Summary
Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.
Abstract
Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), compostas de DNA livre de células (cfDNA) e proteínas como histonas e elastase de neutrófilos (NE), são liberadas por neutrófilos em resposta a inflamações sistêmicas ou patógenos. Embora os NETs tenham sido mostrados anteriormente para aumentar a formação de coágulos e inibir a fibrinolise em humanos e cães, o papel dos NETs em gatos com tromboembolismo arterial cardiogênico (CATE), uma complicação de risco de vida secundária à cardiomiopatia hipertrófica , é desconhecido. Um método padronizado para identificar e quantificar os NETs em trombos arteriais cardiogênicos em gatos avançará nossa compreensão de seu papel patológico no CATE. Aqui, descrevemos uma técnica para identificar NETs em trombos fixados em formaldeído e parafina dentro da bifurcação aórtica, extraídos durante a necropsia. Após a deparafinação com xileno, as seções aórticas foram submetidas à recuperação indireta de antígenos induzidos pelo calor. As seções foram então bloqueadas, permeabilizadas e ex-vivo NETs foram identificadas por colocalização de DNA livre de células (cfDNA), histona citrubilada H3 (citH3) e elastase neutrófilo (NE) utilizando microscopia de imunofluorescência. Para otimizar a imunodetecção de NETs em trombos, a autofluorescência dos elementos teciduais foi limitada por meio de um processo de saciedade de autofluorescência antes da microscopia. Essa técnica pode ser uma ferramenta útil para estudar NETs e trombose em outras espécies e oferece novas percepções sobre a fisiopatologia dessa condição complexa.
Introduction
Gatos com cardiomiopatia hipertrófica correm o risco de complicações tromboembólicas com risco de vida1,2. Apesar da alta morbidade e mortalidade associada ao tromboembolismo arterial cardiogênico felino (CATE), a fisiopatologia subjacente da CATE em gatos é mal compreendida. Existem também ferramentas diagnósticas e terapêuticas limitadas para tratar e identificar gatos em risco desta condição devastadora3.
Além de seu papel na imunidade inata, os neutrófilos têm mostrado desempenhar um papel na trombose, liberando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NE), que são redes semelhantes à web de DNA livre de células (CFDNA) incrustadas com histones e proteínas granulares como elastase neutrófilo (NE) e mieloperoxidase. Os neutrófilos são submetidos à formação de NETs em resposta à inflamação sistêmica, encontro direto com patógenos e interação com plaquetas ativadas4,5,6,7. Em cães, o DNA derivado de neutrófilos tem sido mostrado para inibir a lise do coágulo, enquanto as proteínas NET aceleram a formação de coágulos. A capacidade dos NETs de prender células circulantes e componentes de coagulação também é fundamental para suas propriedades trombogênicas8,,9,,10,,11,,12.
Os NETs são detectados pela colocalização de proteínas neutrófilos extracelulares, histonas e cfDNA. Por isso, a identificação e quantificação de NETs em tecidos fixos por imunofluorescência de tecidos desparafinados é superior à hematoxilina tradicional e eosina (H&E) usando microscopia de campo brilhante4,5. Vários estudos em humanos utilizando microscopia de imunofluorescência identificaram os NETs como componentes estruturais do trombo arterial coronário, trombos de derrame cerebral, atherothrombose e trombosve venoso13,14,15,16,17. Até o momento, não foi descrito um método padronizado para detectar e quantificar OS TNS no trombo felino. Como a identificação de NETs no trombo arterial cardiogênico felino pode facilitar futuras pesquisas translacionais em NETs e trombose, descrevemos técnicas de identificação e avaliação de NET em trombos arterial sinuosa embutida em parafina em gatos.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram executados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. Necropsias e biópsias de tecidos foram realizadas com o consentimento dos proprietários.
1. Fixação de tecidos, incorporação e secção
- Dissecar a bifurcação aórtica, incluindo a aorta descendente, a artéria femoral e as artérias ilíacas comuns(Figura 1A),logo após a eutanásia humana ou a morte. Dissecar a fáscia(Figura 1B)antes de submergir completamente em formalina tamponada neutra por um mínimo de 24 h e não mais do que 48 h.
- Para desidratar a amostra, primeiro mergulhe em formalina tamponada 10% aquecida a 37 °C por 1 h. Em seguida, submersão em concentrações crescentes de etanol aquecido a 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x para 1h cada. Por fim, sem enxaguar, submersão 2x em 100% de tolueno aquecido a 37 °C por 1 h cada.
- Adicione a parafina aquecida a 62 °C e deixe a parafina solidificar completamente durante a noite.
- Seção 2-3 μm do tecido embutido parafina usando um microtome e coloque em lâminas de vidro positivamente carregadas. Armazene tecidos seccionados a -80 °C até análise suplementar.
2. Deparafinação, reidratação e recuperação de antígenos induzidos pelo calor
- Para realizar a deparafinação e a reidratação de seções em lâminas de vidro, coloque lâminas de vidro em racks e processe na seguinte ordem:
- Mergulhe completamente em 100% de xileno por 3 min. Repita esta etapa 2x. Não enxágue entre as etapas.
- Submergir completamente em concentrações decrescentes de etanol (100%, 95%, 70%) à temperatura ambiente (RT), 3x para 3 min cada. Não enxágue entre as etapas.
- Mergulhe completamente em água desionizada por 2 min. Repita.
- Coloque as seções em salina tamponada tris com 0,1 % tween (TBST, pH = 7,6) para 2-3 min.
- Encha o reservatório com água desionizada aquecida a 100 °C. Deixe a câmara a vapor equilibrar por 20 min.
NOTA: A recuperação de antígenos induzida pelo calor é melhor realizada com aquecimento indireto gerado por um vapor com uma configuração de temperatura predefinida, como um vapor de alimentos. - Aqueça a solução de recuperação de antígenos comercialmente disponível contendo Tris e EDTA (pH = 9) a 95-97 °C em uma placa quente controlada pela temperatura com agitação constante. Certifique-se de que não ferva.
NOTA: A solução deve ficar nublada assim que estiver aquecida. - Despeje a solução de recuperação de antígeno aquecido em um recipiente de slides e coloque o recipiente na câmara do vapor. Permita que a solução de recuperação de antígenos equilibre a temperatura do vapor por 3-4 min. Certifique-se de que a temperatura da câmara é de ~95 °C.
- Mergulhe as lâminas completamente na solução de recuperação de antígenos aquecidos e continue a aplicação de aquecimento externo através do vapor por 20 min.
- Remova o recipiente de slides do vapor e permita que os slides e a solução de recuperação de antígenos esfriem até RT. Armazene a solução de recuperação de antígeno diluído a 4 °C e reutilize até 2x, se necessário.
- Lave os slides 3x com TBST por 5 min.
3. Saqueação de imunorotulagem e autofluorescência
NOTA: A Tabela 1 detalha a composição dos buffers de bloqueio utilizados nas etapas seguintes.
- Incubar seções no Buffer de bloqueio 1 por 2 h em RT balanço suave (30-50 rpm). Selar com filme de parafina para evitar secagem.
- Sem lavar, aplique imediatamente 100 μL de anticorpo de histona policlonal policlonal de coelho diluído H3 (citH3) (0,03 mg/mL diluído no tampão de bloqueio 1) diretamente no slide.
- Coloque um deslizamento de cobertura (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) em cada seção para permitir a distribuição uniforme da mistura de anticorpos.
- Incubar por 12-16 h a 4 °C com balanço suave (30-50 rpm). Vedação com filme de parafilme para evitar secagem.
- Lave 3x com TBST por 5 min.
- Aplique 100 μL de anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com alexa fluor 488 (diluído a uma concentração final de 0,04 mg/mL ou 1:50 no Buffer de Bloqueio 1) conforme descrito na etapa 3.3. Incubar por 1 h em RT balanço suave (30-50 rpm). Proteja os slides da luz.
- Lave com TBST 3x por 5 min.
- Incubar seções no Buffer de bloqueio 2 durante a noite a 4 °C balanço suave (30-50 rpm). Proteja-se da luz.
- Lave com TBST 3x por 5 min.
- Bloquear seções no Buffer de Bloqueio 3 conforme descrito na etapa 3.3 em RT por 2 h balanço suave (30-50 rpm).
- Incubar seções com anticorpo anti-ne anti-humano do coelho policlonal biotinylado (concentração final = 0,2 μg/mL no Buffer de Bloqueio 3) a 4 °C por 12-16 h conforme descrito nos passos 3.2-3.4.
- Lave com TBST 3x por 5 min.
- Incubar com Alexa Fluor 594 streptavidin conjugado (diluir a 1:100 ou 0,02 mg/mL no Buffer de Bloqueio 3) conforme descrito nas etapas 3.2-3.3 por 1 h no RT. Proteja-se da luz e lacre com parafina para evitar a secagem.
- Lave com TBST 1x por 5 min.
- Aplique 100 μL de mistura de solução de saciedade de autofluorescência diretamente nas seções por 1 min, conforme instruído pelo fabricante.
- Lave imediatamente os slides com TBST 6x por 10 min.
- Cubra cada slide com 100 μL de DAPI de 300 nM por 5 min no escuro.
- Lave com TBST por 3 min. Repita isso por um total de 5x.
- Aplique uma gota (~50 μL) de meio de montagem antifade, parte do kit de saciedade de autofluorescência, diretamente sobre o escorregador de vidro ao redor da seção. Coloque um deslizamento de cobertura (24 mm x 40 mm x 0,13-0,17 mm) suavemente sobre a seção sem criar bolhas.
- Permitir que as amostras se curem durante a noite no escuro a 4 °C até que o meio de montagem tenha endurecido para análise microscópica com lentes de imersão.
4. Identificação de armadilha extracelular de neutrófilo
NOTA: O protocolo a seguir utiliza um microscópio de epifluorescência invertido com uma câmera CCD digital 1.280 x 960 (ver Tabela de Materiais).
- Para localizar trombos, escaneie cranicamente ao longo do comprimento da aorta, bifurcação aórtica e cada artéria femoral usando microscopia de contraste de fase com um objetivo de 10x. Um trombo é um conglomerado de tecidos contendo glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas adjacentes ao endotélio em contraste de fase e microscopia de campo brilhante(Figura 2A, Figura 2B).
- Primeiro examine as seções para NETs usando o canal DAPI (excitação = 357/44 nm) com objetivos de 10x e 20x(Figura 2C). Note que o CFDNA aparece como DNA descondensado que não está dentro dos limites do citoplasma de uma célula quando visto em contraste de fase ou microscopia de campo brilhante.
- Identificar ne extracelular e citH3 nos canais Vermelhos do Texas (excitação = 585/29 nm, emissão = 628/32 nm) e canal de proteína fluorescente verde (excitação = 470/22 nm, emissão = 525/50 nm), respectivamente com objetivos de 10, 20 e 40x.
- Avalie e analise OS NETs dentro de um thrombus usando software disponível, como o Image J (NIH). A formação net é identificada com base na colocalização do cfDNA, citH3 extracelular e NE como descrito anteriormente18. Manter tempo de exposição consistente e ganhos de cada canal ao longo da aquisição de imagens para evitar saturação na intensidade dos pixels.
- Mapeie cada trombo com base em sua proximidade com a aorta descendente dividindo-a em três zonas iguais, com a Zona 1 mais próxima da aorta, a Zona 3 mais distante da aorta, e a Zona 2 entre as Zonas 1 e 3). Com o operador cego para a condição médica de cada sujeito, tome pelo menos dez campos aleatórios em cada zona. Caracterizar a distribuição de NETs em trombos, por meio da média do número de campos com NETs em cada região ou calculando a área média de ocupação de NET por região.
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Representative Results
Usando este protocolo para deparafinação, recuperação de antígenos induzidos pelo calor e dupla imunorotulagem de trombos embutidos em parafina, identificamos NETs em CATE felino pela primeira vez. O trombo dentro da bifurcação aórtica foi localizado por microscopia de fluorescência e microscopia de campo brilhante utilizando a coloração padrão de H&E e microscopia de contraste de fase. Na microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consistia de glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquetas(Figura 3A). Embora a H&E não possa manchar componentes NET específicos, os NETs frequentemente aparecem como redes de fios roxos profundos de vários comprimentos ao redor de eritrócitos e leucócitos próximos(Figura 3A,contorno pontilhado). Um trombo foi caracterizado como uma estrutura bem demarcada dentro do espaço vascular na microscopia de contraste de fase (Figura 2A, Figura 4B). Confirmamos ainda a presença de NETs nessas áreas por microscopia de imunofluorescência (Figura 3B). A ampliação dessas áreas revelou grandes agregados de NETs, compostos por cfDNA, citH3 extracelular e NE (Figura 2C, Figura 3B,contorno pontilhado branco). Utilizando a mesma técnica para procurar trombos e NETs em gatos sem CATE, descobrimos que folhas de neutrófilos lisófilos lisas podiam ser detectadas ocasionalmente nas proximidades do endotélio. Embora estes neutrófilos tenham apresentado algumas características morfológicas da formação de NET, eles não devem ser associados a nenhum trombo organizado. Não identificamos trombos em nenhuma das amostras de controle(Figura 4A).
A Figura 5A demonstra autofluorescência profunda de elementos de coágulos como eritrócitos e colágeno quando imagemno comprimento de onda verde (488 nm), o que dificultou nossa capacidade de detectar cfDNA e colocalização de proteínas. Verificou-se que a saciedade de autofluorescência breve usando um kit comercialmente disponível após a imunorotulagem aumentou significativamente a sensibilidade da colocalização proteica e da detecção de NET, mesmo em áreas com abundância de eritrócitos(Figura 5B, pontas de flecha).
Figura 1: Fotos representativas da necropsia de bifurcação aórtica dissecada de um gato com tromboembolismo arterial cardiogênico. (A)A aorta descendente foi dissecada de 4 a 5 cm cranial (Cr) para a bifurcação aórtica. (B) A Fáscia foi cuidadosamente dissecada até que as artérias descendentes (1) e ilíacas (2,3) fossem claramente visíveis no aspecto caudal (Cd). Observe o trombo dentro da bifurcação aórtica (*). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Contraste de fase representativo e imagens de imunofluorescência de NETs em um trombo encontrado dentro de uma bifurcação aórtica felina. ( A) A Microscopia de contraste de fase revelou um trombo como uma estrutura discreta e bem demarcada perto da aorta. Contraste de fase combinado e coloração de fluorescência de DNA (azul) mostraram a presença de leucócitos e DNA livre de células dentro do trombo. A área encaixotada consiste em uma grande concentração de DNA livre de células. Ampliação original de 10x; Barra de escala = 400 μm.(B)A área encaixotada em (A) foi ampliada ainda mais em 20x. DNA livre de células e DNA intracelular manchado com DAPI (azul), elastase de neutrófilo (NE) e histona citrullinada H3 (citH3) apareceram verde e vermelho, respectivamente. (Ampliação original de 20x; Barra de escala = 100 μm). (C) Foram delineados NETs, identificados com base na colocalização do DNA livre de células, NE extracelular e citH3(linha pontilhada). Ampliação original de 40x; Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem representativa de um trombo arterial felino utilizando H&E e coloração de imunofluorescência. ( A) Na mancha de H&E, grande concentração de neutrófilos e eritrócitos eram visíveis. Cromatinas extracelulares apareceram como fios roxos profundos de vários comprimentos cercados por eritrócitos e neutrófilos (contorno pontilhado, seta preta). (B) As armadilhas extracelulares neutrófilos foram facilmente visualizadas usando microscopia de imunofluorescência no mesmo trombo (contorno pontilhado, seta branca). Os NETs foram identificados como colocalização de cfDNA (azul), NE (verde) e citH3 (vermelho). Ampliação original de 20x; Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Contraste de fase representativo e imagens de imunofluorescência de bifurcações aórticas. ( A) Contraste de fase e imagens de imunofluorescência de bifurcações aórticas em um gato sem trombose arterial. Note-se a ausência de trombos ou agregados de neutrófilos dentro do lúmen da bifurcação aórtica do gato sem trombose arterial. (B) Imagens de contraste de fase e imunofluorescência de bifurcações aórticas em um gato diagnosticado com tromboembolismo arterial cardiogênico. As bifurcações aórticas foram manchadas para DNA (azul), elastase neutrófilo (verde) e histona citrubilizada H3 (vermelho). Neste caso, um trombo bem demarcado abaulado na parede vascular e ocupando a maior parte do lúmen aórtico foi notado no gato com tromboembolismo arterial cardiogênico. Os NETs, caracterizados pela colocalização do CFDNA, NE e citH3, foram identificados dentro do trombo (contorno pontilhado). Ampliação original de 10x; Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Contraste de fase representativo (PC) e imagens de imunofluorescência de trombos arteriais de dois gatos. Os slides foram manchados para citH3, NE e DNA e foram imagem a 488 nm (vermelho), 595 nm (verde) e 357 nm (azul), respectivamente, em ampliação de 40x. Trombos arterialcardiogênicos em gatos tinham abundância de eritrócitos (*, linha pontilhada). (A) A Autofluorescência de eritrócitos foi mais proeminente ao longo do comprimento de onda de 488 nm, diminuindo a detecção de sinal de colocalização e identificação de NETs. (B) A extinção reduziu significativamente a autofluorescência no comprimento de onda de 488 nm, especialmente em áreas com alta concentração de eritrócitos (*, linha pontilhada). Melhorou a detecção de proteínas colocalizadas, citH3 e elastase neutrófilo (ponta de flecha), na presença de eritrócitos (Barra de escala = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplemento Figura 1: Imagens representativas de imunofluorescência de trombos arteriais de um gato. As seções foram manchadas para DNA (azul), citH3 (vermelho) e mieloperoxidase(A)ou elastase neutrófilo(B). (A)Apesar de utilizar um anticorpo mieloperoxidase específico do felino (MPO, 1:5), a intensidade de coloração do MPO permaneceu fraca. (B) Utilizando um anticorpo de elastase de neutrófilo sinuoso (NE), conhecido por reagir cruzadamente com múltiplas espécies, a imunoreatividade e a intensidade de coloração foram significativamente maiores. Note os núcleos lobullados característicos de neutrófilos cercados por NE (setas). Ampliação original de 40x; Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este número.
| Tampão de bloqueio | Composição | |
| 1 | TBS com 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% soro de cabra | |
| 2 | TBS com 0,1% Tween-20, 10% soro de coelho, 0,1%NP-40 | |
| 3 | TBS com 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabela 1: Composição dos tampões de bloqueio utilizados para imunofluorescência.
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Discussion
Descrevemos um protocolo para identificar NETs em trombos arteriais cardiogênicos felinos fixos usando um protocolo de imunorotulagem dupla e microscopia de imunofluorescência. Embora apenas trombos arterials cardiogênicos estivessem manchados, em teoria este protocolo poderia ser usado para outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias. A identificação de NETs dentro do trombo arterial felino sugere que os NETs podem desempenhar um papel na trombose em gatos.
A detecção de NETs por imunofluorescência em tecido fixo e embutido em parafina é superior às manchas histológicas convencionais como H&E, que muitas vezes mostra fios de cromatina cercados por neutrófilos13. A imunohistoquímica e a imunofluorescência do trombo arterial fixo permitem a detecção simultânea de cfDNA e outras proteínas extracelulares como o citH3, conhecido por ser específico para a formação de NETs18,19. Como as criopreparações são subótimas para detecção de NET em tecidos e trombos, preservamos nossas amostras em formalina 10% tampão neutro, que contém 4% de formaldeído e 10% de metanol. Ácidos nucleicos livres de células não são diretamente fixados por formaldeído. Em vez disso, são imobilizados dentro de estruturas de proteínafixas, que são alteradas por ligações de ponte de metileno parcialmente reversíveis induzidas pelo formaldeído20. Para limitar ainda mais os artefatos e a autofluorescência causada pelo ácido fórmico e cetonas geradas pela oxidação do formaldeído, os pesquisadores podem optar por usar o paraformaldeído livre de metanol diluído em tampão para fixação. Como a duração da fixação afeta a imunoreatividade, recomendamos fixação por no mínimo 24h antes da desidratação e da incorporação de parafina. Tecidos ou coágulos embutidos em parafina podem ser armazenados para deparafinação e coloração.
A fixação química por formaldeído e paraformaldeído altera a estrutura terciária das proteínas, mascarando os antígenos de interesse e impedindo a ligação de anticorpos a epítopos específicos21. A recuperação de antígenos, um processo que quebra as ligações transversais da ponte de metileno, é essencial antes de realizar a imunodetecção em tecidos fixos de formalina. Com base na experiência dos autores, a recuperação de antígenos induzidos pelo calor usando uma solução de recuperação alcalina (pH = 9 em tampão Tris/EDTA) com aquecimento indireto leve aumenta a detecção de proteínas e NETs, minimizando artefatos e autofluorescência. A temperatura da solução de recuperação de antígenos não deve atingir o ponto de ebulição (>100 °C), pois a desnaturação de proteínas pode levar a uma ligação inespecífica e ruído de fundo.
Uma limitação da identificação NET em coágulos fixos é que a coloração de imunofluorescência pode ser altamente variável diferentes condições de recuperação de antígenos18. Comparáveis aos resultados encontrados por Brinkmann et al., constatamos que temperaturas de incubação mais altas (>55 °C) resultaram em uma coloração ideal de histones nos núcleos e cromatina descondensada19. No entanto, descobrimos que a intensidade de coloração da mieloperoxidase, uma proteína granular encontrada em neutrófilos e NETs, era baixa nas condições propostas. A imunoreatividade pobre da mieloperoxidase foi consistente apesar do uso de um anticorpo específico para felinos(Figura Complementar 1). Portanto, encorajamos os investigadores a modificar a duração e as condições (por exemplo, pH, temperatura) do processo de recuperação de antígenos para produzir um sinal satisfatório com base no antígeno de interesse.
Um dos desafios de identificar NETs em espécies veterinárias é a falta de anticorpos específicos para espécies. Para evitar a interferência encontrada ao usar anticorpos primários originários da mesma espécie, incluímos uma etapa adicional de bloqueio utilizando uma alta concentração de imunoglobulinas de coelho para saturar quaisquer locais de ligação restantes nos anticorpos secundários anti-coelho sinuosos. Uma grande desvantagem dessa técnica é que ela é demorada, pois requer múltiplas etapas de incubação. Os investigadores devem incluir dois controles diferentes que excluem qualquer anticorpo primário na segunda etapa de imunorotulagem para garantir que o anticorpo secundário de qualquer passo de imunorotulagem se ligue especificamente ao seu anticorpo primário. A especificidade das estruturas NET identificadas pode ser verificada ainda mais pela digestão do DNase ou pela inclusão de controles biológicos constituídos por bifurcações aórticas de gatos sem CATE(Figura 5). Além disso, os controles negativos que consistem na mesma concentração de anticorpos de controle de isótipo como os anticorpos primários devem ser incluídos para excluir interações de anticorpos não específicos, vinculação inespecífica aos receptores Fc e autofluorescência celular. Os investigadores são aconselhados a modificar este protocolo com base na disponibilidade de anticorpos específicos da espécie. Se não houver anticorpos específicos para espécies disponíveis, aconselhamos primeiro avaliar a imunoreatividade de anticorpos usando imunocitoquímica ou avaliar a transcrição proteica das espécies de interesse para homologia para as transcrições referenciadas.
Fatores como fixação da amostra, deparafinação inadequada e presença de componentes teciduais específicos podem levar à autofluorescência no trombo. Durante a fixação do aldeído, as aminas podem combinar-se com aldeídos para formar complexos de base de Schiff, que emitem fluorescência22. A deparafinação incompleta também pode modificar quimicamente as proteínas do tecido, criando autofluorescência23. Componentes extracelulares em amostras vasculares como colágeno, elastina e glóbulos vermelhos são relatados como fluorescência natural em mamíferos24,25. Como a autofluorescência natural ou iatrogênica é mais perceptível nos comprimentos de onda verdes (excitação = 488 nm, emissão = 500-550 nm), o uso de fluoróforos vermelhos pode minimizar alguma autofluorescência26. No presente protocolo, utilizamos um kit de saciedade de autofluorescência comercialmente disponível projetado para se ligar eletrostáticamente a elementos de tecido autofluorescente. Recomendamos que os investigadores otimizem a duração da extinção da autofluorescência, pois a recomendação do fabricante de 5 min pode diminuir a imunoreatividade de proteínas menos abundantes. Alternativamente, os pesquisadores também podem amortecer a autofluorescência usando o Sudão Black B, 3,3'-diaminobenzidina ou trippan azul27.
Como os NETs são heterogêneos distribuídos dentro de um trombo, recomenda-se um mapeamento minucioso de toda a aorta e artérias ilíacas. As regiões positivas para cfDNA, citH3 e NE são então ampliadas. A colocalização do CFDNA, citH3 e NE tem sido amplamente utilizada para identificar a formação de NET e diferenciar a formação de NET de outras formas de morte celular. Ao contrário de um estudo humano recente que encontrou OS NETs concentrados na periferia do trombo coronário, a maioria dos NETs em trombos arteriais felinos foram agrupados no aspecto craniano do coágulo28. Embora tenhamos utilizado um protocolo padronizado para identificar NETs, a avaliação microscópica e a quantificação dos NETs permanecem subjetivas. Aqui, utilizamos um método cego e sistemático para minimizar o viés dos observadores durante a análise microscópica. Como o número de NETs em uma amostra pode ser influenciado pelo número de neutrófilos, os pesquisadores podem quantificar os NETs em relação ao número de neutrófilos, identificando neutrófilos baseados em morfologia nuclear, diâmetro celular e expressão de proteínas específicas de neutrófilos. Outro desafio da identificação net utilizando microscopia é que os NETs têm margens mal definidas e tendem a se fundir, formando estruturas nebulosas. Isso pode levar a uma subestimação ou superestimação do número de NETs em qualquer amostra. Portanto, em vez de DAPI, os NETs podem ser manchados usando Sytox Green para identificação mais clara e denotação de DNA de células-appendant da formação de NETs.
Desenvolvemos um protocolo de dupla imunorotulagem para identificar NETs em trombos arteriais felinos embutidos em parafina. A deparafinação, a reidratação e a recuperação de antígenos devem ocorrer antes da imunorotulagem de citH3 e NE. Este ensaio pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da formação de NET em gatos e proporcionar uma melhor compreensão da fisiopatologia do CATE em gatos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kevin Woolard pelo uso do microscópio de fluorescência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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