Summary
Vi beskriver en metode til at identificere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) i formaldehyd-faste og paraffin-indlejret feline kardiogene trombi ved hjælp af varme-induceret antigen hentning og en dobbelt immunmærkning protokol.
Abstract
Neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), der består af cellefrit DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og neutrofil elastase (NE), frigives af neutrofiler som reaktion på systemisk inflammation eller patogener. Selvom nets tidligere har vist sig at øge blodprop dannelse og hæmme fibrinolyse hos mennesker og hunde, rolle NETs hos katte med kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), en livstruende komplikation sekundært til hypertrofisk kardiomyopati , er ukendt. En standardiseret metode til at identificere og kvantificere NETs i kardiogene arteriel trombi hos katte vil fremme vores forståelse af deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknik til at identificere nets i formaldehyd-fast og paraffin-indlejret trombi i aorta bifurcation, udvundet under obduktion. Efter deparaffinisering med xylen gennemgik aorta sektioner indirekte varmeinduceret antigenudtagning. Sektioner blev derefter blokeret, permeabilized, og ex vivo NETS blev identificeret ved samlokalisering af celle-fri DNA (cfDNA), citrullinlinated histone H3 (citH3), og neutrofile elastase (NE) ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi. For at optimere immundetektionen af netter i trombi blev autofluorescens en af vævselementerne begrænset ved hjælp af en autofluorescensdæmpningsproces før mikroskopi. Denne teknik kunne være et nyttigt redskab til at studere nets og trombose hos andre arter og giver ny indsigt i patofysiologi af denne komplekse tilstand.
Introduction
Katte med hypertrofisk kardiomyopati er i risiko for livstruende tromboemboliske komplikationer1,2. På trods af den høje sygelighed og dødelighed forbundet med feline kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), den underliggende patofysiologi af CATE hos katte er dårligt forstået. Der er også begrænset diagnostiske og terapeutiske værktøjer til behandling og identifikation af katte i risiko for denne ødelæggende tilstand3.
Ud over sin rolle i medfødte immunitet, neutrofiler har vist sig at spille en rolle i trombose ved at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), som er web-lignende netværk af celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulatproteiner som neutrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Neutrofiler gennemgår nets dannelse som reaktion på systemisk inflammation, direkte møde med patogener og interaktion med aktiverede blodplader4,5,6,7. Hos hunde har neutrofil-afledt DNA vist sig at hæmme blodproplyse, mens NET-proteiner accelererer dannelsen af blodpropper. Tonitternes evne til at fange cirkulerende celler og koagulationskomponenter er også nøglen til deres trombogenegenskaber8,9,10,11,12.
NETs påvises ved samlokalisering af ekstracellulære neutrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grund af dette er identifikation og kvantificering af net i faste væv ved immunfluorescens af deparaffineret væv bedre end traditionel hæmatoxylin og eosin (H&E) plet ved hjælp af lyse feltmikroskopi4,5. Adskillige humane undersøgelser med immunfluorescensmikroskopi identificerede nets som strukturelle komponenter i koronararterietrombi, cerebralt slagtilfælde trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Til dato er en standardiseret metode til påvisning og kvantificering af nets i feline trombi ikke blevet beskrevet. Da identifikation af net i feline kardiogene arteriel trombose kan lette fremtidig translationel forskning i NET og trombose, beskriver vi teknikker til NET-identifikation og vurdering hos paraffin-indlejret arteriel trombose hos katte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis. Obduktioner og biopsier af væv blev udført med ejernes samtykke.
1. Vævsfiksering, indlejring og skæring
- Dissekere den aorta tverumation, herunder faldende aorta, femoralarterie, og de fælles iliaca arterier (Figur 1A), kort efter human dødshjælp eller død. Stump dissekere fascia(figur 1B) før nedsænkning det helt i 10% neutral-buffered formalin i mindst 24 timer og ikke længere end 48 timer.
- For at dehydrere prøven, først nedsænkes i 10% neutral-buffered formalin opvarmet til 37 °C i 1 time. Derefter nedsænkes i stigende koncentrationer af ethanol opvarmet til 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x i 1 time hver. Endelig, uden skylning, nedsænkes 2x i 100% toluen opvarmet til 37 °C for 1 time hver.
- Paraffin opvarmet til 62 °C og lad paraffinen størkne helt natten over.
- Sektion 2-3 μm af det paraffin-indlejrede væv ved hjælp af et mikrotomt og anbringes på positivt ladede glasglas. Opbevar sektionsopdelt væv ved -80 °C indtil yderligere analyse.
2. Deparaffinisering, rehydrering og varmeinduceret antigenudtagning
- For at udføre deparaffinisering og rehydrering af sektioner på glasglas, skal du placere glasglasi stativer og proces i følgende rækkefølge:
- Nedsænk helt i 100% xylen i 3 min. Gentag dette trin 2x. Skyl ikke mellem trinene.
- Nedsænkes helt i faldende koncentrationer af ethanol (100%, 95%, 70%) ved stuetemperatur (RT), 3x i 3 min hver. Skyl ikke mellem trinene.
- Nedsænkes helt i deioniseret vand i 2 min. Gentag.
- Placer sektioner i Tris-bufferet saltvand med 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) i 2-3 min.
- Fyld beholderen med deioniseret vand opvarmet til 100 °C. Lad damperkammeret være i ligevægt i 20 min.
BEMÆRK: Varmeinduceret antigenudtagning udføres bedst med indirekte opvarmning genereret af en damper med en forudindstillet temperaturindstilling, f.eks. - Den kommercielt tilgængelige antigenudtagningsopløsning indeholdende Tris og EDTA (pH = 9) til 95-97 °C opvarmes på en temperaturstyret varmeplade under konstant omrøring. Sørg for, at det ikke koger.
BEMÆRK: Løsningen skal blive uklar, når den er varmet. - Hæld den opvarmede antigenudtagningsopløsning i en objektbeholder, og anbring beholderen i damperens kammer. Antigenudtagningsopløsningen skal bringes i ligevægt med damperens temperatur i 3-4 min. Sørg for, at temperaturen i kammeret er ~95 °C.
- helt ned i den opvarmede antigenudtagningsopløsning, og fortsæt med at anvende ekstern opvarmning via damperen i 20 min.
- Fjern objektglasbeholderen fra damperen, og lad objektglassene og antigenudtagningsopløsningen køle af til RT. Den fortyndede antigenudtagningsopløsning skal opbevares ved 4 °C, og genbrug op til 2x, hvis det er nødvendigt.
- Ser gliderne 3x med TBST i 5 min.
3. Immunmærkning og autofluorescensdæmpning
BEMÆRK: Tabel 1 indeholder oplysninger om sammensætningen af de blokerende buffere, der anvendes i følgende trin.
- Inkuber sektioner i Blokering Buffer 1 for 2 timer på RT under blid vuggende (30-50 rpm). Seal med paraffin film for at undgå tørring.
- Uden vask påføres straks 100 μL fortyndet kaninpolyklonal antihumant citrullinatet histone H3 (citH3) antistof (0,03 mg/ml fortyndet i blokerende buffer 1) direkte på objektglasset.
- Der anbringes en dæksel (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) på hver sektion, så antistofblandingen kan blive jævnt fordelt.
- Inkuber i 12-16 timer ved 4 °C med let rokkende (30-50 omdr./min.). Seal med parafilm film for at undgå tørring.
- Vask 3x med TBST i 5 min.
- Der påføres 100 μL gedeantikaninantistof konjugeret på Alexa Fluor 488 (fortyndet til en endelig koncentration på 0,04 mg/ml eller 1:50 i blokeringsbuffer 1) som beskrevet i trin 3.3. Inkuber i 1 time på RT under blid rokkende (30-50 rpm). Beskyt slides mod lys.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Inkuber sektioner i Blokeringbuffer 2 natten over ved 4 °C under skånsom rokkende (30-50 rpm). Beskyt mod lys.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Bloksektioner i Blokeringsbuffer 3 som beskrevet i trin 3.3 ved RT i 2 timer under skånsom rokkende (30-50 omdr./min.).
- Inkubersektioner med biotinylaterpolyklonalt polyklonalt ne-antistof (endelig koncentration = 0,2 μg/ml i blokerende buffer 3) ved 4 °C i 12-16 timer som beskrevet i trin 3.2-3.4.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Inkuber med Alexa Fluor 594 streptavidin konjugat (fortyndet til 1:100 eller 0,02 mg/ml i blokeringsbuffer 3) som beskrevet i trin 3.2-3.3 for 1 time på RT. Beskyt mod lys og tætning med paraffin for at forhindre tørring.
- Vask med TBST 1x i 5 min.
- Der påføres 100 μL blanding af autofluorescensdæmpningsdæmpningsopløsning direkte på sektionerne i 1 minut som anvist af fabrikanten.
- Vask straks objektglassene med TBST 6x i 10 min.
- Dæk hvert dias med 100 μL 300 nM DAPI i 5 minutter i mørke.
- Vask med TBST i 3 min. Gentag dette i alt 5x.
- Påfør en dråbe (~50 μL) antifademonteringsmedium, en del af autofluorescensdæmpningssættet, direkte på glasslidsen omkring sektionen. Anbring en dæksel (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) forsigtigt på sektionen uden at skabe bobler.
- Lad prøverne hærde natten over i mørke ved 4 °C, indtil monteringsmediet er hærdet til mikroskopisk analyse med nedsænkningslinser.
4. Neutrofile ekstracellulære fælde identifikation
BEMÆRK: Følgende protokol anvender et omvendt epifluorescensmikroskop med et 1.280 x 960 digitalt CCD-kamera (se Materialetabel).
- For at finde thrombi, scanne kranialt at caudally langs længden af aorta, aorta tvedeling, og hver femoral arterie ved hjælp af fase kontrast mikroskopi med en 10x mål. En trombe er et konglomerat af væv, der indeholder røde blodlegemer, hvide blodlegemer og blodplader ved siden af endotel på fase kontrast og lyse felt mikroskopi (Figur 2A, Figur 2B).
- Undersøg først afsnit for NET'er ved hjælp af DAPI-kanalen (excitation = 357/44 nm) med 10x og 20x-mål (figur 2C). Bemærk, at cfDNA fremstår som dekondenseret DNA, der ikke er inden for rammerne af cytoplasmaet i en celle, når det ses på fase kontrast eller lyse felt mikroskopi.
- Identificer ekstracellulær NE og citH3 på Texas Red-kanalerne (excitation = 585/29 nm, emission = 628/32 nm) og grøn fluorescerende proteinkanal (excitation = 470/22 nm, emission = 525/50 nm), henholdsvis med 10, 20 og 40x mål.
- Evaluere og analysere nets i en trombe ved hjælp af tilgængelig software, såsom Billede J (NIH). NET dannelse er identificeret baseret på samlokalisering af cfDNA, ekstracellulære citH3, og NE som tidligere beskrevet18. Bevar ensartet eksponeringstid og gevinster for hver kanal i hele erhvervelsen af billeder for at undgå mætning i pixelintensitet.
- Kort hver trombe baseret på dens nærhed til den faldende aorta ved at opdele det i tre lige store zoner, med Zone 1 tættest på aorta, Zone 3 længst fra aorta, og Zone 2 mellem Zone 1 og 3). Når operatøren er blindet for hvert forsøgspersons sygdom, skal der tages mindst ti tilfældige felter i hver zone. Karakterisere fordelingen af NET'er i thrombi ved at beregne antallet af felter med NET'er i hver zone eller beregne det gennemsnitlige NET-besætterområde pr. zone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol til deparaffinisering, varme-induceret antigen hentning, og dobbelt immunmærkning af paraffin-indlejret trombi, vi identificeret NETs i katte CATE for første gang. Thrombi inden for aorta tvefurcation var placeret ved fluorescens mikroskopi og lyse felt mikroskopi ved hjælp af standard H & E farvning og fase kontrast mikroskopi. På lyse felt mikroskopi, feline arteriel trombi bestod af røde blodlegemer, leukocytter, fibrin, og blodplader (Figur 3A). Selvom H&E ikke kan plette specifikke NET-komponenter, optrådte NET'er ofte som netværk af dybe lilla tråde af forskellig længde omkring nærliggende erythrocytter og leukocytter (Figur 3A,prikket kontur). En trombe blev karakteriseret som en godt afgrænset struktur i det vaskulære rum på fase kontrast mikroskopi (Figur 2A, Figur 4B). Vi bekræftede endvidere tilstedeværelsen af NETs inden for disse områder ved immunfluorescensmikroskopi (figur 3B). Forstørrelse af disse områder afslørede store aggregater af nets, der består af cfDNA, ekstracellulære citH3, og NE (Figur 2C, Figur 3B, hvid prikket skitse). Ved hjælp af den samme teknik til at søge efter trombi og NETs hos katte uden CATE, fandt vi, at ark lyzed neutrofiler kunne påvises lejlighedsvis i nærheden af endotel. Selv om disse neutrofiler viste nogle morfologiske egenskaber ved NET-dannelse, bør de ikke være forbundet med nogen organiseret trombe. Vi har ikke identificeret nogen trombi i nogen af kontrolprøverne (figur 4A).
Figur 5A viser dyb autofluorescens af blodpropelementer som erythrocytter og kollagen, når de afbildes ved den grønne (488 nm) bølgelængde, hvilket hæmmede vores evne til at detektere cfDNA og proteinkolokalisering. Vi fandt, at korte autofluorescens dæmpning ved hjælp af en kommercielt tilgængelig kit efter immunmærkning betydeligt øget følsomheden af protein colocalization og NET detektion, selv i områder med en overflod af erythrocytter (Figur 5B, pilespidser).
Figur 1: Repræsentative obduktionsfotografier af en dissekeret aortatfurcation fra en kat med kardiogent arteriel tromboemboli. (A) Den faldende aorta blev dissekeret 4-5 cm kraniel (Cr) til aorta tvedeling. (B) Fascia blev omhyggeligt dissekeret, indtil den faldende aorta (1) og iliaca arterier (2,3) var klart synlige på caudal aspekt (Cd). Bemærk trombe i aorta tfurcation (*). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative fasekontrast- og immunfluorescensbilleder af nets i et trombe, der findes i en felinaortatfurcation. (A) Fase kontrast mikroskopi afslørede en trombe som en diskret og godt afgrænset struktur tæt på aorta. Kombineret fase kontrast og fluorescens farvning af DNA (blå) viste tilstedeværelsen af leukocytter og celle-fri DNA i trombe. Det boxed område består af en stor koncentration af celle-fri DNA. Original 10x forstørrelse; Skalabjælke = 400 μm. (B) Det indpakkede område i (A) blev yderligere forstørret ved 20x. Cellefrit DNA og intracellulært DNA farves med DAPI (blå), neutrofil elastase (NE) og citrullinlinated histone H3 (citH3) syntes henholdsvis grøn og rød. (Original 20x forstørrelse; Skalabjælke = 100 μm). (C) NET, identificeret baseret på samlokalisering af cellefrit DNA, ekstracellulær NE og citH3, blev skitseret (stiplet linje). Original 40x forstørrelse; Skalabar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativt billede af en feline arteriel trombe ved hjælp af H&E og immunofluorescensfarvning. (A) På H&E-pletten var der en stor koncentration af neutrofiler og erythrocytter. Ekstracellulære kromatiner optrådte som dybe lilla tråde af forskellige længder omgivet af erythrocytter og neutrofiler (prikket kontur, sort pil). (B) Neutrofile ekstracellulære fælder blev let visualiseret ved hjælp af immunfluorescens mikroskopi på samme trombe (prikket omrids, hvid pil). NETs blev identificeret som samlokalisering af cfDNA (blå), NE (grøn) og citH3 (rød). Original 20x forstørrelse; Skalabar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative fasekontrast- og immunofluorescensbilleder af aortatfurcationer. (A) Fasekontrast og immunofluorescensbilleder af aortatfurcationer hos en kat uden arteriel trombose. Bemærk fraværet af trombose eller aggregater af neutrofiler i lumen af aorta tvelak fra katten uden arteriel trombose. (B) Fase kontrast og immunfluorescens billeder af aorta tvestik i en kat diagnosticeret med kardiogent arteriel tromboemboli. De aorta tvestik blev farves for DNA (blå), neutrofile elastase (grøn), og citrullinlinated histone H3 (rød). I dette tilfælde, et godt afgrænset trombus svulmende ind i vaskulære væg og besætter det meste af aorta lumen blev bemærket i katten med kardiogene arteriel tromboemboli. NETs, karakteriseret ved samlokalisering af cfDNA, NE, og citH3, blev identificeret inden for trombe (prikket skitse). Original 10x forstørrelse; Skalabar = 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentativ fasekontrast (PC) og immunofluorescensbilleder af arteriel trombi fra to katte. Diasene blev farves til citH3, NE og DNA og afbildet ved 488 nm (rød), 595 nm (grøn) og 357 nm (blå) bølgelængder ved henholdsvis 40x forstørrelse. Kardiogent arteriel thrombi hos katte havde en overflod af erythrocytter (*, stiplet linje). (A) Autofluorescens fra erythrocytter var mest fremtrædende på tværs af 488 nm bølgelængde, mindske påvisning af colocalization signal og identifikation af NETs. (B) Quenching reducerede autofluorescensen betydeligt ved 488 nm-bølgelængden, især i områder med en høj koncentration af erythrocytter (*, stiplet linje). Det forbedrede påvisning af colocalized proteiner, citH3, og neutrofile elastase (pilespids), i nærvær af erythrocytter (Scale bar = 200 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplement Figur 1: Repræsentative immunfluorescens billeder af arteriel trombi fra en kat. Sektionerne blev farves for DNA (blå), citH3 (rød), og enten myeloperoxidase (A) eller neutrofile elastase (B). (A) På trods af at udnytte en feline-specifikke myeloperoxidase antistof (MPO, 1:5), farvning intensiteten af MPO forblev dårlig. (B) Ved hjælp af et polyklonalt neutrofilelastase (NE) antistof, der vides at krydsreagere med flere arter, var immunreaktiviteten og farvningsintensiteten signifikant højere. Bemærk de karakteristiske lobulated kerner af neutrofiler omgivet af NE (pile). Original 40x forstørrelse; Scale bar = 100 μm. Klik her for at downloade dette tal.
| Blokeringsbuffer | Sammensætning | |
| 1 | TBS med 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% gedeserum | |
| 2 | TBS med 0,1% Tween-20, 10% kaninserum, 0,1%NP-40 | |
| 3 | TBS med 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabel 1: Sammensætning af blokerende buffere, der anvendes til immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en protokol til at identificere NETs i faste feline kardiogene trombi ved hjælp af en dobbelt immunmærkning protokol og immunfluorescens mikroskopi. Selv om kun kardiogene arteriel trombi blev plettet, kunne denne protokol i teorien anvendes til andre typer trombi og til andre veterinære arter. Identifikation af nets inden feline arterielt trombose tyder på, at NETs kan spille en rolle i trombose hos katte.
Påvisning af nets ved immunfluorescens i fast og paraffin-indlejret væv er overlegen i forhold til konventionelle histologiske pletter som H & E, som ofte viser tråde af kromatin omgivet af neutrofiler13. Immunhistokemi og immunfluorescens af fast arteriel trombi gør det muligt samtidig at påvise cfDNA og andre ekstracellulære proteiner som citH3, der vides at være specifikke for NETs dannelse18,19. Fordi kryopræparater er suboptimale til NET detektion i væv og trombi, vi bevaret vores prøver i 10% neutral-buffered formalin, som indeholder 4% formaldehyd og 10% methanol. Cellefrie nukleinsyrer er ikke direkte fastgjort med formaldehyd. I stedet er de immobiliseret inden for faste proteinstrukturer, som ændres ved delvist reversible methylenbro krydslinks induceret af formaldehyd20. For yderligere at begrænse artefakter og autofluorescens forårsaget af myresyre og ketoner genereret ved oxidation af formaldehyd, kan investigatorer vælge at bruge methanolfri paraformaldehyd fortyndet i buffer til fiksering. Da fikseringen ser ud til at påvirke immunreaktiviteten, anbefaler vi fiksering i højst 24 timer før dehydrering og paraffinindlejring. Paraffin-indlejret væv eller blodpropper kan derefter opbevares til deparaffinisering og farvning.
Kemisk fiksering ved formaldehyd og paraformaldehyd ændrer proteiners tertiære struktur, maskerer de pågældende antigener og forhindrer binding af antistoffer mod specifikke epitoper21. Antigen hentning, en proces, der bryder methylenbroen krydslinks, er afgørende, før der udføres immundetektion i formalin-faste væv. Baseret på forfatternes erfaring forbedrer varmeinduceret antigenudtagning ved hjælp af en alkalisk udtagningsopløsning (pH = 9 i Tris/EDTA buffer) med mild indirekte opvarmning påvisning af proteiner og nets og minimerer samtidig artefakter og autofluorescens. Antigenudtagningsopløsningens temperatur må ikke nå kogepunktet (>100 °C), da denaturering af proteiner kan føre til uspecifik binding og baggrundsstøj.
En begrænsning af NET-identifikation i faste blodpropper er, at immunfluorescensfarvning kan være meget varierende under forskellige antigen udtagningsbetingelser18. Sammenlignet med resultater fundet af Brinkmann et al., Fandt vi, at højere inkubationstemperaturer (> 55 °C) resulterede i optimal farvning af histoner i kernerne og dekondenseret kromatin19. Vi konstaterede imidlertid, at farvningsintensiteten af myeloperoxidase, et granuleret protein, der findes hos neutrofiler og nets, var lav under de foreslåede betingelser. Myeloperoxidases dårlige immunreaktivitet var konsekvent på trods af brugen af et kattespecifikt antistof (tillæg figur 1). Derfor opfordrer vi efterforskere til at ændre varigheden og betingelserne (f.eks. pH, temperatur) for antigenudtagningsprocessen for at give et tilfredsstillende signal baseret på det interessante antigen.
En af udfordringerne ved at identificere nets hos veterinærarter er manglen på artsspecifikke antistoffer. For at forhindre interferens, når der ved brug af primære antistoffer fra samme art, omfattede vi en ekstra blokering trin udnytte en høj koncentration af kanin immunglobuliner til at mætte eventuelle resterende bindende steder på ged anti-kanin sekundære antistoffer. En stor ulempe ved denne teknik er, at det er tidskrævende, fordi det kræver flere inkubationstrin. Efterforskerne bør omfatte to forskellige kontroller, der udelukker enten det primære antistof i det andet immunmærkningstrin for at sikre, at det sekundære antistof fra enten immunmærkningstrinbinder sig specifikt til detprimære antistof. Specificiteten af de identificerede NET-strukturer kan kontrolleres yderligere ved DNase-fordøjelsen eller medtagelsen af biologiske kontroller bestående af aortatfurcationer fra katte uden CATE (figur 5). Desuden bør negative kontroller, der består af den samme koncentration af isotype-kontrolantistoffer som de primære antistoffer, medtages for at udelukke uspecifikke antistofinteraktioner, uspecifik binding til Fc-receptorer og cellulær autofluorescens. Efterforskere rådes til at ændre denne protokol baseret på tilgængeligheden af artsspecifikke antistoffer. Hvis der ikke findes artsspecifikke antistoffer, anbefaler vi først at evaluere immunreaktiviteten af antistoffer ved hjælp af immuncytokemi eller at evaluere proteinudskriften fra de arter, der er af interesse for homologi, til de refererede udskrifter.
Faktorer som prøvefiksering, utilstrækkelig deparaffinisering og tilstedeværelsen af specifikke vævskomponenter kan føre til autofluorescens i trombi. Under aldehyd fiksering, aminer kan kombinere med aldehyder til at danne Schiff base komplekser, som udsender fluorescens22. Ufuldstændig deparaffinisering kan også kemisk ændre proteiner i vævet, skabe autofluorescens23. Ekstracellulære komponenter i vaskulære prøver såsom kollagen, elastin, og røde blodlegemer er rapporteret til naturligt fluorescere i pattedyr24,25. Da naturlig eller iatrogen autofluorescens er mest mærkbar i de grønne bølgelængder (excitation = 488 nm, emission = 500-550 nm), kan brugen af fjernrøde fluorophorer minimere nogle autofluorescens26. I den nuværende protokol, vi udnyttede en kommercielt tilgængelige autofluorescens dæmpning kit designet til elektrostatisk binde sig til autofluorescerende væv elementer. Vi anbefaler, at investigatorer optimerer varigheden af autofluorescensdæmpning, fordi producentens anbefaling på 5 min kan mindske immunreaktivitet af mindre rigelige proteiner. Alternativt kan efterforskere også dæmpe autofluorescens ved hjælp af Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidin eller trypan blå27.
Da NETs er heterogene fordelt inden for en trombe, anbefales en grundig kortlægning af hele aorta og iliaca arterier. Regioner positive for cfDNA, citH3, og NE er derefter forstørret. Samlokaliseringen af cfDNA, citH3 og NE er blevet udbredt til at identificere NET-dannelse og til at skelne NET-dannelse fra andre former for celledød. I modsætning til en nylig human undersøgelse, der fandt NETs at være koncentreret i periferien af koronar trombi, de fleste af de NETs i feline arteriel thrombi blev grupperet på kranieaspektet af blodproppen28. Selv om vi brugte en standardiseret protokol til at identificere nets, mikroskopisk evaluering og kvantificering af net er stadig subjektive. Her brugte vi en blindet og systematisk metode til at minimere observerbias under mikroskopisk analyse. Da antallet af nets i en prøve kan påvirkes af antallet af neutrofiler, kan investigatorer kvantificere nets i forhold til antallet af neutrofiler ved at identificere neutrofiler baseret på nuklear morfologi, cellediameter og ekspression af neutrofile-specifikke proteiner. En anden udfordring ved NET identifikation ved hjælp af mikroskopi er, at NETHar dårligt definerede margener, og de har tendens til at fusionere, danner tågede strukturer. Dette kan føre til under- eller overvurdering af antallet af NET'er i en given prøve. Derfor, i stedet for DAPI, nets kan farves ved hjælp af Sytox Green for klarere identifikation og denotation af celle-appendant DNA fra NETs dannelse.
Vi har udviklet en dobbelt immunmærkningsprotokol til at identificere nets i paraffin-indlejret feline arteriel trombi. Deparaffinisering, rehydrering og antigenudtagning skal finde sted før immunmærkning af citH3 og NE. Denne analyse kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af NET dannelse hos katte og give en bedre forståelse af patofysiologi cate hos katte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kevin Woolard for brug af fluorescens mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
