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Immunology and Infection

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान

Published: March 29, 2020 doi: 10.3791/60834
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

हम हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल और डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईआईटी) की पहचान करने की विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस), सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए) से बना और हिस्टोन और न्यूट्रोफिल इलास्टेलेज (एनई) जैसे प्रोटीन, प्रणालीगत सूजन या रोगजनकों के जवाब में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं। हालांकि नेट्स पहले थक्के गठन को बढ़ाने और मनुष्यों और कुत्तों में फाइब्रिनोलिसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE), हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी के लिए एक जीवन के लिए खतरा जटिलता माध्यमिक के साथ बिल्लियों में NETs की भूमिका , अज्ञात है। बिल्लियों में कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि CATE में उनकी रोग भूमिका के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाएगी। यहां, हम नेक्रॉप्सी के दौरान निकाले गए महाधमनी विभाजन के भीतर फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। जाइलीन के साथ अपपैरीकरण के बाद, महाधमनी वर्गों अप्रत्यक्ष गर्मी प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति से गुजरना पड़ा । इसके बाद खंडों को अवरुद्ध, परमीबिलाइज्ड, और पूर्व वीवो नेट्स की पहचान सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए), साइट्रलिनाइज्ड हिस्टोन एच 3 (सीआईटीएच3) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के सहस्थानीयकरण द्वारा की गई थी। थ्रोम्बी में एनईटीएस के इम्यूनोडिटेक्शन को अनुकूलित करने के लिए, माइक्रोस्कोपी से पहले ऑटोफ्लोरेसेंस शमन प्रक्रिया का उपयोग करके ऊतक तत्वों का ऑटोफ्लोरेसेंस सीमित था। यह तकनीक अन्य प्रजातियों में NETs और थ्रोम्बोसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकती है और इस जटिल स्थिति के रोगविज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

Introduction

हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी वाली बिल्लियों को जीवन के लिए खतरा थ्रोम्बोएम्बोलिक जटिलताओं का खतरा होता है1,2। बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE) से जुड़ी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के बावजूद, बिल्लियों में CATE के अंतर्निहित रोगविज्ञान को खराब समझा जाता है। इस विनाशकारीस्थितिके खतरे में बिल्लियों के इलाज और पहचानने के लिए सीमित नैदानिक और चिकित्सीय उपकरण भी हैं ।

सहज प्रतिरक्षा में अपनी भूमिका के अलावा, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोसिस में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईटी) जारी करके भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जो कोशिका-मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) के वेब-जैसे नेटवर्क हैं जो न्यूट्रोफिल इलास्टेस्टेस (एनई) और माएलोपेरोक्सिडा सों जैसे हिस्टोन और दानेदार प्रोटीन से घिरे हुए हैं। न्यूट्रोफिल प्रणालीगत सूजन, रोगजनकों के साथ सीधी मुठभेड़ और सक्रिय प्लेटलेट्स4,,5,,6,,7के साथ बातचीत के जवाब में NETs गठन से गुजरना पड़ता है। कुत्तों में, न्यूट्रोफिल-व्युत्पन्न डीएनए को थक्का लाइसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि नेट प्रोटीन थक्के के गठन में तेजी लाते हैं । परिसंचारी कोशिकाओं और जमावट घटकों को ट्रैप करने के लिए एनईटीएस की क्षमता भी उनके थ्रोम्बोजेनिक गुणों8,9,10,11,12के लिए महत्वपूर्ण है ।

एनईटीएस का पता एक्स्ट्रासेलुलर न्यूट्रोफिल प्रोटीन, हिस्टोन और सीएफडीएनए के सहस्थानीयकरण द्वारा लगाया जाता है। इस वजह से, डिपर्फिनाइज्ड ऊतकों की प्रतिकार द्वारा निश्चित ऊतकों में एनईटीएस की पहचान और मात्राकाकरण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी4,,5का उपयोग करके पारंपरिक हेमैटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग से बेहतर है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कई मानव अध्ययनों ने नेट्स को कोरोनरी धमनी थ्रोम्बी, सेरेब्रल स्ट्रोक थ्रोम्बी, एथेरोट्रोम्बोसिस, और वेनस थ्रोम्बी13,,14,15,,16,,17के संरचनात्मक घटकों के रूप में पहचाना।, आज तक, बिल्ली के समान थ्रोम्बी में एनईटीएस का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन नहीं किया गया है। क्योंकि बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान NETs और थ्रोम्बोसिस में भविष्य के अनुवाद अनुसंधान की सुविधा हो सकती है, हम बिल्लियों में पैराफिन-एम्बेडेड धमनी थ्रोम्बी में नेट पहचान और मूल्यांकन की तकनीकों का वर्णन करते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था । नेक्रॉप्सी और ऊतकों की बायोप्सी मालिकों की सहमति से की गई थी।

1. ऊतक निर्धारण, एम्बेडिंग, और अनुभागन

  1. मानव इच्छामृत्यु या मृत्यु के तुरंत बाद, उतरते महाधमनी, ऊर्ध्वाधर धमनी, और आम इलियाक धमनियों(चित्रा 1A)सहित महाधमनी विभाजन को विच्छेदन करें। कुंद बाहर fascia विच्छेदन(चित्रा 1B)यह पूरी तरह से 10% तटस्थ में जलमग्न से पहले 24 घंटे की एक ंयूनतम के लिए औपचारिक और अब ४८ घंटे से अधिक ।
  2. नमूने को निर्जलित करने के लिए, पहले 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन में जलमग्न हो जाएं। फिर, इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता में डूब37 डिग्री सेल्सियस (70%, 95%, 100%) 1 घंटे प्रत्येक के लिए 2x। अंत में, रिंसिंग के बिना, 100% टोल्यून में 2x को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. 62 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पैराफिन जोड़ें और पैराफिन को रात भर पूरी तरह से जमना करने की अनुमति दें।
  4. माइक्रोटोम का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक की धारा 2-3 माइक्रोन और सकारात्मक रूप से चार्ज ग्लास स्लाइड पर रखें। अगले विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागित ऊतकों को स्टोर करें।

2. डिपरफिनाइजेशन, रिहाइड्रेशन, और गर्मी से प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल

  1. कांच स्लाइड पर खंडों के अपपैरन और रिहाइड्रेशन करने के लिए, रैक में ग्लास स्लाइड रखें और निम्नलिखित क्रम में प्रक्रिया करें:
    1. 3 मिन के लिए 100% जाइलीन में पूरी तरह से जलमग्न। 2x इस कदम को दोहराएं। चरणों के बीच में कुल्ला न करें।
    2. इथेनॉल (100%, 95%, 70%) की सांद्रता को कम करने में पूरी तरह से जलमग्न कमरे के तापमान (आरटी), 3 न्यूनतम प्रत्येक के लिए 3x पर। चरणों के बीच में कुल्ला न करें।
    3. 2 मिन के लिए deionized पानी में पूरी तरह से जलमग्न । दोहराएं ।
  2. 2-3 मिन के लिए 0.1% ट्वीन (TBST, पीएच = 7.6) के साथ ट्रिस-बफर्ड लवण में वर्गों को रखें।
  3. जलाशय को 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी से भरें। स्टीमर चैंबर को 20 मिन के लिए समतुल्य करने की अनुमति दें।
    नोट: गर्मी से प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति सबसे अच्छा एक पूर्व निर्धारित तापमान सेटिंग के साथ एक स्टीमर द्वारा उत्पन्न अप्रत्यक्ष हीटिंग के साथ किया जाता है, जैसे एक खाद्य स्टीमर ।
  4. लगातार सरगर्मी के साथ तापमान नियंत्रित गर्म प्लेट पर Tris और EDTA (पीएच = 9) से 95-97 डिग्री सेल्सियस तक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान को गर्म करें। सुनिश्चित करें कि यह फोड़ा नहीं है।
    नोट: समाधान गर्म होने के बाद बादल छाए रहने चाहिए।
  5. गर्म एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान को स्लाइड कंटेनर में डालें और कंटेनर को स्टीमर के कक्ष में रखें। एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान को 3-4 न्यूनतम के लिए स्टीमर के तापमान तक संतुलन बनाने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि कक्ष का तापमान ~ 95 डिग्री सेल्सियस है।
  6. गर्म एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान में पूरी तरह से स्लाइड जलमग्न और 20 मिन के लिए स्टीमर के माध्यम से बाहरी हीटिंग के आवेदन जारी रखें ।
  7. स्टीमर से स्लाइड कंटेनर निकालें और स्लाइड और एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान को आरटी को ठंडा करने की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला एंटीजन रिट्रीवल सॉल्यूशन स्टोर करें और जरूरत पड़ने पर 2x तक दोबारा इस्तेमाल करें।
  8. 5 मिन के लिए TBST के साथ स्लाइड 3x धोएं।

3. इम्यूनोलेबलिंग और ऑटोफ्लोरेसेंस शमन

नोट: तालिका 1 निम्नलिखित चरणों में उपयोग किए जाने वाले ब्लॉकिंग बफ़र्स की संरचना का विवरण देता है।

  1. कोमल कमाल (30-50 आरपीएम) के तहत आरटी में 2 एच के लिए बफर 1 अवरुद्ध में इनक्यूबेट वर्गों । सूखने से बचने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ सील करें।
  2. धोने के बिना, तुरंत पतला खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-ह्यूमन साइट्रलिनाट हिस्टोन एच 3 (citH3) एंटीबॉडी (0.03 मिलीग्राम/mL को अवरुद्ध करने में पतला बफर 1) के 100 माइक्रोन सीधे स्लाइड पर लागू करें।
  3. एंटीबॉडी मिश्रण के वितरण की अनुमति देने के लिए प्रत्येक खंड पर एक कवरस्लिप (24 मिमी x 40 मिमी x 0.13-0.17 मिमी) रखें।
  4. कोमल कमाल (30-50 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट। सूखने से बचने के लिए पैराफिल्म फिल्म के साथ सील।
  5. 5 मिन के लिए TBST के साथ 3x धोएं।
  6. एलेक्सा फ्लोर 488 (0.04 मिलीग्राम/mL या ब्लॉकिंग बफर 1 में 1:50 की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला) के रूप में चरण 3.3 में वर्णित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के 100 μL लागू करें। कोमल कमाल (30-50 आरपीएम) के तहत आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट । स्लाइड प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  7. 5 मिन के लिए TBST 3x के साथ धोलें।
  8. कोमल कमाल (30-50 आरपीएम) के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर 2 अवरुद्ध में इनक्यूबेट वर्गों। प्रकाश से रक्षा करें।
  9. 5 मिन के लिए TBST 3x के साथ धोलें।
  10. बफर 3 अवरुद्ध में ब्लॉक वर्गों के रूप में कोमल कमाल (30-50 आरपीएम) के तहत 2 घंटे के लिए आरटी में चरण ३.३ में वर्णित है ।
  11. बायोटिनीपॉलीक्लोनल खरगोश एंटी-ह्यूमन एनई एंटीबॉडी (अंतिम एकाग्रता = 0.2 μg/mL अवरुद्ध बफर 3 में) के साथ इनक्यूबेट वर्गों के रूप में 12-16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर के रूप में कदम 3.2-3.4 में वर्णित है ।
  12. 5 मिन के लिए TBST 3x के साथ धोलें।
  13. एलेक्सा फ्लोर 594 स्ट्रेप्टाविडिन कॉन्जुगेट (ब्लॉकिंग बफर 3 में 1:100 या 0.02 मिलीग्राम/mL तक पतला) के साथ इनक्यूबेट जैसा कि आरटी में 1 घंटे के लिए चरण 3.2-3.3 में वर्णित है। सूखने से रोकने के लिए पैराफिन के साथ प्रकाश और सील से बचाएं।
  14. 5 मिन के लिए TBST 1x के साथ धोलें।
  15. निर्माता द्वारा निर्देश के अनुसार 1 मिन के लिए वर्गों पर सीधे ऑटोफ्लोरेसेंस शमन समाधान मिश्रण के 100 μL लागू करें।
  16. 10 मिन के लिए TBST 6x के साथ तुरंत स्लाइड धोएं।
  17. अंधेरे में 5 मिन के लिए 300 एनएम DAPI के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर करें।
  18. 3 मिन के लिए TBST के साथ धोएं। कुल 5x के लिए इसे दोहराएं।
  19. एंटीफ़्ड बढ़ते माध्यम की एक बूंद (~ 50 माइक्रोन) लागू करें, ऑटोफ्लोरेसेंस शमन किट का हिस्सा, सीधे अनुभाग के आसपास के ग्लास स्लाइड पर। किसी भी बुलबुले को बनाने के बिना सेक्शन पर एक कवरस्लिप (24 मिमी x 40 मिमी x 0.13-0.17 मिमी) रखें।
  20. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर इलाज करने की अनुमति दें जब तक कि बढ़ते माध्यम विसर्जन लेंस के साथ सूक्ष्म विश्लेषण के लिए कठोर न हो जाएं।

4. न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप पहचान

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल 1,280 x 960 डिजिटल सीसीडी कैमरे के साथ एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. थ्रोम्बी का पता लगाने के लिए, 10x उद्देश्य के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके महाधमनी, महाधमनी विभाजन और प्रत्येक ऊर्ध्वाधर धमनी की लंबाई के साथ कौड़ी तक क्रैन करें। थ्रोम्बस लाल रक्त कोशिकाओं, सफेद रक्त कोशिकाओं, और चरण के विपरीत और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2A, चित्रा 2B)पर एंडोथेलियम से सटे प्लेटलेट्स युक्त ऊतक का एक समूह है।
  2. पहले 10x और 20x उद्देश्यों(चित्रा 2C)के साथ DAPI चैनल (उत्तेजना = 357/44 एनएम) का उपयोग कर NETs के लिए वर्गों की जांच करें । ध्यान दें कि सीएफडीएनए डीकंडकन डीएनए के रूप में दिखाई देता है जो चरण विपरीत या उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी पर देखे जाने पर कोशिका के साइटोप्लाज्म के दायरे में नहीं होता है।
  3. टेक्सास लाल चैनलों पर बाह्युलर NE और citH3 की पहचान (उत्तेजना = 585/29 एनएम, उत्सर्जन = 628/32 एनएम) और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल (उत्तेजना = 470/22 एनएम, उत्सर्जन = 525/50 एनएम), क्रमशः 10, 20, और 40x उद्देश्यों के साथ ।
  4. इमेज जे (एनआईएच) जैसे उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके थ्रोम्बस के भीतर NETs का मूल्यांकन और विश्लेषण करें। नेट गठन की पहचान सीएफडीएनए, बाह्युलर सिट3 और एनई के सहस्थानीयकरण के आधार पर की जाती है जैसा कि पहले18वर्णित था। पिक्सेल तीव्रता में संतृप्ति से बचने के लिए छवियों के अधिग्रहण के दौरान प्रत्येक चैनल के लगातार एक्सपोजर समय और लाभ बनाए रखें।
  5. प्रत्येक थ्रोम्बस को तीन समान क्षेत्रों में विभाजित करके उतरते महाधमनी की निकटता के आधार पर मानचित्रित करें, जिसमें महाधमनी के निकटतम जोन 1, महाधमनी से जोन 3 दूर, और जोन 1 और 3 के बीच जोन 2)। प्रत्येक विषय की चिकित्सा स्थिति के लिए अंधा ऑपरेटर के साथ, प्रत्येक क्षेत्र में कम से कम दस यादृच्छिक क्षेत्र ों ले लो। प्रत्येक क्षेत्र में NETs के साथ क्षेत्रों की संख्या औसत या प्रति क्षेत्र औसत नेट पर कब्जा क्षेत्र की गणना करके थ्रोम्बी में NETs के वितरण की विशेषता है ।

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Representative Results

डिपरफिनाइजेशन, हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल, और पैराफिन-एम्बेडेड थ्रोम्बी के डबल इम्यूनोलेबलिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पहली बार बिल्ली के समान CATE में NETs की पहचान की। महाधमनी विभाजन के भीतर थ्रोम्बी मानक एच एंड ई धुंधला और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थित थे। उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी पर, बिल्ली के समान धमनी थ्रोम्बी में लाल रक्त कोशिकाएं, ल्यूकोसाइट्स, फिब्रिन और प्लेटलेट्स(चित्रा 3ए)शामिल थे। यद्यपि एच एंड ई विशिष्ट नेट घटकों को दाग नहीं दे सकता है, एनईटी अक्सर आस-पास के एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स(चित्रा 3ए,बिंदीदार रूपरेखा) के आसपास के विभिन्न लंबाई के गहरे बैंगनी धागे के नेटवर्क के रूप में दिखाई देते थे। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2A, चित्रा 4B)पर संवहनी अंतरिक्ष के भीतर एक अच्छी तरह से सीमांकित संरचना के रूप में एक थ्रोम्बस की विशेषता थी। हमने इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3बी)द्वारा इन क्षेत्रों के भीतर NETs की उपस्थिति की पुष्टि की । इन क्षेत्रों के आवर्धन ने सीएफडीएना, एक्स्सेल्युलर सिट3 और एनई(चित्रा 2सी, चित्रा 3B,सफेद बिंदीदार रूपरेखा) से बना एनईटीएस के बड़े समुचित कार्यों का खुलासा किया। एक ही तकनीक का उपयोग करने के लिए CATE के बिना बिल्लियों में थ्रोम्बी और NETs के लिए खोज, हमने पाया कि lyzed neutrophils की चादरें कभी-कभार एंडोथेलियम के करीब निकटता में पता लगाया जा सकता है । यद्यपि इन न्यूट्रोफिल्स ने नेट गठन की कुछ रूपात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित किया, लेकिन उन्हें किसी भी संगठित थ्रोम्बस से नहीं जोड़ा जाना चाहिए। हमने किसी भी नियंत्रण नमूनों(चित्रा 4ए)में किसी भी थ्रोम्बी की पहचान नहीं की ।

चित्रा 5A हरे (488 एनएम) तरंगदैर्ध्य में छवि होने पर एरिथ्रोसाइट्स और कोलेजन जैसे थक्के तत्वों के गहन ऑटोफ्लोरेसेंस को दर्शाता है, जिसने सीएफडीएनए और प्रोटीन कोस्थानीयकरण का पता लगाने की हमारी क्षमता में बाधा डाली। हमने पाया कि इम्यूनोलेबलिंग के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके संक्षिप्त ऑटोफ्लोरेसेंस शमन ने प्रोटीन कोस्थानीयकरण और नेट डिटेक्शन की संवेदनशीलता में काफी वृद्धि की, यहां तक कि एरिथ्रोसाइट्स(चित्रा 5B,एरोहेड्स) की बहुतायत वाले क्षेत्रों में भी।

Figure 1
चित्रा 1: कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म के साथ एक बिल्ली से विच्छेदित महाधमनी विभाजन की प्रतिनिधि नेक्रॉप्सी तस्वीरें। (A)उतरते महाधमनी को महाधमनी विभाजन के लिए 4-5 सेमी कपाल (सीआर) विच्छेदित किया गया था। (ख)प्रावरणी को ध्यान से तब तक विच्छेदित किया गया जब तक कि उतरते महाधमनी (1) और इलियाक धमनियां (2,3) कौंडल पहलू (सीडी) पर स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देतीं। महाधमनी विभाजन (*) के भीतर थ्रोम्बस पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक बिल्ली के समान महाधमनी विभाजन के भीतर पाए जाने वाले थ्रोम्बस में एनईटीएस की प्रतिनिधि चरण विपरीत और प्रतिकार छवियां। (A)चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी महाधमनी के करीब एक असतत और अच्छी तरह से सीमांकित संरचना के रूप में एक थ्रोम्बस का पता चला । संयुक्त चरण के विपरीत और डीएनए (नीले) के फ्लोरेसेंस धुंधला थ्रोम्बस के भीतर ल्यूकोसाइट्स और सेल मुक्त डीएनए की उपस्थिति दिखाई । बॉक्स्ड क्षेत्र में कोशिका मुक्त डीएनए की एक बड़ी एकाग्रता होती है। मूल 10x आवर्धन; स्केल बार = 400 माइक्रोन (बी)(ए) में बॉक्स्ड क्षेत्र को 20x में और बढ़ाया गया था। सेल-फ्री डीएनए और इंट्रासेलर डीएनए DAPI (ब्लू), न्यूट्रोफिल इलास्टीज़ (NE) और साइट्रलिनाटेड हिस्टोन एच 3 (सिट्रलिनाटेड हिस्टोन एच 3 (सिट्रलिनाटेड हिस्टोन एच 3 (सिट्रलिनाटेड हिस्टोन एच 3) के साथ क्रमशः हरे और लाल दिखाई दिए। (मूल 20x आवर्धन; स्केल बार = 100 माइक्रोन)। (ग)सेल-फ्री डीएनए, एक्स्सेल्युलर एनई और सिट3 के सहस्थानीयकरण के आधार पर पहचाने गए एनईटीएस को रेखांकित किया गया (बिंदीदार रेखा) । मूल 40x आवर्धन; स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके एक बिल्ली के समान धमनी थ्रोम्बस की प्रतिनिधि छवि। (A)एच एंड ई दाग पर, न्यूट्रोफिल और एरिथ्रोसाइट्स की बड़ी एकाग्रता दिखाई दे रही थी। एक्स्ट्रासेलुलर क्रोमेटिन एरिथ्रोसाइट्स और न्यूट्रोफिल (बिंदीदार रूपरेखा, काला तीर) से घिरे विभिन्न लंबाई के गहरे बैंगनी धागे के रूप में दिखाई दिए। (ख)न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर जाल को आसानी से एक ही थ्रोम्बस (बिंदीदार रूपरेखा, सफेद तीर) पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की गई थी। एनईटीएस की पहचान सीएफडीएनए (ब्लू), एनई (ग्रीन) और सिथ3 (लाल) के सहस्थानीयकरण के रूप में की गई थी । मूल 20x आवर्धन; स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र4: प्रतिनिधि चरण विपरीत और महाधमनी विभाजन की प्रतिकार छवियां। (क)धमनी थ्रोम्बोसिस के बिना बिल्ली में महाधमनी विभाजन की चरण विपरीत और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। धमनी थ्रोम्बोसिस के बिना बिल्ली से महाधमनी विभाजन के लुमेन के भीतर थ्रोम्बी या न्यूट्रोफिल की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। (ख)कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म के साथ निदान बिल्ली में महाधमनी विभाजन के चरण विपरीत और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां । महाधमनी विभाजन डीएनए (नीले), न्यूट्रोफिल इलास्टीज़ (हरा) के लिए दाग थे, और खट्टे हिस्टोन H3 (लाल) । इस मामले में, एक अच्छी तरह से सीमांकित थ्रोम्बस संवहनी दीवार में उभड़ा हुआ और अधिकांश महाधमनी लुस पर कब्जा करने के लिए बिल्ली में कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म के साथ नोट किया गया था। सीएफएमडीएनए, एनई और सिथ 3 के सहस्थानीयकरण की विशेषता एनईटीएस की पहचान थ्रोम्बस (बिंदीदार रूपरेखा) के भीतर की गई थी। मूल 10x आवर्धन; स्केल बार = 400 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि चरण विपरीत (पीसी) और दो बिल्लियों से धमनी थ्रोम्बी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। स्लाइड्स citH3, NE, और डीएनए के लिए दाग थे और ४८८ एनएम (लाल), ५९५ एनएम (हरे), और ३५७ एनएम (नीले) तरंगदैर्ध्य, क्रमशः, 40x आवर्धन पर छवि । बिल्लियों में कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में एरिथ्रोसाइट्स (*, बिंदीदार रेखा) की बहुतायत थी। (A)एरिथ्रोसाइट्स से ऑटोफ्लोरेसेंस 488 एनएम तरंगदैर्ध्य में सबसे प्रमुख था, जिससे कोस्थानीयकरण संकेत का पता लगाया गया और NETs की पहचान हुई। (ख)488 एनएम तरंगदैर्ध्य में ऑटोफ्लोरेसेंस को काफी कम करना, विशेष रूप से एरिथ्रोसाइट्स (*, बिंदीदार रेखा) की उच्च एकाग्रता वाले क्षेत्रों में। इसने एरिथ्रोसाइट्स (स्केल बार = 200 माइक्रोन) की उपस्थिति में कोलोकलाइज्ड प्रोटीन, सिथ 3 और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एरोहेड) का पता लगाने में वृद्धि की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: एक बिल्ली से धमनी थ्रोम्बी के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। धाराओं डीएनए (नीले), citH3 (लाल), और या तो myeloperoxidase(ए)या न्यूट्रोफिल इलास्टीज़(बी)के लिए दाग थे । (क)एक बिल्ली के समान-विशिष्ट myeloperoxidase एंटीबॉडी (एमएसपीओ, 1:5) का उपयोग करने के बावजूद, एमएसपीओ की धुंधला तीव्रता खराब रही । (ख)पॉलीक्लोनल न्यूट्रोफिल इलास्टीज़ (एनई) एंटीबॉडी का उपयोग करना, जिसे कई प्रजातियों के साथ क्रॉस-रिएक्ट करने के लिए जाना जाता है, इम्यूनोरेसी और धुंधला तीव्रता काफी अधिक थी । NE (तीर) से घिरे न्यूट्रोफिल की विशेषता लॉबुटेड नाभिक पर ध्यान दें। मूल 40x आवर्धन; स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर अवरुद्ध संरचना
1 0.1% ट्वीन-20, 0.1% NP40, 5% बकरी सीरम के साथ टीबीएस
2 0.1% ट्वीन-20, 10% खरगोश सीरम, 0.1% एनपी-40 के साथ टीबीएस
3 0.1% ट्वीन-20, 5% बीएसए, 0.1% एनपी-40 के साथ टीबीएस

तालिका 1: प्रतिरक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स को अवरुद्ध करने की संरचना।

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Discussion

हम एक डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निश्चित बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यद्यपि केवल कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी को दाग दिया गया था, सिद्धांत रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य प्रकार के थ्रोम्बी और अन्य पशु चिकित्सा प्रजातियों के लिए किया जा सकता है। बिल्ली के समान धमनी थ्रोम्बी के भीतर NETs की पहचान से पता चलता है कि NETs बिल्लियों में थ्रोम्बोसिस में भूमिका निभा सकता है।

फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा NETs का पता लगाना एच एंड ई जैसे पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल दाग से बेहतर है, जो अक्सर न्यूट्रोफिल13से घिरे क्रोमेटिन के धागे दिखाता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और फिक्स्ड धमनी थ्रोम्बी की इम्यूनोहिस्टोसेंस सीएफडीएन और सीआईटीएच 3 जैसे अन्य बाह्य प्रोटीन का एक साथ पता लगाने की अनुमति देती है, जिसे NETs गठन18,,19के लिए विशिष्ट माना जाता है। क्योंकि ऊतकों और थ्रोम्बी में नेट डिटेक्शन के लिए क्रायोतैयारी सबऑप्टिमस हैं, हमने अपने नमूनों को 10% तटस्थ-बफरफॉर्ममें संरक्षित किया, जिसमें 4% फॉर्मलडिहाइड और 10% मेथनॉल शामिल हैं। सेल-फ्री न्यूक्लिक एसिड सीधे फॉर्मलडिहाइड द्वारा तय नहीं किए जाते हैं। इसके बजाय, उन्हें निश्चित प्रोटीन संरचनाओं के भीतर स्थिर किया जाता है, जिन्हें फॉर्मलडिहाइड20द्वारा प्रेरित आंशिक रूप से प्रतिवर्ती मिथिलीन पुल क्रॉसलिंक द्वारा बदल दिया जाता है। फॉर्मलडिहाइड के ऑक्सीकरण द्वारा उत्पन्न फॉर्मिक एसिड और कीटोन के कारण कलाकृतियों और ऑटोफ्लोरेसेंस को और सीमित करने के लिए, जांचकर्ता निर्धारण के लिए बफर में पतला मेथनॉल-मुक्त पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करना चुन सकते हैं। क्योंकि निर्धारण की अवधि इम्यूनोरेएक्टिविटी को प्रभावित करती है, हम निर्जलीकरण और पैराफिन एम्बेडिंग से पहले 24 घंटे से अधिक समय तक निर्धारण की सलाह देते हैं। पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों या थक्के को फिर डिपरफिनाइजेशन और धुंधला करने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

फॉर्मलडिहाइड और पैराफॉर्मलडिहाइड द्वारा रासायनिक निर्धारण प्रोटीन की तृतीयक संरचना को बदल देता है, ब्याज के एंटीजन को मास्क िंग करता है और विशिष्ट एपिटोप21को एंटीबॉडी के बंधन को रोकता है। एंटीजन रिट्रीवल, एक प्रक्रिया जो मेथिलीन ब्रिज क्रॉसलिंक को तोड़ती है, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों में इम्यूनोडिटेक्शन करने से पहले आवश्यक है। लेखकों के अनुभव के आधार पर, हल्के अप्रत्यक्ष हीटिंग के साथ एक क्षारीय पुनर्प्राप्ति समाधान (पीएच = 9 इन ट्रिस/ईटीए बफर) का उपयोग करके गर्मी से प्रेरित एंटीजन रिट्रीवलल कलाकृतियों और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करते हुए प्रोटीन और एनईटीएस का पता लगाने को बढ़ाता है । एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान का तापमान उबलते बिंदु (>100 डिग्री सेल्सियस) तक नहीं पहुंचना चाहिए, क्योंकि प्रोटीन की निंदा गैर-विशिष्ट बाध्यकारी और पृष्ठभूमि शोर का कारण बन सकती है।

निश्चित थक्के में नेट पहचान की एक सीमा यह है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अलग-अलग एंटीजन रिट्रीवल स्थितियों के तहत अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकता है18. ब्रिंकमैन एट अल द्वारा पाए गए परिणामों के बराबर, हमने पाया कि उच्च ऊष्मायन तापमान (>55 डिग्री सेल्सियस) के परिणामस्वरूप नाभिक और डींकंस्न्ड क्रोमेटिन19में हिस्टोन का इष्टतम धुंधला हो गया। हालांकि, हमने पाया कि मिएलोपेरॉक्सिडेस की धुंधला तीव्रता, न्यूट्रोफिल और नेट्स में पाया जाने वाला एक दानेदार प्रोटीन प्रस्तावित परिस्थितियों में कम था । बिल्ली के समान-विशिष्ट एंटीबॉडी(पूरक चित्रा 1)के उपयोग के बावजूद माईएलोपेरॉक्सिडेस की खराब प्रतिरक्षा गतिविधि सुसंगत थी। इसलिए, हम जांचकर्ताओं को एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया की अवधि और शर्तों (जैसे, पीएच, तापमान) को संशोधित करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ताकि ब्याज के एंटीजन के आधार पर संतोषजनक संकेत मिल सके ।

पशु चिकित्सा प्रजातियों में NETs की पहचान करने की चुनौतियों में से एक प्रजातियों की कमी है विशिष्ट एंटीबॉडी । एक ही प्रजाति से निकलने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय सामना किए गए हस्तक्षेप को रोकने के लिए, हमने बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी पर किसी भी शेष बाध्यकारी साइटों को संतृप्त करने के लिए खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन की उच्च एकाग्रता का उपयोग करते हुए एक अतिरिक्त अवरुद्ध कदम शामिल किया। इस तकनीक का एक बड़ा नुकसान यह है कि यह समय लेने वाली है, क्योंकि इसके लिए कई ऊष्मायन चरणों की आवश्यकता होती है। जांचकर्ताओं को दो अलग-अलग नियंत्रण शामिल होने चाहिए जो दूसरे इम्यूनोलेबलिंग कदम में या तो प्राथमिक एंटीबॉडी को बाहर करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि या तो इम्यूनोलेबलिंग स्टेप से माध्यमिक एंटीबॉडी विशेष रूप से अपने प्राथमिक एंटीबॉडी को बांधता है। पहचाने गए नेट संरचनाओं की विशिष्टता को DNase पाचन या जैविक नियंत्रणों को शामिल करने से सत्यापित किया जा सकता है जिसमें कैटके बिना बिल्लियों से महाधमनी विभाजन(चित्रा 5)शामिल हैं। इसके अलावा, इसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी की एक ही एकाग्रता से मिलकर नकारात्मक नियंत्रण ों को गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी इंटरैक्शन, एफसी रिसेप्टर्स के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी और सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस को खारिज करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए। जांचकर्ताओं को प्रजातियों के विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता के आधार पर इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने की सलाह दी जाती है । यदि कोई प्रजाति-विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो हम पहले इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके एंटीबॉडी की प्रतिरक्षागतिविधि का मूल्यांकन करने या संदर्भित प्रतिलिपियों के लिए होमोलॉजी के लिए ब्याज की प्रजातियों से प्रोटीन ट्रांसक्रिप्ट का मूल्यांकन करने की सलाह देते हैं।

नमूना निर्धारण, अपर्याप्त अपपैरीकरण, और विशिष्ट ऊतक घटकों की उपस्थिति जैसे कारक थ्रोम्बी में ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बन सकते हैं। एल्डिहाइड निर्धारण के दौरान, अमीन शिफ बेस कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए एल्डिहाइड के साथ गठबंधन कर सकते हैं, जो फ्लोरेसेंस22उत्सर्जित करते हैं। अधूरा अपपैरीकरण भी रासायनिक रूप से ऊतक में प्रोटीन को संशोधित कर सकता है, जिससे ऑटोफ्लोरेसेंस23पैदा हो सकता है। कोलेजन, इलास्टिन और लाल रक्त कोशिकाओं जैसे संवहनी नमूनों में अतिरिक्त कोशिकीय घटकों को स्तनधारियों में स्वाभाविक रूप से फ्लोरेस24,,25की सूचना दी जाती है। क्योंकि प्राकृतिक या आयटेरोजेनिक ऑटोफ्लोरेसेंस हरे तरंगदैर्ध्य (उत्तेजना = 488 एनएम, उत्सर्जन = 500-550 एनएम) में सबसे अधिक ध्यान देने योग्य है, इसलिए दूर-लाल फ्लोरोफोरस का उपयोग कुछ ऑटोफ्लोरोसेंस26को कम कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑटोफ्लोरेसेंस शमन किट का उपयोग किया जो इलेक्ट्रोस्टैटिकरूप से ऑटोफ्लोरोसेंट ऊतक तत्वों को बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया था। हम अनुशंसा करते हैं कि जांचकर्ता ऑटोफ्लोरेसेंस शमन की अवधि का अनुकूलन करें, क्योंकि निर्माता की 5 मिनट की सिफारिश कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की प्रतिरक्षा गतिविधि को कम कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ता सूडान ब्लैक बी, 3,3'-डिमिनोबेंजिडीन या ट्राइपैन ब्लू27का उपयोग करके ऑटोफ्लोरेसेंस को भी गीला कर सकते हैं।

क्योंकि NETs विषम रूप से एक थ्रोम्बस के भीतर वितरित किए जाते हैं, पूरे महाधमनी और इलियाक धमनियों की पूरी तरह से मैपिंग की सिफारिश की जाती है। सीएफडीएनए, सिथ 3 और एनई के लिए सकारात्मक क्षेत्रों को बढ़ाया जाता है। सीएफडीएनए, सिथ 3 और एनई ईएन के सहस्थानीयकरण का व्यापक रूप से नेट गठन की पहचान करने और सेल डेथ के अन्य रूपों से नेट गठन में अंतर करने के लिए उपयोग किया गया है। हाल ही में एक मानव अध्ययन के विपरीत जिसमें नेट्स को कोरोनरी थ्रोम्बी की परिधि में केंद्रित पाया गया, बिल्ली के लिन धमनी थ्रोम्बी में अधिकांश NETs को थक्के28के कपाल पहलू पर संकुल किया गया था। यद्यपि हमने एनईटीएस की पहचान करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग किया, लेकिन एनईटीएस का सूक्ष्म मूल्यांकन और मात्राकरण व्यक्तिपरक बना हुआ है। यहां, हमने सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह को कम करने के लिए एक अंधा और व्यवस्थित विधि का उपयोग किया। क्योंकि एक नमूने में NETs की संख्या न्यूट्रोफिल की संख्या से प्रभावित किया जा सकता है, जांचकर्ताओं परमाणु आकृति विज्ञान, सेल व्यास, और न्यूट्रोफिल विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के आधार पर न्यूट्रोफिल की पहचान करके न्यूट्रोफिल की संख्या के सापेक्ष NETs मात्रा निर्धारित कर सकते हैं । माइक्रोस्कोपी का उपयोग करनेट पहचान की एक और चुनौती यह है कि NETs में खराब परिभाषित मार्जिन होते हैं और वे विलय करते हैं, अस्पष्ट संरचनाओं का निर्माण करते हैं। इससे किसी भी नमूने में एनईटीएस की संख्या का कम या अधिक अनुमान लगाया जा सकता है। इसलिए, DAPI के बजाय, NETs को साफ पहचान और NETs गठन से सेल-उपांग डीएनए के विरूपण के लिए सिटॉक्स ग्रीन का उपयोग कर दाग दिया जा सकता है।

हमने पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान करने के लिए एक डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल विकसित किया है। सिट3 और एनई के इम्यूनोलेबलिंग से पहले डिपरफिनाइजेशन, रिहाइड्रेशन और एंटीजन रिट्रीव होना चाहिए । यह परख बिल्लियों में नेट गठन के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है और बिल्लियों में CATE के रोगविज्ञान की बेहतर समझ प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (CCAH 2018-30-F) से धन द्वारा समर्थित था । लेखक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए डॉ केविन वूलार्ड को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

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References

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Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

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