Summary
Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.
Abstract
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), compuestas de ADN libre de células (CFDNA) y proteínas como histonas y neutrófilos elastasa (NE), son liberadas por neutrófilos en respuesta a inflamación sistémica o patógenos. Aunque anteriormente se ha demostrado que los NET aumentan la formación de coágulos e inhiben la fibrinólisis en humanos y perros, el papel de las NET en gatos con tromboembolismo arterial cardiogénico (CATE), una complicación potencialmente mortal secundaria a la cardiomiopatía hipertrófica , es desconocido. Un método estandarizado para identificar y cuantificar los NETen s en trombos arteriales cardiogénicos en gatos hará avanzar nuestra comprensión de su papel patológico en CATE. Aquí, describimos una técnica para identificar NETs en trombos fijas y incrustadas en parafina dentro de la bifurcación aórtica, extraídas durante la necropsia. Después de la desfinación con xileno, las secciones aórticas se sometieron a una recuperación indirecta de antígenoininina inducido por calor. Las secciones fueron bloqueadas, permeabilizadas y ex vivo NETs fueron identificadas por la colocalización de ADN libre de células (cfDNA), histona citrulinated H3 (citH3), y elastasa de neutrófilos (NE) utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Para optimizar la inmunodetección de NETs en trombos, la autofluorescencia de los elementos tisulares se limitó mediante el uso de un proceso de enfriamiento de autofluorescencia antes de la microscopía. Esta técnica podría ser una herramienta útil para estudiar NETs y trombosis en otras especies y ofrece nuevas perspectivas sobre la fisiopatología de esta condición compleja.
Introduction
Los gatos con miocardiopatía hipertrófica corren el riesgo de sufrir complicaciones tromboembólicas potencialmente mortales1,2. A pesar de la alta morbilidad y mortalidad asociada s con el tromboembolismo arterial cardiogénico felino (CATE), la fisiopatología subyacente del CATE en gatos se entiende mal. También hay herramientas diagnósticas y terapéuticas limitadas para tratar e identificar gatos en riesgo de esta devastadora condición3.
Además de su papel en la inmunidad innata, se ha demostrado que los neutrófilos desempeñan un papel en la trombosis mediante la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son redes similares a redes de ADN libre de células (CFDNA) incrustadas con histonas y proteínas granulares como la elastasa de neutrófilos (NE) y la mieloperoxidasa. Los neutrófilos se someten a la formación de NETs en respuesta a la inflamación sistémica, el encuentro directo con patógenos y la interacción con las plaquetas activadas4,5,6,7. En perros, se ha demostrado que el ADN derivado de neutrófilos inhibe la lisis de coágulos, mientras que las proteínas NET aceleran la formación de coágulos. La capacidad de los NETs para atrapar células circulantes y componentes de coagulación también es clave para sus propiedades trombogénicas8,9,10,11,12.
Los NET se detectan mediante la colocación de proteínas neutrófilas extracelulares, histonas y ADNr. Debido a esto, la identificación y cuantificación de neTs en tejidos fijos por inmunofluorescencia de tejidos desparafinados es superior a la hematoxilina tradicional y la mancha de eosina (H&E) utilizando la microscopía de campo brillante4,5. Varios estudios en humanos con microscopía de inmunofluorescencia identificaron las NET como componentes estructurales de trombos arteriales coronarios, trombos cerebral, aterombosis y trombosa venosa13,,14,,15,,16,,17. Hasta la fecha, no se ha descrito un método estandarizado para detectar y cuantificar NETs en trombos felinos. Debido a que la identificación de NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos puede facilitar futuras investigaciones traslacionales en NETys y trombosis, describimos técnicas de identificación y evaluación de LA RED en trombos arteriales incrustados en parafina en gatos.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis. Las necropsias y biopsias de tejidos se realizaron con el consentimiento de los propietarios.
1. Fijación de tejidos, incrustación y seccionamiento
- Diseccionar la bifurcación aórtica, incluyendo la aorta descendente, la arteria femoral y las arterias ilíacas comunes(Figura 1A),poco después de la eutanasia humana o la muerte. Blunt disecciona la fascia(Figura 1B)antes de sumergirla completamente en un 10% de formalina con amortiguación neutra durante un mínimo de 24 h y no más de 48 h.
- Para deshidratar la muestra, primero sumergir en 10% de formalina con amortiguación neutra calentada a 37 oC durante 1 h. A continuación, sumergir en concentraciones crecientes de etanol calentado a 37 oC (70%, 95%, 100%) 2x para 1 h cada uno. Por último, sin enrsuar, sumergir 2x en 100% tolueno calentado a 37 oC para 1 h cada uno.
- Añadir parafina calentada a 62oC y permitir que la parafina se solidifique completamente durante la noche.
- Sección 2–3 m del tejido incrustado en parafina utilizando un microtome y colocar en diapositivas de vidrio cargadas positivamente. Conservar los tejidos seccionados a -80 oC hasta que se pueda seguir analizando.
2. Desparafinación, rehidratación y recuperación de antígenos inducidos por calor
- Para realizar la desparafinación y rehidratación de secciones en diapositivas de vidrio, coloque los portaobjetos de vidrio en bastidores y procese en el siguiente orden:
- Sumergir completamente en 100% xileno durante 3 min. Repita este paso 2x. No enjuague entre pasos.
- Sumergir completamente en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95%, 70%) a temperatura ambiente (RT), 3x para 3 min cada uno. No enjuague entre pasos.
- Sumergir completamente en agua desionizada durante 2 min.
- Coloque las secciones en la solución salina tris-buffered con 0.1 % Tween (TBST, pH a 7.6) durante 2-3 min.
- Llenar el depósito con agua desionizada calentada a 100oC. Deje que la cámara de vapor se equilibre durante 20 minutos.
NOTA: La recuperación de antígenos inducida por calor se realiza mejor con calentamiento indirecto generado por un vapor con un ajuste de temperatura preestablecido, como un vapor de alimentos. - Caliente la solución de recuperación de antígenos disponible en el uso comercial que contiene Tris y EDTA (pH a 95-97 oC en una placa caliente con temperatura controlada con agitación constante. Asegúrese de que no hierva.
NOTA: La solución debe volverse turbia una vez que se calienta. - Vierta la solución de recuperación de antígeno calentado en un recipiente de diapositivas y coloque el recipiente en la cámara del vapor. Permita que la solución de recuperación de antígenos se equilibre a la temperatura del vapor durante 3-4 min. Asegúrese de que la temperatura de la cámara es de 95 oC.
- Sumerja las diapositivas completamente en la solución de recuperación de antígeno calentado y continúe la aplicación de calefacción externa a través del vapor durante 20 minutos.
- Retire el recipiente de la corredera del vapor y permita que las diapositivas y la solución de recuperación de antígenos se enfríen a RT. Almacene la solución de recuperación de antígenos diluido a 4 oC y reutilice hasta 2 veces si es necesario.
- Lave los portaobjetos 3 veces con TBST durante 5 min.
3. Apagado de inmunoetiquetado y autofluorescencia
NOTA: En la Tabla 1 se detalla la composición de los búferes de bloqueo utilizados en los pasos siguientes.
- Incubar secciones en el búfer de bloqueo 1 durante 2 h a RT bajo balanceo suave (30–50 rpm). Sellar con película de parafina para evitar el secado.
- Sin lavar, aplicar inmediatamente 100 l de anticuerpo de histona citrulinado antihumano con filina de conejo diluido H3 (citH3) (0,03 mg/ml diluido en el tampón de bloqueo 1) directamente sobre la diapositiva.
- Coloque un cubreobjetos (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) en cada sección para permitir una distribución uniforme de la mezcla de anticuerpos.
- Incubar durante 12–16 h a 4oC con balanceo suave (30–50 rpm). Sellar con película de parafilm para evitar el secado.
- Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
- Aplicar 100 l de anticuerpo anticonejo de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (diluido a una concentración final de 0,04 mg/ml o 1:50 en el búfer de bloqueo 1) como se describe en el paso 3.3. Incubar durante 1 h a RT bajo suave balanceo (30-50 rpm). Proteja las diapositivas de la luz.
- Lavar con TBST 3x durante 5 min.
- Incubar secciones en el búfer de bloqueo 2 durante la noche a 4 oC bajo balanceo suave (30-50 rpm). Proteger de la luz.
- Lavar con TBST 3x durante 5 min.
- Bloquee las secciones en el búfer de bloqueo 3 como se describe en el paso 3.3 en RT para 2 h bajo balanceo suave (30-50 rpm).
- Incubar secciones con anticuerpo NE antihumano de conejo policlonal biotinulado (concentración final de 0,2 g/ml en el búfer de bloqueo 3) a 4 oC durante 12-16 h, tal como se describe en los pasos 3.2–3.4.
- Lavar con TBST 3x durante 5 min.
- Incubar con Alexa Fluor 594 conjugado de esptavidina (diluido a 1:100 o 0.02 mg/ml en el búfer de bloqueo 3) como se describe en los pasos 3.2–3.3 para 1 h en RT. Proteger de la luz y sellar con parafina para evitar el secado.
- Lavar con TBST 1x durante 5 min.
- Aplicar 100 l de mezcla de solución de temple autofluorescencia directamente en las secciones durante 1 min según las instrucciones del fabricante.
- Lave inmediatamente los portaobjetos con TBST 6x durante 10 min.
- Cubra cada diapositiva con 100 sl de 300 nM DAPI durante 5 minutos en la oscuridad.
- Lavar con TBST durante 3 min. Repita esto para un total de 5x.
- Aplique una gota (50 l) de medio de montaje antidescolor, parte del kit de enfriamiento de autofluorescencia, directamente sobre el portaobjetos de vidrio que rodea la sección. Coloque suavemente un cubreobjetos (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) suavemente sobre la sección sin crear burbujas.
- Deje que las muestras se curen durante la noche en la oscuridad a 4 oC hasta que el medio de montaje se haya endurecido para el análisis microscópico con lentes de inmersión.
4. Identificación de trampa extracelular de neutrófilos
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un microscopio de epifluorescencia invertida con una cámara CCD digital de 1.280 x 960 (consulte Tabla de materiales).
- Para localizar el trombo, escanee cranealmente a caudal a lo largo de la longitud de la aorta, la bifurcación aórtica y cada arteria femoral utilizando microscopía de contraste de fase con un objetivo 10x. Un trombo es una conglomeración de tejido que contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas adyacentes al endotelio en contraste de fase y microscopía de campo brillante(Figura 2A, Figura 2B).
- En primer lugar, examine las secciones para las NET utilizando el canal DAPI (excitación 357/44 nm) con objetivos 10x y 20x(Figura 2C). Tenga en cuenta que cfDNA aparece como ADN descondensado que no está dentro de los confines del citoplasma de una célula cuando se ve en el contraste de fase o microscopía de campo brillante.
- Identificar el NE extracelular y citH3 en los canales rojos de Texas (excitación 585/29 nm, emisión a 628/32 nm) y canal de proteína fluorescente verde (excitación a 470/22 nm, emisión a 525/50 nm), respectivamente, con objetivos de 10, 20 y 40x.
- Evalúe y analice los NET dentro de un trombo utilizando el software disponible, como la imagen J (NIH). La formación NET se identifica en función de la colocación de cfDNA, citH3 extracelular y NE como se describió anteriormente18. Mantenga un tiempo de exposición constante y ganancias de cada canal a lo largo de la adquisición de imágenes para evitar la saturación en la intensidad de los píxeles.
- Mapear cada trombo en función de su proximidad a la aorta descendente dividiéndolo en tres zonas iguales, con la Zona 1 más cercana a la aorta, la Zona 3 más alejada de la aorta, y la Zona 2 entre las Zonas 1 y 3). Con el operador cegado a la condición médica de cada sujeto, tome al menos diez campos aleatorios en cada zona. Caracterizar la distribución de NETs en trombos promediando el número de campos con NETs en cada zona o calculando el área de ocupación media de NET por zona.
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Representative Results
Usando este protocolo para la desfinación, la recuperación de antígenos inducidos por calor y la doble inmunoetiquetado de trombos incrustados en parafina, identificamos neTs en CATE felino por primera vez. Los trombos dentro de la bifurcación aórtica se localizaban mediante microscopía de fluorescencia y microscopía de campo brillante utilizando tinción estándar de H&E y microscopía de contraste de fase. En la microscopía de campo brillante, los trombos arteriales felinos consistían en glóbulos rojos, leucocitos, fibrina y plaquetas(Figura 3A). Aunque H&E no puede manchar componentes NET específicos, los NET aparecían con frecuencia como redes de hilos púrpuras profundos de varias longitudes que rodeaban a los eritrocitos y leucocitos cercanos(Figura 3A,contorno punteado). Un trombo se caracterizó como una estructura bien demarcada dentro del espacio vascular en la microscopía de contraste de fase(Figura 2A, Figura 4B). Confirmamos además la presencia de NETs en estas áreas mediante microscopía de inmunofluorescencia(Figura 3B). La ampliación de estas áreas reveló grandes agregados de NETs, compuestos de cfDNA, citH3 extracelular y NE(Figura 2C, Figura 3B,contorno de puntos blancos). Utilizando la misma técnica para buscar trombos y NETs en gatos sin CATE, encontramos que las hojas de neutrófilos lizcados se podían detectar ocasionalmente cerca del endotelio. Aunque estos neutrófilos mostraron algunas características morfológicas de la formación de redes de productos, no deben asociarse con ningún trombo organizado. No identificamos ningún trombo en ninguna de las muestras de control(Figura 4A).
La Figura 5A demuestra una profunda autofluorescencia de elementos coágulos como eritrocitos y colágeno cuando se indica en la longitud de onda verde (488 nm), lo que dificultó nuestra capacidad de detectar la colocalización de CFDNA y proteínas. Encontramos que el breve enfriamiento de autofluorescencia utilizando un kit disponible comercialmente después de la inmunoetiquetado aumentó significativamente la sensibilidad de la colocalización proteica y la detección de REDES, incluso en áreas con abundancia de eritrocitos(Figura 5B,puntas de flecha).
Figura 1: Fotografías representativas de una bifurcación aórtica diseccionada de un gato con tromboembolismo arterial cardiogénico. (A) La aorta descendente fue diseccionada 4–5 cm cranial (Cr) a la bifurcación aórtica. (B) Fascia fue cuidadosamente diseccionada hasta que la aorta descendente (1) y las arterias ilíacas (2,3) eran claramente visibles en el aspecto caudal (Cd). Observe el trombo dentro de la bifurcación aórtica (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de contraste de fase e inmunofluorescencia de NET en un trombo que se encuentra dentro de una bifurcación aórtica felina. (A) La microscopía de contraste de fase reveló un trombo como una estructura discreta y bien demarcada cerca de la aorta. El contraste de fase combinado y la tinción de fluorescencia del ADN (azul) mostraron la presencia de leucocitos y ADN libre de células dentro del trombo. El área en caja consiste en una gran concentración de ADN libre de células. Aumento original de 10x; Barra de escala a 400 m. (B) El área en caja en (A) se amplió aún más a 20x. El ADN libre de células y el ADN intracelular teñido con DAPI (azul), la neutrófilos elastasa (NE) y la histona citrulinado H3 (citH3) aparecieron verdes y rojas, respectivamente. (Aumento original de 20x; Barra de escala a 100 m). (C) Se esbozaron los NET, identificados en función de la colocación del ADN libre de células, el NE extracelular y el citH3 (línea de puntos). Aumento original de 40x; Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen representativa de un trombo arterial felino utilizando H&E y tinción de inmunofluorescencia. (A) En la mancha de H&E, se visificaron una gran concentración de neutrófilos y eritrocitos. Las cromatinas extracelulares aparecieron como hilos púrpuras profundos de varias longitudes rodeados de eritrocitos y neutrófilos (contorno de puntos, flecha negra). (B) Las trampas extracelulares de neutrófilos se visualizaron fácilmente mediante microscopía de inmunofluorescencia en el mismo trombo (contorno punteado, flecha blanca). Los NET fueron identificados como la colocación de cfDNA (azul), NE (verde) y citH3 (rojo). Aumento original de 20x; Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Contraste de fase representativo e imágenes de inmunofluorescencia de bifurcaciones aórticas. (A) Contraste de fase e imágenes de inmunofluorescencia de bifurcaciones aórticas en un gato sin trombosis arterial. Tenga en cuenta la ausencia de trombos o agregados de neutrófilos dentro del lumen de la bifurcación aórtica del gato sin trombosis arterial. (B) Contraste de fase e imágenes de inmunofluorescencia de bifurcaciones aórticas en un gato diagnosticado con tromboembolismo arterial cardiogénico. Las bifurcaciones aórticas se tiñieron para el ADN (azul), la neutrófila elastasa (verde) y la histona citrulinate H3 (rojo). En este caso, se observó un trombo bien demarcado abultado en la pared vascular y ocupando la mayor parte del lumen aórtico en el gato con tromboembolismo arterial cardiogénico. Los NET, caracterizados por la colocalización de cfDNA, NE y citH3, se identificaron dentro del trombo (esquema de puntos). Aumento original de 10x; Barra de escala a 400 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Contraste de fase representativo (PC) e imágenes de inmunofluorescencia de trombos arteriales de dos gatos. Las diapositivas se teñían para las longitudes de onda citH3, NE y DNA e imágenes a 488 nm (rojo), 595 nm (verde) y 357 nm (azul), respectivamente, a 40x de aumento. Los trombos arteriales cardiogénicos en gatos tenían una abundancia de eritrocitos (*, línea punteada). (A) La autofluorescencia de los eritrocitos fue más prominente a lo largo de la longitud de onda de 488 nm, disminuyendo la detección de la señal de colocalización y la identificación de los NETs. (B) El enfriamiento redujo significativamente la autofluorescencia a la longitud de onda de 488 nm, especialmente en áreas con una alta concentración de eritrocitos (*, línea punteada). Mejoró la detección de proteínas colocalizadas, citH3, y neutrófilos elastasa (cabeza de flecha), en presencia de eritrocitos (barra de escala de 200 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura del suplemento 1: Imágenes representativas de inmunofluorescencia de trombos arteriales de un gato. Las secciones se teñían para ADN (azul), citH3 (rojo), y mieloperoxidasa (A) o neutrófilos elastasa (B). (A) A pesar de utilizar un anticuerpo mieloperoxidasa específico para felinas (MPO, 1:5), la intensidad de tinción de MPO siguió siendo pobre. (B) Utilizando un anticuerpo policlonal de elastasa de neutrófilos (NE), conocido por reacción cruzada con múltiples especies, la inmunoreactividad y la intensidad de tinción fueron significativamente mayores. Observe los núcleos lobulados característicos de los neutrófilos rodeados por NE (flechas). Aumento original de 40x; Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para descargar esta figura.
| Bloqueo de búfer | Composición | |
| 1 | TBS con 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% suero de cabra | |
| 2 | TBS con 0,1% Tween-20, 10% suero de conejo, 0,1% NP-40 | |
| 3 | TBS con 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0.1% NP-40 | |
Tabla 1: Composición de los tampones de bloqueo utilizados para la inmunofluorescencia.
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Discussion
Describimos un protocolo para identificar NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos fijos utilizando un protocolo de doble inmunoetiquetado y una microscopía de inmunofluorescencia. Aunque sólo se tiñó el trombo arterial cardiogénico, en teoría este protocolo podría utilizarse para otros tipos de trombos y en otras especies veterinarias. La identificación de NETs dentro de trombos arteriales felinos sugiere que los NET pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos.
La detección de NETs por inmunofluorescencia en tejido sinulado y parafina es superior a las manchas histológicas convencionales como H&E, que a menudo muestra hilos de cromatina rodeados de neutrófilos13. La inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia de los trombos arteriales fijos permiten la detección simultánea de ADNr y otras proteínas extracelulares como citH3, conocida por ser específicas de la formación de NETs18,19. Debido a que las criopreparaciones son subóptimas para la detección de redes netas en tejidos y trombos, conservamos nuestras muestras en una formalina 10% neutra, que contiene un 4% de formaldehído y un 10% de metanol. Los ácidos nucleicos libres de células no se fijan directamente mediante formaldehído. En su lugar, se inmovilizan dentro de las estructuras proteicas fijas, que son alteradas por enlaces cruzados de puente de metileno parcialmente reversibles inducidos por formaldehyde20. Para limitar aún más los artefactos y la autofluorescencia causada por el ácido fórmico y las cetonas generadas por la oxidación del formaldehído, los investigadores pueden optar por utilizar paraformaldehído libre de metanol diluido en tampón para la fijación. Debido a que la duración de la fijación afecta la inmunoreactividad, recomendamos la fijación durante no más de 24 horas antes de la deshidratación y la incrustación de parafina. Los tejidos o coágulos incrustados en la parafina se pueden almacenar para la desparafinación y la tinción.
La fijación química por formaldehído y paraformaldehído altera la estructura terciaria de las proteínas, enmascarando los antígenos de interés y evitando la unión de anticuerpos a epítopos específicos21. La recuperación de antígenos, un proceso que rompe los enlaces cruzados del puente de metileno, es esencial antes de realizar la inmunodetección en tejidos fijados en formalina. Según la experiencia de los autores, la recuperación de antígenos inducidos por calor mediante una solución de recuperación alcalina (pH n.o 9 en tampón Tris/EDTA) con calentamiento indirecto suave mejora la detección de proteínas y END al tiempo que minimiza los artefactos y la autofluorescencia. La temperatura de la solución de recuperación de antígenos no debe alcanzar el punto de ebullición (>100 oC), ya que la desnaturalización de proteínas puede conducir a una unión inespecífica y ruido de fondo.
Una limitación de la identificación de LA RED en coágulos fijos es que la tinción de inmunofluorescencia puede ser muy variable bajo diferentes condiciones de recuperación de antígenos18. Comparable a los resultados encontrados por Brinkmann et al., encontramos que las temperaturas de incubación más altas (>55 oC) resultaron en la tinción óptima de las histonas en los núcleos y la cromatina descondensada19. Sin embargo, encontramos que la intensidad de tinción de la mieloperoxidasa, una proteína granular que se encuentra en neutrófilos y NET, era baja en las condiciones propuestas. La mala inmunoreactividad de la mieloperoxidasa fue consistente a pesar del uso de un anticuerpo específico para felinas(Figura de suplemento 1). Por lo tanto, alentamos a los investigadores a modificar la duración y las condiciones (por ejemplo, pH, temperatura) del proceso de recuperación de antígenos para producir una señal satisfactoria basada en el antígeno de interés.
Uno de los desafíos de identificar las NET en las especies veterinarias es la falta de anticuerpos específicos para cada especie. Para evitar la interferencia encontrada al utilizar anticuerpos primarios procedentes de la misma especie, incluimos un paso de bloqueo adicional utilizando una alta concentración de inmunoglobulinas de conejo para saturar cualquier sitio de unión restante en los anticuerpos secundarios anticonejo de cabra. Una desventaja importante de esta técnica es que consume mucho tiempo, ya que requiere múltiples pasos de incubación. Los investigadores deben incluir dos controles diferentes que excluyan cualquiera de los anticuerpos primarios en la segunda etapa de inmunoetiquetado para garantizar que el anticuerpo secundario de cualquiera de los pasos de inmunoetiquetado se adhiera específicamente a su anticuerpo primario. La especificidad de las estructuras NET identificadas puede ser verificada aún más por la digestión DNase o la inclusión de controles biológicos consistentes en bifurcaciones aórticas de gatos sin CATE (Figura 5). Además, se deben incluir controles negativos consistentes en la misma concentración de anticuerpos de control de isotipos que los anticuerpos primarios para descartar interacciones de anticuerpos inespecíficos, unión inespecífica a receptores Fc y autofluorescencia celular. Se aconseja a los investigadores que modifiquen este protocolo en función de la disponibilidad de anticuerpos específicos para cada especie. Si no hay anticuerpos específicos para cada especie, aconsejamos evaluar primero la inmunoractividad de los anticuerpos utilizando inmunocitoquímica o evaluar la transcripción de proteínas de las especies de interés para la homología a las transcripciones referenciadas.
Factores como la fijación de la muestra, la desfinación inadecuada y la presencia de componentes tisulares específicos pueden conducir a la autofluorescencia en trombos. Durante la fijación de aldehídos, las aminas pueden combinarse con aldehídos para formar complejos de base Schiff, que emiten fluorescencia22. La desfinación incompleta también puede modificar químicamente las proteínas en el tejido, creando autofluorescencia23. Los componentes extracelulares en muestras vasculares como colágeno, elastina y glóbulos rojos se divulgan para fluorescencia natural en mamíferos24,25. Debido a que la autofluorescencia natural o iatrogénica es más notable en las longitudes de onda verdes (excitación de 488 nm, emisión de 500–550 nm), el uso de fluoróforos de color rojo lejano puede minimizar algunas autofluorescencias26. En el presente protocolo, utilizamos un kit de enfriamiento de autofluorescencia disponible comercialmente diseñado para unirelectrosamente a elementos de tejido autofluorescente. Recomendamos que los investigadores optimicen la duración del enfriamiento de la autofluorescencia, ya que la recomendación del fabricante de 5 min puede disminuir la inmunoreactividad de proteínas menos abundantes. Alternativamente, los investigadores también pueden amortiguar la autofluorescencia usando Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine o trypan azul27.
Debido a que los NET se distribuyen heterogéneamente dentro de un trombo, se recomienda un mapeo exhaustivo de toda la aorta y las arterias ilíacas. Las regiones positivas para cfDNA, citH3 y NE se magnifican. La colocación de cfDNA, citH3 y NE se ha utilizado ampliamente para identificar la formación de NET y diferenciar la formación de NET de otras formas de muerte celular. A diferencia de un estudio reciente en humanos que encontró que las NET s se concentran en la periferia de la tromba coronaria, la mayoría de los NET en trombo arterial felino se agruparon en el aspecto craneal del coágulo28. Aunque utilizamos un protocolo estandarizado para identificar los NET, la evaluación microscópica y la cuantificación de los NET siguen siendo subjetivas. Aquí, utilizamos un método ciego y sistemático para minimizar el sesgo del observador durante el análisis microscópico. Debido a que el número de NETs en una muestra puede verse influenciado por el número de neutrófilos, los investigadores pueden cuantificar los NET en relación con el número de neutrófilos mediante la identificación de neutrófilos basados en morfología nuclear, diámetro celular y expresión de proteínas específicas de neutrófilos. Otro desafío de la identificación de NET mediante microscopía es que los NET tienen márgenes mal definidos y tienden a fusionarse, formando estructuras nebulosas. Esto podría dar lugar a una subestimación o sobreestimación del número de NET en cualquier muestra dada. Por lo tanto, en lugar de DAPI, los NET se pueden teñir usando Sytox Green para una identificación más clara y denotación del ADN dependiente de las células de la formación de NETs.
Hemos desarrollado un protocolo de doble inmunoetiquetado para identificar NETs en trombos arteriales felinos incrustados en parafina. La desparafinación, la rehidratación y la recuperación de antígenos deben tener lugar antes de la inmunoetiquetado de citH3 y NE. Este ensayo puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la formación de redes en gatos y proporcionar una mejor comprensión de la fisiopatología de CATE en gatos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Los autores quieren reconocer al Dr. Kevin Woolard por el uso del microscopio de fluorescencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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