Summary
Мы описываем метод выявления нейтрофилов внеклеточных ловушек (NETs) в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных кошачьих кардиогенных артериальных тромбов с использованием тепло-индуцированного антигена поиска и двойной иммуномаркировки протокола.
Abstract
Нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), состоящий из клеточной ДНК (cfDNA) и белков, как гистоны и нейтрофил эластаза (NE), высвобождаются нейтрофилов в ответ на системное воспаление или патогенов. Хотя ранее было показано, что NETs увеличивают образование тромбов и подавляют фибринолиз у людей и собак, роль NETs у кошек с кардиогенной артериальной тромбоэмболией (CATE), опасным для жизни осложнением, вторичным по отношению к гипертрофической кардиомиопатии , неизвестно. Стандартизированный метод для выявления и количественной оценки NET в кардиогенных артериальных тромбов у кошек будет способствовать нашему пониманию их патологической роли в CATE. Здесь мы описываем метод выявления NETs в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных тромбо в аортальной бифуркации, извлеченные во время некропсии. После депарафинизации с ксиленом, аортальные секции прошли непрямой тепло-индуцированного антигена поиска. Разделы были затем заблокированы, permeabilized, и ex vivo NETs были определены путем coлокализации клеточной ДНК (cfDNA), цитруллинированный гистон H3 (citH3), и нейтрофил elastase (NE) с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Для оптимизации иммунообнаружения NETвов в тромби, аутофлуоресценция элементов ткани была ограничена с помощью процесса закалки аутофлюоресценции до микроскопии. Этот метод может быть полезным инструментом для изучения NETs и тромбоза в других видах и предлагает новые идеи в патофизиологии этого сложного состояния.
Introduction
Кошки с гипертрофической кардиомиопатией подвергаются риску опасных для жизни тромбоэмболических осложнений1,,2. Несмотря на высокую заболеваемость и смертность, связанные с кошачьей кардиогенной тромбоэмболией (КАТЭ), лежащая в основе патофизиология CATE у кошек плохо понимается. Есть также ограниченные диагностические и терапевтические инструменты для лечения и выявления кошек, подверженных риску этого разрушительного состояния3.
В дополнение к своей роли в врожденном иммунитете, нейтрофилы, как было показано, играют роль в тромбозе, выпустив нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), которые веб-подобных сетей клеточной ДНК (cfDNA) инкрустированы гистонами и гранулированных белков, как нейтрофил эластазы (NE) и миелопероксиды. Нейтрофилы проходят образование NET в ответ на системное воспаление, прямое столкновение с патогенными микроорганизмами, а также взаимодействие с активированными тромбоцитами4,,55,6,,7. У собак днк, полученная из нейтрофилов, подавляет лизис тромбов, в то время как протеины NET ускоряют образование тромбов. Способность NETs улавливать циркулирующие клетки и компоненты коагуляции также является ключом к их тромбогенным свойствам8,,9,,10,,11,,12.
NET обнаруживаются путем колокализации внеклеточных нейтрофильных белков, гистонов и cfDNA. Из-за этого, выявление и количественное определение NETs в фиксированных тканях иммунофлуоресценции депарафинизированных тканей превосходит традиционные гематоксилин и эозин (H и E) пятно с использованием яркой микроскопии поля4,5. Несколько человеческих исследований с использованием иммунофлуоресценционной микроскопии определили NETs как структурные компоненты коронарных артериальных тромбов, тромбов мозгового инсульта, атеротромбоза и венозной тромбы13,14,16,,17.17 На сегодняшний день не описан стандартизированный метод выявления и количественной оценки NET в кошачьих тромби. Поскольку выявление NET s в кошачьих кардиогенных артериальных тромбов может облегчить будущие трансляционные исследования в NETs и тромбоз, мы описываем методы net идентификации и оценки в парафинавстроенных артериальных тромбов у кошек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. Некропсии и биопсии тканей проводились с согласия владельцев.
1. Фиксация тканей, встраивание и секция
- Рассекать аортальные бифуркации, в том числе нисходящей аорты, бедренной артерии, и общие подвздошные артерии (Рисунок 1A), вскоре после гуманной эвтаназии или смерти. Блант вскрыть фасции(рисунок 1B) до погружения его полностью в 10% нейтрально-буферизированных формалин для как минимум 24 ч и не более 48 ч.
- Чтобы обезвоживать образец, сначала погрузите в 10% нейтрально-буферизированный формалин, нагретый до 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Затем погружайся в возрастающие концентрации этанола, нагреваемого до 37 градусов по Цельсию (70%, 95%, 100%) 2x на 1 ч каждый. Наконец, без промывки, погрузите 2x в 100% толуол нагретый до 37 градусов по Цельсию на 1 ч каждый.
- Добавьте парафин с подогревом до 62 градусов по Цельсию и дайте парафину полностью затвердеть на ночь.
- Раздел 2-3 мкм парафина-встроенных тканей с использованием микротома и место на положительно заряженных стеклянных слайдов. Храните секционные ткани при -80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа.
2. Депараффинизация, регидратация и извлечение антигена, индуцированного в теплом,
- Для выполнения депарафинизации и регидратации секций на стеклянных слайдах, поместите стеклянные горки в стеллажи и процесс в следующем порядке:
- Полностью погрузите в 100% ксилена в течение 3 мин. Повторите этот шаг 2x. Не смягчить между шагами.
- Погружение полностью в снижение концентрации этанола (100%, 95%, 70%) при комнатной температуре (RT), 3x на 3 мин каждый. Не смягчить между шагами.
- Погрузите полностью в деионизированную воду в течение 2 мин. Повторите.
- Поместите разделы в Tris-буферированный солен с 0,1% Tween (TBST, рН 7,6) в течение 2-3 мин.
- Заполните резервуар деионизированной водой, нагретой до 100 градусов по Цельсию. Дайте пароходу уравновесить 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло-индуцированный антиген поиска лучше всего выполняется с косвенным нагрева, генерируемых пароходом с предустановленной температуры настройки, такие как пищевой пароход. - Нагрейте коммерчески доступный раствор извлечения антигена, содержащий Tris и EDTA (pH No 9) до 95-97 градусов по Цельсию на контролируемой температурой горячей пластине с постоянным перемешиванием. Убедитесь, что он не кипит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать облачным, как только он нагревается. - Налейте нагретый раствор извлечения антигена в слайд-контейнер и поместите контейнер в камеру парохода. Разрешить антигена извлечения раствор уравновесить до температуры парохода в течение 3-4 мин. Убедитесь, что температура камеры составляет 95 градусов по Цельсию.
- Погрузите горки полностью в нагретый антиген извлечения раствора и продолжить применение внешнего нагрева через пароход в течение 20 минут.
- Снимите слайд-контейнер с парохода и дайте слайдам и раствору поиска антигена охладиться до RT. Храните разбавленный антиген поисковый раствор при 4 градусах Цельсия и при необходимости повторно используйте до 2x.
- Вымойте слайды 3x с TBST в течение 5 минут.
3. Закалка иммуномаркировки и аутофлуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 подробно описывается состав блокирующих буферов, используемых в следующих шагах.
- Инкубировать разделы в Блокирование буфера 1 для 2 ч на RT под нежным качания (30-50 об /1/ т. д.). Печать с парафина пленки, чтобы избежать сушки.
- Без мытья, немедленно применять 100 л разбавленного кролика поликлонального античеловеческого цитруллинированного гистонhtone H3 (citH3) антитела (0,03 мг/мл разбавленных в блокирующем буфере 1) непосредственно на слайд.
- Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) на каждом участке, чтобы позволить равномерное распределение смеси антител.
- Инкубировать 12-16 ч при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Печать с парафильмом пленки, чтобы избежать сушки.
- Вымойте 3x с TBST в течение 5 мин.
- Применить 100 зл козы анти-кролик антитела спряженные Alexa Fluor 488 (разбавленный до конечной концентрации 0,04 мг/мл или 1:50 в блокирование буфера 1), как описано в шаге 3.3. Инкубировать 1 ч на RT под нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Защитите слайды от света.
- Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
- Инкубировать разделы в Блокирование буфера 2 ночь на 4 кВ под нежным качания (30-50 об /ч). Защитите от света.
- Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
- Блок разделов в Блокирование буфер амп 3, как описано в шаге 3.3 на RT для 2 ч под нежным качания (30-50 об / мин).
- Инкубировать разделы с биотинилатами поликлональных антитела NE кролика кролика (окончательная концентрация 0,2 мкг/мл в Блокирующий буфер 3) при 4 КК для 12-16 ч, как описано в шагах 3,2-3,4.
- Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
- Инкубировать с Alexa Fluor 594 стрептавидин конъюгировать (разбавить до 1:100 или 0,02 мг/мл в блокирующий буфер 3), как описано в шагах 3.2-3.3 для 1 ч на RT. Защитите от света и печать с парафином для предотвращения сушки.
- Вымойте tBST 1x в течение 5 мин.
- Нанесите 100 л раствора автофлюоресценции непосредственно на секции в течение 1 мин в соответствии с инструкциями производителя.
- Немедленно мыть слайды с TBST 6x в течение 10 минут.
- Обложка каждого слайда с 100 злиц 300 нм DAPI в течение 5 минут в темноте.
- Вымойте с TBST в течение 3 мин. Повторите это в общей сложности 5x.
- Нанесите каплю (50 евро) антифадейской среды крепления, часть комплекта самоуточения автофлюоресценции, прямо на стеклянную горку, окружающую секцию. Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) осторожно на секцию, не создавая пузырьков.
- Разрешить образцы для лечения на ночь в темноте при 4 градусах Цельсия, пока монтаж наяней не затвердеет для микроскопического анализа с линзами погружения.
4. Идентификация нейтрофилов внеклеточной ловушки
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует перевернутый эпифлюоресцентный микроскоп с цифровой камерой CCD 1280 x 960 (см. Таблица материалов).
- Чтобы найти тромби, скан черепно-сканно каудально по длине аорты, аортальной бифуркации, и каждая бедренная артерия с помощью фазовой контрастной микроскопии с целью 10x. Тромб представляет собой конгломерат тканей, содержащих эритроциты, белые кровяные тельца и тромбоциты, прилегающие к эндотелию на фазовом контрасте и яркой полевой микроскопии(рисунок 2A, Рисунок 2B).
- Первый изучить разделы для NETs с использованием канала DAPI (возбуждение 357/44 нм) с 10x и 20x целей(рисунок 2C). Обратите внимание, что cfDNA появляется как деконденсированная ДНК, которая не находится в пределах цитоплазмы клетки, когда его видят на фазовом контрасте или яркой полевой микроскопии.
- Определите внеклеточный NE и citH3 на Техасских красных каналах (возбуждение 585/29 нм, эмиссия 628/32 нм) и зеленый флуоресцентный протеиновый канал (возбуждение 470/22 нм, эмиссия 525/50 нм), соответственно, с 10, 20 и 40x целями.
- Оценить и проанализировать NET s внутри thrombus используя имеющееся програмное обеспечение, such as Изображение J (NIH). NET образование определяется на основе колокализации cfDNA, внеклеточного citH3, и NE, как ранее описано18. Поддержание последовательного времени экспозиции и выгоды каждого канала на протяжении всего приобретения изображений, чтобы избежать насыщения в интенсивности пикселей.
- Карта каждого тромба на основе его близости к нисходящей аорты, разделив его на три равные зоны, с зоной 1 ближе к аорте, Зона 3 дальше от аорты, и Зона 2 между зонами 1 и 3). С оператором ослепленным к медицинскому состоянию каждого предмета, примите по крайней мере 10 случайных полей в каждой зоне. Характеризуйте распределение NET в тромби путем усреднения количества полей с NET в каждой зоне или расчета средней зоны, занимающей NET в каждой зоне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол для депарафинизации, теплового антигена поиска, и двойной иммуномаркировки парафина встроенных тромбов, мы определили NETs в кошачьих CATE в первый раз. Тромби в аортальной бифуркации были обнаружены флуоресценцией микроскопии и яркой полевой микроскопией с использованием стандартных h и E окрашивания и фазовой контрастной микроскопии. На яркой полевой микроскопии кошачий артериальный тромби состоял из красных кровяных телец, лейкоцитов, фибрина и тромбоцитов(рисунок 3А). Хотя H и E не может испачкать специфические компоненты NET, NETs часто появлялись как сети глубоких фиолетовых нитей различной длины, окружающих близлежащие эритроциты и лейкоциты(Рисунок 3A, пунктирный контур). Тромб был охарактеризован как хорошо демаркированная структура в сосудистом пространстве на фазовой контрастной микроскопии(рисунок 2A, Рисунок 4B). Мы также подтвердили наличие NETs в этих областях иммунофлуоресцентной микроскопии(рисунок 3B). Увеличение этих областей выявило большие агрегаты NETs, состоящие из cfDNA, внеклеточного citH3 и NE(рисунок 2C, Рисунок 3B, белый пунктирный контур). Используя ту же технику для поиска тромбов и NETусов у кошек без CATE, мы обнаружили, что листы лизированных нейтрофилов могут быть обнаружены время от времени в непосредственной близости от эндотелия. Хотя эти нейтрофилы отображаются некоторые морфологические характеристики образования NET, они не должны быть связаны с какой-либо организованной тромб. Мы не идентифицировали тромби ни в одном из контрольных образцов(рисунок 4A).
Рисунок 5A демонстрирует глубокую аутофлуоресценцию элементов сгустка, таких как эритроциты и коллаген, когда он изображен на зеленой (488 нм) длине волны, что препятствовало нашей способности обнаруживать cfDNA и комлокализацию белка. Мы обнаружили, что краткое закалка автофлюоресценции с помощью коммерчески доступного комплекта после иммуномаркировки значительно увеличила чувствительность колокализации белка и обнаружения NET, даже в районах с обилием эритроцитов(Рисунок 5B, наконечники стрел).
Рисунок 1: Представитель некропсии фотографии расчлененной аортальной бифуркации от кошки с кардиогенной артериальной тромбоэмболии. (A) Нисходящая аорта была расчленена 4-5 см черепной (Cr) к аортальной бифуркации. (B) Фасция была тщательно расчленена до тех пор, пока нисходящая аорта (1) и подвздошные артерии (2,3) были хорошо видны в caudal аспекте (Cd). Обратите внимание на тромб в аортальной бифуркации (кв). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель фазового контраста и иммунофлуоресценции изображения NETs в тромбусе, найденном в кошачьей аортальной бифуркации. (A) Фазовая контрастная микроскопия показала тромб как дискретную и хорошо демаркированную структуру, близкую к аорте. Комбинированный фазовый контраст и флуоресценция окрашивания ДНК (синий) показали наличие лейкоцитов и клеточной ДНК в тромбе. Коробочная область состоит из большой концентрации ДНК, свободной от клеток. Оригинальное 10-x увеличение; Шкала бар 400 мкм. (B) Коробка области в (A) был дополнительно увеличен в 20x. Безклеточная ДНК и внутриклеточная ДНК, окрашенные DAPI (синий), нейтрофил elastase (NE), и цитруллинированный гистон H3 (citH3) появились зеленые и красные, соответственно. (Оригинальное 20-x увеличение; Шкала бар 100 мкм). (C) NETs, определены на основе колокализации клеточной ДНК, внеклеточной NE, и citH3, были изложены (пунктирная линия). Оригинальное 40-x увеличение; Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение кошачьего артериального тромба с использованием Н И Е и иммунофлуоресцентного окрашивания. (A) На H и E пятно, большая концентрация нейтрофилов и эритроцитов были видны. Внеклеточные хроматины появились как глубокие фиолетовые нити различной длины, окруженные эритроцитами и нейтрофилами (пунктирный контур, черная стрелка). (B) Нейтрофильные внеклеточные ловушки были легко визуализированы с помощью иммунофлюоресценциальной микроскопии на том же тромбе (пунктирный контур, белая стрелка). NET s были определены как colocalization cfDNA (голубой), NE (зеленый), и citH3 (красный). Оригинальное 20-x увеличение; Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативная фазовая контрастность и иммунофлуоресценция изображений аортных бифуркиций. (A) Фазовый контраст и иммунофлуоресценции изображения аортальных бифуркиций у кошки без артериального тромбоза. Обратите внимание на отсутствие тромбов или агрегатов нейтрофилов в просвете аортальной бифуркации у кошки без артериального тромбоза. (B) Фазовый контраст и иммунофлуоресценции изображения аортальных бифуркиций у кошки с диагнозом кардиогенной артериальной тромбоэмболии. Аортальные бифуркации были окрашены для ДНК (синий), нейтрофил эластаза (зеленый), и цитруллинированный гистон H3 (красный). При этом хорошо демаркированный тромб, выпуклый в сосудистую стенку и занимающий большую часть аортального проема, был отмечен у кошки с кардиогенной артериальной тромбоэмболией. NETs, характеризуется колокализации cfDNA, NE, и citH3, были определены в тромб (пунктирный контур). Оригинальное 10-x увеличение; Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативная фазовая контрастность (ПК) и иммунофлуоресценция изображений артериальных тромбов от двух кошек. Слайды были окрашены для citH3, NE, и ДНК и изображения на 488 нм (красный), 595 нм (зеленый), и 357 нм (синий) длинволн, соответственно, на 40x увеличение. Кардиогенные артериальные тромбы у кошек имели обилие эритроцитов (яп. (A) Автофлуоресценция от эритроцитов была наиболее заметной через 488 нм длиной волны, уменьшая обнаружение сигнала colocalization и идентификации NETs. (B) Утоления значительно снижается автофлюоресценции на 488 нм длина волны, особенно в районах с высокой концентрацией эритроцитов (яп. Это усилило обнаружение colocalized белков, цитХ3 и нейтрофил эластаза (стрелка), в присутствии эритроцитов (шкала бар 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнение Рисунок 1: Представитель иммунофлуоресценции изображения артериальных тромбов от кошки. Разделы были окрашены для ДНК (синий), citH3 (красный), и либо миелопероксидаза (A) или нейтрофил эластаза (B). ()Несмотря на использование кошачьих конкретных миелопероксидаза антитела (MPO, 1:5), окрашивая интенсивность MPO остается бедным. (B) Использование поликлональных нейтрофил эластаза (NE) антитела, как известно, перекрестно реагировать с несколькими видами, иммунореактивность и окрашивание интенсивность была значительно выше. Обратите внимание на характерные лобкия ядра нейтрофилов, окруженные NE (стрелки). Оригинальное 40-x увеличение; Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
| Блокирование буфера | Состав | |
| 1 | TBS с 0.1% Tween-20, 0.1% NP40, 5% сыворотка козы | |
| 2 | TBS с 0.1% Tween-20, 10% сыворотка кролика, 0.1%NP-40 | |
| 3 | TBS с 0.1% Tween-20, 5% BSA, 0.1% NP-40 | |
Таблица 1: Состав блокирующих буферов, используемых для иммунофлуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем протокол для выявления NETs в фиксированной кошачьей кардиогенных тромбов с помощью двойного протокола иммуномаркировки и иммунофлуоресценции микроскопии. Хотя только кардиогенные артериальные тромбы были окрашены, в теории этот протокол может быть использован для других видов тромбов и в других ветеринарных видов. Идентификация NETs в кошачьих артериальных тромби предполагает, что NETs может играть определенную роль в тромбозе у кошек.
Обнаружение NETs иммунофлуоресценции в фиксированной и парафина встроенных тканей превосходит обычные гистологические пятна, как Н И Е, который часто показывает нити хроматина в окружении нейтрофилов13. Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция фиксированных артериальных тромбов позволяют одновременное обнаружение cfDNA и других внеклеточных белков, таких как citH3, известный как специфический для образования NETs18,19. Поскольку криопрепараты являются неоптимальными для обнаружения NET в тканях и тромби, мы сохранили наши образцы в 10% нейтрально-буферизированный формалин, который содержит 4% формальдегида и 10% метанола. Безклеточные нуклеиновые кислоты непосредственно не фиксируются формальдегидом. Вместо этого, они обездвижены в фиксированных белковых структурах, которые изменяются частично обратимыми метиленовыми мостами, индуцированными формальдегидом20. Для дальнейшего ограничения артефактов и автофлюоресценции, вызванной формической кислотой и кетонами, порождаемыми окислением формальдегида, исследователи могут выбрать использование параформированного метанола, разбавленного в буфере для фиксации. Поскольку длительность фиксации влияет на иммунореактивность, мы рекомендуем фиксацию не более 24 ч до обезвоживания и встраивания парафина. Парафин-встроенные ткани или сгустки могут храниться для депарафинизации и окрашивания.
Химическая фиксация формальдегидом и параформальдегидом изменяет третичную структуру белков, маскируя интересующие антигены и предотвращая привязку антител к специфическим эпитопотам21. Извлечение антигена, процесс, который нарушает метиленовый мост перекрестные, имеет важное значение до выполнения иммунообнаружения в формалино-фиксированных тканей. Основываясь на опыте авторов, тепло-индуцированный антиген поиска с использованием щелочного решения поиска (pH No 9 в Tris / EDTA буфер) с мягким косвенным нагревом усиливает обнаружение белков и NETs при минимизации артефактов и аутуфлуоресценции. Температура раствора извлечения антигена не должна доходить до точки кипения (Зgt;100 кС), так как денатурирование белков может привести к неспецифическим связываниям и фоновому шуму.
Ограничение NET идентификации в фиксированных сгустков является то, что иммунофлуоресцентное окрашивание может быть весьма переменной при различных условиях поиска антигена18. Сопоставимо с результатами, найденными Brinkmann et al., мы обнаружили, что более высокие температуры инкубации (зgt;55 градусов по Цельсию) привели к оптимальному окрашиванию гистонов в ядрах и деконденсированному хроматину19. Тем не менее, мы обнаружили, что интенсивность окрашивания миелопероксидаза, гранулированный белок, найденный в нейтрофилов и NETs, был низким в предлагаемых условиях. Плохая иммунореактивность миелопероксидазы была последовательной, несмотря на использование кошачьего специфического антитела(Дополнение Рисунок 1). Поэтому мы призываем исследователей изменить продолжительность и условия (например, рН, температура) процесса поиска антигена, чтобы дать удовлетворительный сигнал, основанный на антигене интереса.
Одной из проблем выявления NET в ветеринарных видов является отсутствие видов конкретных антител. Для предотвращения вмешательства, встречающегося при использовании первичных антител, происходящих из того же вида, мы включили дополнительный блокирующий шаг, использующий высокую концентрацию кроличьи иммуноглобулинов, чтобы насытить любые оставшиеся места связывания на коза анти-кролик вторичных антител. Основным недостатком этого метода является то, что он занимает много времени, потому что он требует нескольких шагов инкубации. Исследователи должны включать в себя два различных контроля, которые исключают либо первичных антител во втором шаге иммуномаркировки, чтобы обеспечить, чтобы вторичные антитела от любого иммуномаркировки шаг связывается конкретно с его основным антителом. Специфика выявленных структур NET может быть дополнительно проверена пищеварением DNase или включением биологического контроля, состоящего из аортных бифуркционирований от кошек без CATE (Рисунок 5). Кроме того, отрицательный контроль, состоящий из той же концентрации изотипных контрольных антител, как первичные антитела должны быть включены, чтобы исключить неспецифические взаимодействия антител, неспецифические связывания с рецепторами FC, и клеточной аутофлуоресценции. Следователям рекомендуется изменять этот протокол на основе наличия видов конкретных антител. Если нет видов конкретных антител, мы советуем сначала оценить иммунореактивность антител с помощью иммуноцитохимии или оценить протеиновый транскрипт от видов, представляющих интерес для гомологии, к ссылки стенограммы.
Такие факторы, как фиксация образцов, неадекватная депарафинизация и наличие специфических компонентов ткани могут привести к аутофлуоресценции в тромби. Во время альдегидной фиксации, амины могут сочетаться с альдегидами, образуя базовые комплексы Шиффа, которые излучают флуоресценцию22. Неполная депарафинизация может также химически изменить белки в ткани, создавая автофлюоресценции23. Внеклеточные компоненты в сосудистых образцах, таких как коллаген, эластин и красные кровяные тельца, как сообщается, естественно флуоресцировать у млекопитающих24,25. Поскольку естественная или ятрогенная аутофторесценция наиболее заметна в зеленых длинах волн (возбуждение 488 нм, эмиссия 500-550 нм), использование фарреденных флюорофоров может свести к минимуму аутофлуоресценцию26. В настоящем протоколе мы использовали коммерчески доступный комплект для закалки автофлюоресценции, предназначенный для электростатически связывания с элементами аутуторесцентной ткани. Мы рекомендуем следователям оптимизировать продолжительность закалки автофлюоресценции, так как рекомендация производителя в 5 мин может уменьшить иммунореактивность менее обильных белков. Кроме того, следователи могут также ослабить аутофлуоресценции с помощью Судана Черный B, 3,3'-диаминобензидин или trypan синий27.
Поскольку NETs неоднородно распределены в тромбусе, рекомендуется тщательное отображение всей аорты и подвздошных артерий. Регионы, положительные для cfDNA, citH3 и NE, затем увеличиваются. Колокализация cfDNA, citH3 и NE широко используется для выявления образования NET и дифференцированного образования NET от других форм клеточной смерти. В отличие от недавнего исследования человека, которые обнаружили, NETs быть сосредоточены на периферии коронарных тромбов, большинство NETs в кошачьих артериальных тромбов были сгруппированы на черепной аспект сгустка28. Хотя мы использовали стандартизированный протокол для идентификации NETs, микроскопическая оценка и количественная оценка NETs остается субъективной. Здесь мы использовали ослепленный и систематический метод, чтобы свести к минимуму предвзятость наблюдателя во время микроскопического анализа. Поскольку количество NET в образце может зависеть от количества нейтрофилов, исследователи могут количественно NET по отношению к числу нейтрофилов путем выявления нейтрофилов на основе ядерной морфологии, диаметр клеток, и выражение нейтрофилов конкретных белков. Еще одна проблема идентификации NET с помощью микроскопии заключается в том, что NET имеют нечеткие поля и, как правило, сливаются, образуя туманные структуры. Это может привести к занижению или завышению числа НЕТ в той или иной выборке. Таким образом, вместо DAPI, NETs могут быть окрашены с помощью Sytox Green для более четкой идентификации и обозначения ДНК клеток-аппенданов из образования NETs.
Мы разработали двойной протокол иммуномаркировки для выявления NET в парафинавстроенных кошачьих артериальных тромби. Депарафинизация, регидратация и извлечение антигена должны происходить до иммуномаркировки цит3 и NE. Этот ассеможет стать ценным инструментом для изучения образования NET у кошек и обеспечить лучшее понимание патофизиологии CATE у кошек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано фондами Калифорнийского университета в Дэвисе, Центра здоровья животных (CCAH 2018-30-F). Авторы хотели бы отметить д-р Кевин Вулард для использования флуоресценции микроскопа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
