈파화, 재수화 및 열 유발 항원 회수
- 유리 슬라이드에 섹션의 탈파화 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 놓고 다음 순서로 처리하십시오.
- 3 분 동안 100 % 자일렌에 완전히 잠기. 이 단계를 2x 반복하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.
- 에탄올 농도 감소 (100 %, 95 %, 70 %) 완전히 침수 실온(RT)에서 3분 동안 3회 사용하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.
- 탈이온수에서 2분 동안 완전히 물에 담그다.
- 트리스 버퍼링 식염수에 0.1 % 트위넨 (TBST, pH = 7.6)을 2-3 분 동안 넣습니다.
- 100 °C로 가열 된 탈이온수로 저수지를 채웁니다. 증기선 챔버가 20분 동안 평형화되도록 하십시오.
참고: 열 유도 항원 회수는 식품 증기선과 같은 미리 설정된 온도 설정을 가진 증기선에 의해 생성된 간접 가열로 가장 잘 수행됩니다. - 트리스 및 EDTA(pH=9)를 함유하는 시판되는 항원 회수 용액을 일정한 교반과 함께 온도 제어 핫 플레이트상에서 95-97°C로 가열한다. 끓지 않는지 확인하십시오.
참고: 솔루션이 따뜻해지면 흐려져야 합니다. - 가열된 항원 회수 용액을 슬라이드 용기에 붓고 용기를 증기선 의 챔버에 놓습니다. 항원 회수 용액이 증기선 의 온도에 3-4 분 동안 평형화되도록 허용하십시오.
- 가열 된 항원 회수 용액에 슬라이드를 완전히 담그고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속하십시오.
- 증기선에서 슬라이드 용기를 제거하고 슬라이드 및 항원 회수 용액을 RT로 냉각시키십시오. 희석된 항원 회수 용액을 4°C에 저장하고 필요한 경우 최대 2x까지 재사용하십시오.
- 슬라이드를 TBST로 3x로 5분 동안 씻습니다.
3. 면역 표지 및 자동 형광 담금질
참고: 표 1에서는 다음 단계에서 사용되는 차단 버퍼의 구성에 대해 자세히 설명합니다.
- 완만한 흔들림(30-50rpm)에서 RT에서 2시간 동안 블로킹 버퍼 1의 섹션을 인큐베이션합니다. 건조를 피하기 위해 파라핀 필름으로 밀봉하십시오.
- 세척하지 않고, 희석된 토끼 폴리클로날 항인간 시트룰린화 히스톤 H3(citH3) 항체(블로킹 버퍼 1에서 희석된 0.03 mg/mL)를 슬라이드에 직접 100 μL을 직접 바릅니다.
- 각 섹션에 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13-0.17 mm)을 배치하여 항체 혼합물을 균일하게 분배합니다.
- 부드러운 흔들림 (30-50 rpm)으로 4 °C에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 건조를 피하기 위해 파라필름 필름으로 밀봉하십시오.
- TBST로 3x를 5분 동안 씻으소서.
- 3.3단계에서 설명한 바와 같이 100 μL의 염소 항토끼 항체를 알렉사 플루어 488(0.04 mg/mL 또는 차단 완충액 1에서 1:50의 최종 농도로 희석)에 공액화하. 부드러운 흔들림 (30-50 rpm)에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다.
- TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
- 완충완충2에서 밤새 4°C에서 부드러운 흔들림(30-50 rpm)으로 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하십시오.
- TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
- 완충3의 블로킹 섹션은 RT에서 2시간 동안 완만한 흔들림(30~50rpm)에 대해 3.3단계에서 설명한 대로.
- 생체 응모형 폴리클로날 토끼 항인간 NE 항체(최종 농도 = 차단 완충액 3에서 0.2 μg/mL)를 단계 3.2-3.4에 기재된 바와 같이 12-16시간 동안 4°C에서 배양한다.
- TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.
- RT에서 3.2-3.3 에 대해 3.2-3.3 단계에 설명된 대로 Alexa Fluor 594 스트렙타비딘 접합체(블로킹 버퍼 3에서 0.02 mg/mL로 희석)로 배양하여 건조를 방지하기 위해 파라핀으로 보호하고 밀봉합니다.
- TBST 1x로 5분 동안 씻으소서.
- 100 μL의 자동 형광 담금질 용액 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 1 분 동안 섹션에 직접 적용하십시오.
- 즉시 10 분 동안 TBST 6x로 슬라이드를 씻으십시오.
- 각 슬라이드를 300 nM DAPI의 100 μL로 어둠 속에서 5 분 동안 덮습니다.
- TBST로 3분 동안 씻으면 총 5x동안 반복합니다.
- 안티페이드 장착 매체의 드롭(~50 μL)을 오토플루오르전 담금질 키트의 일부를 섹션 주변의 유리 슬라이드에 직접 바하십시오. 기포를 만들지 않고 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13~0.17mm)을 부드럽게 섹션에 놓습니다.
- 침지 렌즈로 현미경 분석을 위해 장착 매체가 경화될 때까지 시료가 4°C에서 어두운 환경에서 밤새 경화될 수 있도록 하십시오.
4. 호중구 세포 외 트랩 식별
참고: 다음 프로토콜은 1,280 x 960 디지털 CCD 카메라가 있는 반전된 epifluorescence 현미경을 사용합니다(재료 표참조).
- 혈전을 찾으려면, 10배 의 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 대동맥, 대동맥 분기 및 각 대퇴 동맥의 길이를 따라 두개골을 스캔합니다. 혈전은 상 대비 및 밝은 필드 현미경 검사법에 내피에 인접한 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 조직의 conglomeration이다(그림 2A, 도 2B).
- 먼저 10x 및 20x목표(그림 2C)를사용하여 DAPI 채널(여기 = 357/44nm)을 사용하는 NET 섹션을 검사합니다. cfDNA는 단계 대조 또는 밝은 필드 현미경 검사법에 볼 때 세포의 세포질의 경계 안에 있지 않은 decondensed DNA로 나타납니다.
- 텍사스 레드 채널(여기 = 585/29 nm, 방출 = 628/32 nm)과 녹색 형광 단백질 채널(여기 = 470/22 nm, 방출 = 525/50 nm)에서 세포외 NE 및 citH3을 각각 10, 20 및 40x 목표와 식별합니다.
- 이미지 J(NIH)와 같은 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 혈전 내의 NET를 평가하고 분석합니다. NET 형성은 앞서 설명한 바와 같이 cfDNA, 세포외 citH3 및 NE의 공동 국소화에 기초하여 확인된다18. 픽셀 강도의 채도를 피하기 위해 이미지 수집 을 통해 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다.
- 대역에서 가장 가까운 영역 1, 대공에서 가장 먼 영역 3, 영역 1과 3 사이의 영역 2로 나누어 내림차순 대원과의 근접성을 기반으로 각 혈전을 매핑합니다. 작업자가 각 과목의 건강 상태를 눈멀게 하면 각 구역에서 최소 10개의 무작위 필드를 가져가십시오. 각 영역에서 NET이 있는 필드의 수를 평균화하거나 영역당 평균 NET 점유 영역을 계산하여 트롬비에서 NET 분포를 특성화합니다.
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Representative Results
파라핀화, 열 유발 항원 회수 및 파라핀 내장 트롬비의 이중 면역 라벨링을 위해 이 프로토콜을 사용하여 고양이 CATE에서 처음으로 NET를 확인했습니다. 대동맥 분기 내의 Thrombi는 표준 H&E 염색 및 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 형광 현미경 검사법 및 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 위치했습니다. 밝은 필드 현미경 검사법에, 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 이루어져 있습니다(그림 3A). H&E는 특정 NET 구성 요소를 더럽히지 못하지만, NET는 근처의 적혈구와 백혈구를 둘러싼 다양한 길이의 깊은 보라색 스레드네트워크로 자주나타났습니다(그림 3A,점선 윤곽선). 혈전은 상 대비 현미경 검사법에 대한 혈관 공간 내에서 잘 비경계구조로 특징지어졌다(도2A, 도 4B). 우리는 면역형광 현미경 검사법에 의해 이 지역 내의 NET의 존재를 추가로 확인했습니다(그림 3B). 이들 영역의 배율은 CFDNA, 세포외 citH3 및NE(그림 2C, 그림 3B,흰색 점선 윤곽선)로 구성된 NET의 큰 골재를 밝혀냈다. 동일한 기술을 사용하여 CATE가없는 고양이의 혈전과 NET를 검색할 때, 우리는 lyzed neutrophils의 시트가 내피에 가까운 거리에서 때때로 검출 될 수 있음을 발견했습니다. 이러한 호중구는 NET 형성의 일부 형태학적 특성을 나타내었지만 조직된 혈전과 연관되어서는 안됩니다. 우리는 어떤 대조군 샘플에서 어떤 혈전도 확인하지 않았다(도 4A).
그림 5A는 녹색(488nm) 파장에서 이미지화할 때 적혈구 및 콜라겐과 같은 응고 원소의 심오한 자가형광을 보여 주며, 이는 cfDNA 및 단백질 동국화를 검출하는 우리의 능력을 방해합니다. 우리는 면역 표지 를 한 후에 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 짧은 autofluorescence 담금질이 적혈구의 풍부한 지역에서조차 단백질 coLOCALization 및 NET 검출의 감도를 현저하게 증가한다는 것을 것을을 발견했습니다(그림 5B,화살촉).
그림 1 : 심인성 동맥 혈전 색전증을 가진 고양이의 해부 된 대동맥 분기의 대표적인 부검 사진. (A)내림차순 대동맥을 대동맥 분기로 4-5 cm 두개골(Cr)으로 해부하였다. (B)근막은 내림차순 대동맥(1)과 장골 동맥(2,3)이 꼬리 양상(Cd)에서 명확하게 볼 수 있게 될 때까지 조심스럽게 해부하였다. 대동맥 분기(*) 내의 혈전을 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고양이 대동맥 분기 내에서 발견되는 혈전에서 NET의 대표적인 상 대조 및 면역형광 이미지. (a)위상 조영현미경은 대단에 가까운 이산및 잘 구분된 구조로서 혈전을 밝혀냈습니다. DNA(청색)의 결합된 상 대조 및 형광 염색은 혈전 내의 백혈구 및 무세포 DNA의 존재를 보여주었다. 박스형 영역은 무세포 DNA의 큰 농도로 구성됩니다. 원래 10배 배율; 스케일 바 = 400 μm.(B)(A)의 박스화된 영역을 20배에서 더 확대하였다. 무세포 DNA및 DAPI(청색), 호중구 엘라스타아제(NE), 및 시트룰린히톤 H3(citH3)로 염색된 무세포 DNA는 각각 녹색과 적색으로 나타났다. (원래 20 배율; 축척 막대 = 100 μm). (C)무세포 DNA, 세포외 NE 및 citH3의 동국화에 기초하여 확인된 NETs는, 윤곽을 그어(점선)하였다. 원래 40 배율; 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: H&E 및 면역형광 염색을 이용한 고양이 동맥 혈전의 대표적인 이미지. (A)H&E 얼룩에, 호중구및 적혈구의 다농도가 보였다. 세포 외 크로마틴은 적혈구와 호중구 (점선 윤곽선, 검은 색 화살표)로 둘러싸인 다양한 길이의 깊은 보라색 실로 나타났습니다. (B)호중구 세포외 트랩은 동일한 혈전(점선 윤곽선, 흰색 화살표)에 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 쉽게 가시화되었다. NET는 cfDNA (파란색), NE (녹색) 및 citH3 (빨간색)의 공동 지역화로 확인되었다. 원래 20배 배율; 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대동맥 분기의 대표적인 상 대조 및 면역 형광 이미지. (a)동맥 혈전증이없는 고양이에서 대동맥 분기의 위상 대비 및 면역 형광 이미지. 동맥 혈전증이없는 고양이로부터대동맥 분기의 내심 내외에서 혈전또는 호중구 응집체가 없다는 점에 유의하십시오. (B)심인성 동맥 혈전색전증으로 진단된 고양이의 대동맥 분열의 위상 대조 및 면역형광 이미지. 대동맥 분기는 DNA(청색), 호중구 엘라스타아제(녹색), 및 시트룰린히톤 H3(적색)에 대해 염색되었다. 이 경우, 혈관 벽으로 부풀어 오르고 대동맥 루멘의 대부분을 차지하는 잘 경계된 혈전은 심인성 동맥 혈전색전증을 가진 고양이에서 지적되었다. cfDNA, NE 및 citH3의 공동 국소화를 특징으로 하는 NET는 혈전(점선 윤곽선) 내에서 확인되었다. 원래 10배 배율; 배율 표시줄 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 두 마리의 고양이로부터의 대표적인 상 대조(PC) 및 면역형 광의 동맥 혈전 이미지. 슬라이드는 citH3, NE 및 DNA에 대해 염색되었고 40x 배율에서 각각 488 nm (빨간색), 595 nm (녹색) 및 357 nm (파란색) 파장에서 이미지화되었습니다. 고양이의 심인성 동맥 혈전은 적혈구 (*, 점선)가 풍부했습니다. (A)적혈구로부터의 자가형광은 488 nm 파장에서 가장 두드러졌으며, 동국화 신호의 검출 및 NET의 식별을 감소시켰다. (B)담금질은 488 nm 파장에서, 특히 적혈구 (*, 점선)의 높은 농도가있는 지역에서 크게 감소 된 자기 형광을 감소시켰다. 적혈구 (스케일 바 = 200 μm)의 존재에서 동국화 단백질, citH3 및 호중구 엘라타아제 (화살촉)의 검출을 향상시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 고양이로부터의 동맥 혈전의 대표적인 면역형광 이미지. 단면도는 DNA(청색), citH3(적색), 및 골수페록시다아제(A) 또는 호중구 엘라스타제(B)에 대해 염색되었다.AB (a)고양이 특이적 골수페록시다아제 항체(MPO, 1:5)를 활용함에도 불구하고 MPO의 염색 강도는 여전히 불량한 채로 남아 있었다. (b)다종과 교차 반응하는 것으로 알려진 폴리클로날 호중구 엘라스타제(NE) 항체를 사용하여, 면역반응성 및 염색 강도가 현저히 높았다. NE (화살표)로 둘러싸인 호중구의 특징적인 lobulated 핵을 주목하십시오. 원래 40 배율; 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 차단 | 구성 | |
| 1 | 결핵0.1% 트웬-20, 0.1% NP40, 5% 염소 세럼 | |
| 2 | TBS 0.1% 트웬-20, 10% 토끼 세럼, 0.1% NP-40 | |
| 3 | 결핵 0.1% 트웬-20, 5% BSA, 0.1% NP-40 | |
표 1: 면역형광에 사용되는 차단 완충제의 조성.
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Discussion
우리는 이중 면역 표지 프로토콜 및 면역 형광 현미경 검사법을 사용하여 고정 된 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 비록 심인성 동맥 혈전만 얼룩이 있었지만, 이론적으로이 프로토콜은 다른 유형의 트롬비와 다른 수의종에 사용될 수 있습니다. 고양이 동맥 혈전 내의 NET를 식별하는 것은 NET가 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
고정 및 파라핀 내장 조직에서 면역형광에 의한 NET의 검출은호중구(13)로둘러싸인 염색질의 실을 종종 보여주는 H&E와 같은 기존의 조직학적 얼룩보다 우수하다. 고정 된 동맥 혈전의 면역 조직 화학 및 면역 형광은 CitH3와 같은 cfDNA 및 기타 세포 외 단백질의 동시 검출을 허용하며, NETs 형성18,,19에특이적인 것으로 알려져 있다. 저온 제제는 조직과 트롬비에서 NET 검출에 최적이 없기 때문에 4 % 포름 알데히드와 10 % 메탄올을 포함하는 10 % 중성 완충 포르말린으로 샘플을 보존했습니다. 무세포 핵산은 포름알데히드에 의해 직접 고정되지 않습니다. 대신, 그들은 포름알데히드20에의해 유도된 부분적으로 가역가능한 메틸렌 브리지 가교에 의해 변경되는 고정된 단백질 구조물 내의 고정됩니다. 포름알데히드의 산화에 의해 생성된 포름산과 케톤에 의한 유물 및 자가형광을 더욱 제한하기 위해, 조사자들은 고정을 위해 완충액에서 희석된 메탄올 프리 파라포름알데히드를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 고정 기간은 면역 반응성에 영향을 미치기 때문에 탈수 및 파라핀 포함 전에 24 시간 이상 고정하는 것이 좋습니다. 파라핀 내장 된 조직 이나 혈전 다음 탈 파 라 핀 화 및 염색에 대 한 저장 될 수 있습니다.
포름알데히드와 파라포름알데히드에 의한 화학적 고정은 단백질의 삼차 구조를 변화시키고, 관심 있는 항원을 마스킹하고 특정에피토프(21)에대한 항체의 결합을 방지한다. 항원 검색, 메틸렌 다리 가교를 나누는 과정은, 포르말린 고정 조직에서 면역 검출을 수행하기 전에 필수적이다. 저자의 경험에 기초하여, 알칼리성 회수 용액 (트리스 / EDTA 버퍼에서 pH = 9)을 사용하여 열 유발 항원 검색은 유물과 자가 형광을 최소화하면서 단백질과 NET의 검출을 향상시킵니다. 단백질의 변성은 비특이적 결합 및 배경 잡음으로 이어질 수 있기 때문에 항원 회수 용액의 온도는 비등점 (>100 °C)에 도달하지 않아야합니다.
고정 혈전에서 의 NET 식별의 한계는 면역형광 염색이 상이한 항원 회수조건(18)하에서매우 가변적일 수 있다는 것이다. Brinkmann 외에 의해 찾아낸 결과에 비교하면, 우리는 더 높은 배양 온도 (>55°C)가 핵에 있는 히스톤의 최적 염색 귀착되고 염색질염색체 19를초래한다는 것을 것을을 발견했습니다. 그러나, 우리는 neutrophils와 NETs에서 찾아낸 과립 단백질인 myeloperoxidase의 염색 강렬이 제안된 조건의 밑에 낮다는 것을 것을을 발견했습니다. 골수페록시다아제의 불량한 면역반응성은 고양이 특이적 항체의 사용에도 불구하고 일관되게하였다(보충도 1). 따라서, 당사는 항원 검색 과정의 지속 기간 및 조건(예를 들어, pH, 온도)을 수정하여 관심 있는 항원기반에 기초하여 만족스러운 신호를 산출하도록 조사자가 권장한다.
수의학 종에서 NET를 식별하는 과제 중 하나는 종 특정 항체의 부족입니다. 동일한 종에서 유래한 1차 항체를 사용할 때 발생하는 간섭을 방지하기 위해 염소 항체 이차 항체에 남아있는 결합 부위를 포화시키기 위해 고농도의 토끼 면역글로불린을 활용하는 추가차단 단계를 포함시켰다. 이 기술의 주요 단점은 여러 배양 단계가 필요하기 때문에 시간이 많이 걸린다는 것입니다. 조사원은 제2 면역표지 단계 중 어느 한 쪽의 원발성 항체를 배제하는 2개의 상이한 대조군을 포함해야 하며, 이는 면역표지 단계중 어느 하나에서 이차 항체가 그의 1차 항체에 특이하게 결합되도록 한다. 확인된 그물 구조의 특이성은 DNase 소화 또는 CATE 없이 고양이로부터의 대동맥 분열로 이루어진 생물학적 조절의 포함에 의해 추가로 검증될 수있다(도 5). 또한, 1차 항체와 동일한 농도의 이소타입 조절 항체로 구성된 음성 대조군이 비특이적 항체 상호작용, Fc 수용체에 대한 비특이적 결합, 및 세포 자가형광을 배제하기 위해 포함되어야 한다. 조사자는 종 특정 항체의 가용성에 근거를 둔 이 프로토콜을 수정하는 것이 좋습니다. 종 특이적 항체를 사용할 수 없는 경우, 먼저 면역세포화학을 사용하여 항체의 면역반응성을 평가하거나 참조된 전사체에 대한 상동성종으로부터 의 단백질 전사체를 평가하는 것이 좋습니다.
견본 고정, 부적당한 탈파핀화 및 특정 조직 분대의 존재같이 요인은 혈전에서 자동 형광으로 이끌어 낼 수 있습니다. 알데히드 고정 동안, 아민은 알데히드와 결합하여형광(22)을방출하는 쉬프 염기 복합체를 형성할 수 있다. 불완전한 탈파라핀화는 또한 조직 내의 단백질을 화학적으로 변형시켜자가형광(23)을생성할 수 있다. 콜라겐, 엘라스틴 및 적혈구와 같은 혈관 샘플의 세포외 성분은 포유류24,,25에서자연적으로 형광에 보고된다. 자연 또는 불성 자가형광은 녹색 파장에서 가장 두드러지기 때문에 (여기 = 488 nm, 방출 = 500-550 nm), 원적외선 형광단의 사용은 일부 자가형광을 최소화할 수 있다26. 본 프로토콜에서, 우리는 정전기적으로 자동형광 조직 요소에 결합하도록 설계된 시판되는 자동형광 담금질 키트를 이용했다. 5분의 제조업체의 권고가 덜 풍부한 단백질의 면역 반응성을 감소시킬 수 있기 때문에 연구자들은 자가형광 담금질 기간을 최적화하는 것이 좋습니다. 또는, 수사관은 수단 블랙 B, 3,3'-디아미노벤지딘 또는 트라이판 블루27을사용하여 자동 형광을 약화시킬 수 있습니다.
NET는 혈전 내에 이질적으로 분포되기 때문에 전체 대동맥과 장골 동맥을 철저히 매핑하는 것이 좋습니다. cfDNA, citH3 및 NE에 대한 양수 영역은 확대됩니다. cfDNA, citH3 및 NE의 공동 국소화는 그물 형성을 확인하고 다른 형태의 세포 사멸과 그물 형성을 구별하는 데 널리 사용되어 왔다. NET가 관상 동맥 혈전의 주변에 집중되는 것을 발견한 최근 인간 연구와는 달리, 고양이 동맥 혈전의 대부분의 NET는 혈전28의두개골 측면에 군집되었다. 우리는 NET를 식별하기 위해 표준화 된 프로토콜을 사용했지만, NET의 현미경 평가 및 정량화는 주관적으로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 현미경 분석 중 관찰자 편향을 최소화하기 위해 맹목적인 체계적인 방법을 활용했습니다. 샘플내의 NET 수는 호중구의 수에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 조사자들은 핵 형태, 세포 직경 및 호중구 특이적 단백질의 발현에 기초한 호중구를 식별함으로써 호중구의 수에 비해 NET를 정량화할 수 있다. 현미경 검사를 사용하여 NET 식별의 또 다른 과제는 NET가 잘못 정의 된 마진을 가지고 있으며, 그들은 성운 구조를 형성, 병합하는 경향이 있다는 것입니다. 이로 인해 주어진 샘플에서 NET 수가 과소 평가될 수 있습니다. 따라서 DAPI 대신, NET는 NET 형성에서 세포 부속제 DNA의 명확한 식별 및 표시를 위해 Sytox Green을 사용하여 염색 할 수 있습니다.
우리는 파라핀 내장 고양이 동맥 혈전에서 NET를 식별하기 위해 이중 면역 라벨링 프로토콜을 개발했습니다. 탈파피화, 재수화 및 항원 회수는 citH3 및 NE의 면역 라벨링 전에 이루어져야 합니다. 이 분석은 고양이의 NET 형성을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있으며 고양이의 CATE병생리학에 대한 더 나은 이해를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
연구 결과는 캘리포니아 대학, 데이비스, 반려동물 건강을 위한 센터 (CCAH 2018-30-F)에서 기금에 의해 지원되었습니다. 저자는 형광 현미경의 사용에 대한 케빈 울라드 박사를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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