Summary
Vi beskriver en metod för att identifiera neutrophil extracellulära fällor (ELT) i formaldehyde-fasta och paraffin-inbäddade feline cardiogenic kranskärlens trombi med värme-inducerad antigen hämtning och en dubbel immunmärkning protokoll.
Abstract
Neutrophil extracellulära fällor (NET), bestående av cellfria DNA (cfDNA) och proteiner som histoner och neutrofil elastase (NE), frigörs av neutrofiler som svar på systemisk inflammation eller patogener. Även om unga som varken arbetar eller studerar har visat sig öka bildningen av blodproppar och hämma fibrinolys hos människor och hundar, har net-värdets roll hos katter med kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), en livshotande komplikation sekundärt till hypertrofisk kardiomyopati , är okänd. En standardiserad metod för att identifiera och kvantifiera unga och unga i kardiogen arteriell trombi hos katter kommer att öka vår förståelse av deras patologiska roll i CATE. Här beskriver vi en teknik för att identifiera UNGATs i formaldehyd-fasta och paraffin-inbäddade trombi inom kolorektal bifurkation, extraheras under obduktion. Efter deparaffinering med xylen genomgick kolorektal sektioner indirekt värme-inducerad antigen hämtning. Avsnitt blockerades sedan, permeabilized och ex vivo EL IDENTIFIERADEs genom colocalization av cell-fria DNA (cfDNA), citrullinerade histon H3 (citH3) och neutrophil elastase (NE) med hjälp av immunofluorescence mikroskopi. För att optimera immunodetection av NETs i trombi, autofluorescens av vävnadselement begränsades med hjälp av en autofluorescens släckning process före mikroskopi. Denna teknik kan vara ett användbart verktyg för att studera unga och grundläggande teknik hos andra arter och ger nya insikter i patofysiologin i detta komplexa tillstånd.
Introduction
Katter med hypertrofisk kardiomyopati löper risk för livshotande tromboembolic komplikationer1,2. Trots den höga sjuklighet och dödlighet som är associerade med felin kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), är den underliggande patofysiologi av CATE hos katter dåligt förstås. Det finns också begränsade diagnostiska och terapeutiska verktyg för att behandla och identifiera katter som löper risk för detta förödande tillstånd3.
Förutom sin roll i medfödd immunitet, neutrofiler har visat sig spela en roll i trombos genom att släppa neutrofil extracellulära fällor (NET), som är webb-liknande nätverk av cell-fria DNA (cfDNA) täckt med histoner och granulat proteiner som neutrofil elastas (NE) och myeloperoxidase. Neutrofiler genomgår nets bildas som svar på systemisk inflammation, direkt möte med patogener och interaktion med aktiverade trombocyter4,,5,,6,7. Hos hundar har neutrofilt-härledda DNA visat sig hämma koaguleringslys, medan NET-proteiner påskyndar koaguleringsbildningen. Nets förmåga att fånga cirkulerande celler och koaguleringskomponenter är också nyckeln till deras trombogenic egenskaper8,,9,,10,,11,12.
Unga och unga är detekt genom colocalization av extracellulära neutrofila proteiner, histoner och cfDNA. På grund av detta är identifiering och kvantifiering av unga som varken arbetar eller studerar i fasta vävnader genom immunfluorescens av deparaffinerade vävnader överlägsen traditionell hematoxylin- och eosinfläck (H&E) med hjälp av ljus fältmikroskopi4,,5. Flera humanstudier med immunofluorescensmikroskopi identifierade ungasum som strukturella komponenter i kranskärlstrombi, cerebral stroketrombi, aterolombos och venös trombi13,14,15,16,17. Hittills har en standardiserad metod för att upptäcka och kvantifiera unga som varken arbetar eller studerar i felint trombi beskrivits. Eftersom identifiering av unga som varken arbetar eller studerar i felin cardiogenic arteriell trombi kan underlätta framtida translationell forskning i unga och medelstora företag, beskriver vi tekniker för NET identifiering och bedömning i paraffin-inbäddade arteriell trombi hos katter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här utfördes i enlighet med riktlinjerna i institutionella Animal Care and Use Committee vid University of California, Davis. Obduktioner och tarmbiopsier av vävnader utfördes med ägarnas samtycke.
1. Vävnadsfixering, inbäddning och snittning
- Dissekera ut aorta bifurkation, inklusive fallande aorta, femorala artär, och den gemensamma iliaca artärer (Figur 1A), strax efter human dödshjälp eller död. Trubbig dissekera fascian (figur 1B) innan den sänks ned helt i 10 % neutralbuffertad formalin i minst 24 timmar och inte längre än 48 timmar.
- För att torka ut provet, först doppa i 10% neutral-buffrad formalin uppvärmd till 37 °C för 1 h. Därefter, doppa i ökande koncentrationer av etanol värms upp till 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x för 1 h vardera. Slutligen, utan sköljning, doppa 2x i 100% toluen upphettas till 37 °C för 1 h vardera.
- Tillsätt paraffin uppvärmd till 62 °C och låt paraffinet stelnas helt över natten.
- Avsnitt 2–3 μm av paraffin-inbäddad vävnad med hjälp av en mikrotom och placera på positivt laddade glasrutschbanor. Förvara sektionerade vävnader vid -80 °C tills vidare analys.
2. Deparaffinering, rehydrering och värmeinducerad antigenhämtning
- Om du vill utföra deparaffinering och rehydrering av sektioner på glasglas, placera glasrutschbanor i rack och bearbeta i följande ordning:
- Doppa helt i 100% xylen i 3 min. Upprepa detta steg 2x. Skölj inte mellan stegen.
- Doppa helt i minskande koncentrationer av etanol (100%, 95%, 70%) rumstemperatur (RT), 3x i 3 min vardera. Skölj inte mellan stegen.
- Doppa helt i avjoniserat vatten i 2 min. Upprepa.
- Placera sektionerna i Tris-buffrad koksaltlösning med 0,1 % Interpolering (TBST, pH = 7,6) i 2–3 min.
- Fyll behållaren med avjoniserat vatten uppvärmt till 100 °C. Låt ångkammaren balansera i 20 minuter.
OBS: Värmeinducerad antigenhämtning utförs bäst med indirekt uppvärmning som genereras av en ångbåt med en förinställd temperaturinställning, till exempel en matångare. - Värm den kommersiellt tillgängliga antigenhämtningslösningen som innehåller Tris och EDTA (pH = 9) till 95–97 °C på en temperaturkontrollerad värmeplatta med konstant omrörning. Se till att det inte kokar.
LÖSNINGEN ska bli grumlig när den värms upp. - Häll den uppvärmda antigenhämtningslösningen i en glidbehållare och placera behållaren i ångkokarens kammare. Låt antigenhämtningslösningen balansera till ångkokarens temperatur i 3–4 min. Se till att temperaturen i kammaren är ~95 °C.
- Sänk ned rutschbanorna helt i den uppvärmda antigenhämtningslösningen och fortsätt appliceringen av extern uppvärmning via ångkokaren i 20 min.
- Ta bort glidbehållaren från ångkokaren och låt bilderna och antigenhämtningslösningen svalna till RT. Förvara den utspädda antigenhämtningslösningen vid 4 °C och återanvänd upp till 2x om det behövs.
- Tvätta rutschbanorna 3x med TBST i 5 min.
3. Immunmärkning och automatisk utlysningssläckare
I tabell 1 beskrivs sammansättningen av de blockerande buffertar som används i följande steg.
- Inkubera sektioner i blockeringsbuffert 1 för 2 h vid RT under mild gungning (30–50 varv/min). Täta med paraffinfilm för att undvika torkning.
- Utan tvätt, applicera omedelbart 100 μl utspädd kanin polyklonal anti-human citrullinated histon H3 (citH3) antikroppar (0,03 mg/ml utspädd i blockeringsbuffert 1) direkt på bilden.
- Placera ett täckslip (24 mm x 40 × 0,13–0,17 mm) på varje sektion så att även antikroppsblandningen kan fördelas jämnt.
- Inkubera i 12–16 h vid 4 °C med mild gungning (30–50 varv/min). Täta med parafilmfilm för att undvika torkning.
- Tvätta 3x med TBST i 5 min.
- Applicera 100 μL getantikaninantikroppkonjugerad på Alexa Fluor 488 (utspädd till en slutlig koncentration på 0,04 mg/ml eller 1:50 i blockeringsbuffert 1) enligt beskrivningen i steg 3.3. Inkubera för 1 h vid RT under mild gungning (30–50 varv/min). Skydda bilderna från ljus.
- Tvätta med TBST 3x i 5 min.
- Inkubera sektioner i blockeringsbuffert 2 över natten vid 4 °C under mild gungning (30–50 varv/min). Skydda mot ljus.
- Tvätta med TBST 3x i 5 min.
- Blockera sektioner i blockeringsbuffert 3 enligt beskrivningen i steg 3.3 vid RT för 2 h under mild gungning (30–50 varv/min).
- Inkubera sektioner med biotinylerad polyklonal kaninantikropp mot människa (slutlig koncentration = 0,2 μg/ml i blockeringsbuffert 3) vid 4 °C i 12–16 timmar enligt beskrivningen i steg 3.2–3.4.
- Tvätta med TBST 3x i 5 min.
- Inkubera med Alexa Fluor 594 streptavidinkonjugat (späd till 1:100 eller 0,02 mg/ml i blockeringsbuffert 3) enligt beskrivningen i steg 3.2–3.3 för 1 h vid RT. Skydda mot ljus och tätning med paraffin för att förhindra torkning.
- Tvätta med TBST 1x i 5 min.
- Applicera 100 μl autofluorescenssläckningslösningsblandning direkt på sektionerna i 1 min enligt tillverkarens anvisningar.
- Tvätta omedelbart rutschbanorna med TBST 6x i 10 min.
- Täck varje bild med 100 μL av 300 nM DAPI i 5 min i mörker.
- Tvätta med TBST i 3 min. Upprepa detta för totalt 5x.
- Applicera en droppe (~50 μL) antifade monteringsmedium, en del av autofluorescenssläckningssatsen, direkt på glasbilden som omger sektionen. Placera ett täckslip (24 mm x 40 × 0,13–0,17 mm) försiktigt på sektionen utan att skapa några bubblor.
- Låt proverna härda över natten i mörker vid 4 °C tills monteringsmediet har härdat för mikroskopisk analys med nedsänkningslinser.
4. Neutrophil extracellulär fälla identifiering
OBS: Följande protokoll använder en inverterad epifluorescensmikroskop med en 1,280 x 960 digital CCD-kamera (se Tabell över material).
- För att lokalisera trombi, skanna cranially att caudally längs längden på stora kroppspulsådern, kolorektal bifurkation och varje femoralartär med fas kontrastmikroskopi med ett 10x mål. En tromb är ett konglomerat av vävnad som innehåller röda blodkroppar, vita blodkroppar och blodplättar intill endotel på faskontrast och ljus fältmikroskopi (figur 2A, figur 2B).
- Undersök först avsnitt för unga som använder DAPI-kanalen (excitation = 357/44 nm) med 10x- och 20xmål (figur 2C). Observera att cfDNA visas som dekondenserat DNA som inte ligger inom gränserna för cytoplasman i en cell när den ses på faskontrast eller ljus fältmikroskopi.
- Identifiera extracellulära NE och citH3 på Texas Röda kanaler (excitation = 585/29 nm, emission = 628/32 nm) och grön fluorescerande proteinkanal (excitation = 470/22 nm, emission = 525/50 nm), respektive med 10, 20 och 40x mål.
- Utvärdera och analysera unga och unga i en tromb med hjälp av tillgänglig programvara, till exempel Bild J (NIH). NET-bildning identifieras baserat på kolacalisering av cfDNA, extracellulär citH3 och NE som tidigare beskrivits18. Upprätthålla konsekvent exponeringstid och vinster för varje kanal under hela förvärvet av bilder för att undvika mättnad i pixelintensitet.
- Kartlägga varje tromb baserat på dess närhet till fallande stora kroppspulsåder genom att dela upp den i tre lika stora zoner, med zon 1 närmast stora kroppspulsåder, zon 3 längst bort från stora kroppspulsåder och zon 2 mellan zon 1 och 3). Med operatören förblindad till det medicinska tillståndet i varje ämne, ta minst tio slumpmässiga fält i varje zon. Karakterisera fördelningen av unga som varken arbetar eller studerar i trombi genom att i genomsnitt beräkna antalet fält med unga som varken arbetar eller i varje zon eller beräkna det genomsnittliga NET-upptarområdet per zon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll för deparaffinisering, värme-inducerad antigen hämtning och dubbel immunolabeling av paraffin-inbäddade trombi, identifierade vi UNGAT i katt CATE för första gången. Trombi inom kolorektal bifurkation lokaliserades genom fluorescensmikroskopi och ljusa fältmikroskopi med standard H & E färgning och fas kontrast mikroskopi. På ljusa fältmikroskopi bestod felint arteriell trombi av röda blodkroppar, leukocyter, fibrin och trombocyter (figur 3A). Även om H&E inte kan färga specifika NET-komponenter, förekom unga unga och ungar ofta som nätverk av djupa lila trådar av olika längder som omger närliggande erytrocyter och leukocyter (figur 3A, prickade kontur). En tromb karakteriserades som en väl avgränsad struktur inom det vaskulära utrymmet på faskontrastmikroskopi (figur 2A, figur 4B). Vi bekräftade vidare förekomsten av unga som varken arbetar eller studerar inom dessa områden genom immunofluorescensmikroskopi (figur 3B). Förstoring av dessa områden visade stora aggregat av unga som varken arbetar eller studerar, bestående av cfDNA, extracellulär citH3 och NE(figur 2C, figur 3B, vit prickad kontur). Med samma teknik för att söka efter trombi och unga och unga i katter utan CATE, fann vi att ark av lyzed neutrofiler kunde upptäckas ibland i närheten av endotel. Även om dessa neutrofiler visas vissa morfologiska egenskaper NET bildning, bör de inte associeras med någon organiserad blodpropp. Vi identifierade inte någon trombi i något av kontrollproverna (figur 4A).
Figur 5A visar djupgående autofluorescens av blodproppselement som erytrocyter och kollagen när bilden på den gröna (488 nm) våglängd, vilket hindrade vår förmåga att upptäcka cfDNA och protein colocalization. Vi fann att korta autofluorescens kylning med hjälp av en kommersiellt tillgängliga kit efter immunmärkning avsevärt ökat känsligheten för protein kolacalisering och NET upptäckt, även i områden med ett överflöd av erytrocyter (Figur 5B, pilspetsar).
Figur 1: Representativ obduktion fotografier av en dissekerad kolorektal bifurkation från en katt med kardiogen kranskärlens tromboembolism. (A) Den fallande aorta dissekerades 4-5 cm hjärnskålen (Cr) till aorta bifurkation. (B) Fascia var noggrant dissekeras ut tills fallande stora kroppspulsådern (1) och höftartärer (2,3) var tydligt synliga vid caudal aspekt (Cd). Notera tromberna i den aortabifurkationen (*). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa faskontrast och immunofluorescensbilder av unga som varken arbetar eller studerar i en tromb som finns i en felint kolorektal bifurkation. (A)Faskontrastmikroskopi visade en blodpropp som en diskret och väl avgränsad struktur nära aorta. Kombinerade fas kontrast och fluorescens färgning av DNA (blå) visade förekomsten av leukocyter och cell-fria DNA inom trombos. Det förpackade området består av en stor koncentration av cellfritt DNA. Original 10x förstoring; Skalan = 400 μm. (B) Det förpackade området i (A) förstorades ytterligare vid 20x. Cell-free DNA och intracellulära DNA färgas med DAPI (blå), neutrophil elastase (NE) och citrullinated histon H3 (citH3) verkade grön och röd, respektive. (Original 20x förstoring; Skalstång = 100 μm). (C) UNGAR, identifieras baserat på colocalization av cell-fria DNA, extracellulära NE och citH3, beskrevs (prickade linjen). Original 40x förstoring; Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ bild av en felint arteriell trombos med H&E och immunofluorescensfärgning. (A)På H&E-fläcken var den stora koncentrationen av neutrofiler och erytrocyter synliga. Extracellulära kromatiner verkade som djupa lila trådar av olika längder omgiven av erytrocyter och neutrofiler (prickade kontur, svart pil). (B)Neutrophil extracellulära fällor var lätt visualiseras med hjälp av immunofluorescensmikroskopi på samma tromb (prickade kontur, vit pil). Unga och medelstora företagspekter identifierades som colocalization av cfDNA (blå), NE (grön) och citH3 (röd). Original 20x förstoring; Skala bar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa faskontrast och immunofluorescensbilder av aortabifurkationer. (A)Faskontrast och immunofluorescensbilder av aortabifurkationer i en katt utan arteriell trombos. Observera frånvaron av trombi eller aggregat av neutrofiler inom lumen av kolorektal bifurkation från katten utan arteriell trombos. (B)Faskontrast och immunofluorescens bilder av kolorektal bifurkationer i en katt som diagnostiserats med kardiogen arteriell tromboembolism. Kolorektal bifurkationer var färgade för DNA (blå), neutrophil elastase (grön), och citrullinated histon H3 (röd). I detta fall noterades en väl avgränsad blodpropp utbuktande i kärlväggen och upptar de flesta av kolorektal lumen i katten med kardiogen arteriell tromboembolism. UNGA, kännetecknas av colocalization av cfDNA, NE och citH3, identifierades inom blodproppar (prickade kontur). Original 10x förstoring; Skala bar = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativ faskontrast (PC) och immunofluorescensbilder av arteriell trombi från två katter. Bilderna var färgade för citH3, NE och DNA och avbildas på 488 nm (röd), 595 nm (grön) och 357 nm (blå) våglängder, respektive vid 40x förstoring. Kardiogen arteriell trombi hos katter hade ett överflöd av erytrocyter (*, prickad linje). (A)Autofluorescens från erytrocyter var mest framträdande över 488 nm våglängd, minskande upptäckten av colocalization signal och identifiering av UNGATs. ( B)Kylning avsevärt minskad autofluorescens vid 488 nm våglängd, särskilt i områden med en hög koncentration av erytrocyter (*, prickade linjen). Det förbättrade detektion av colocalized proteiner, citH3, och neutrophil elastase (pilspets), i närvaro av erytrocyter (Skala bar = 200 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tillägg Figur 1: Representativa immunofluorescensbilder av arteriell trombi från en katt. Sektionerna var färgade för DNA (blå), citH3 (röd) och antingen myeloperoxidas (A) eller neutrofil elastase (B). (A)Trots att använda en felint-specifik myeloperoxidas antikroppar (MPO, 1:5), färgning intensitet MPO förblev dålig. (B)Med hjälp av en polyklonal neutrofil elastas (NE) antikropp, känd för att korsreagera med flera arter, var immunoreaktivitet och färgning intensitet betydligt högre. Notera de karakteristiska lobulated kärnorna av neutrofiler omgiven av NE (pilar). Original 40x förstoring; Skala bar = 100 μm. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
| Blockera buffert | Sammansättning | |
| 1 | TBS med 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% getserum | |
| 2 | TBS med 0,1% Tween-20, 10% kanin serum, 0,1%NP-40 | |
| 3 | TBS med 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabell 1: Sammansättning av blockerande buffertar som används för immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera UNGATs i fasta feline cardiogenic kranskärlens trombi med hjälp av en dubbel immunmärkning protokoll och immunofluorescens mikroskopi. Även om endast cardiogenic kranskärlens trombi var färgade, i teorin detta protokoll kan användas för andra typer av trombi och i andra veterinärmedicinska arter. Identifiering av unga som varken arbetar eller studerar inom felint arteriell trombi tyder på att unga som varken arbetar eller studerar kan spela en roll i trombos hos katter.
Detektion av unga som är et-material genom immunfluorescens i fast och paraffininbäddad vävnad är överlägsen konventionella histologiska fläckar som H&E, som ofta visar trådar av kromatin omgiven av neutrofiler13. Immunohistochemistry och immunofluorescens av fast arteriell trombi möjliggör samtidig detektion av cfDNA och andra extracellulära proteiner som citH3, kända för att vara specifika för UNGATs formation18,19. Eftersom cryopreparations är suboptimala för NET detektion i vävnader och trombi, bevarade vi våra prover i 10% neutral-buffrad formalin, som innehåller 4% formaldehyd och 10% metanol. Cellfria nukleinsyror fixeras inte direkt av formaldehyd. Istället är de immobiliserade inom fasta proteinstrukturer, som ändras av delvis reversibla metylenbrokorslänkar som framkallas av formaldehyd20. För att ytterligare begränsa artefakter och autofluorescens orsakad av myrsyra och ketoner som genereras av oxidation av formaldehyd, kan utredarna välja att använda metanol-fri paraformaldehyd utspädd i buffert för fixering. Eftersom bindningstiden påverkar immunoreaktiviteten rekommenderar vi fixering under högst 24 timmar före uttorkning och paraffininbäddning. Paraffin-inbäddade vävnader eller blodproppar kan sedan lagras för deparaffinering och färgning.
Kemisk fixering genom formaldehyd och paraformaldehyd förändrar proteinernas tertiära struktur, maskerar de antigener av intresse och förhindrar bindning av antikroppar till specifika epitoper21. Antigen hämtning, en process som bryter metylenbron tvärlänkar, är viktigt innan de utför immundetection i formalin-fasta vävnader. Baserat på författarnas erfarenhet, värme-inducerad antigen hämtning med hjälp av en alkalisk hämtning lösning (pH = 9 i Tris/EDTA buffert) med mild indirekt uppvärmning förbättrar detektion av proteiner och unga som varken arbetar eller studerar samtidigt minimera artefakter och autofluorescens. Antigenhämtningslösningens temperatur bör inte nå kokpunkten (>100 °C), eftersom denaturering av proteiner kan leda till ospecifik bindning och bakgrundsljud.
En begränsning av NET-identifiering i fasta blodproppar är att immunofluorescensfärgning kan vara mycket varierande under olika antigenhämtningsförhållanden18. Jämförbar med resultaten som hittats av Brinkmann et al., fann vi att högre inkubation temperaturer (>55 °C) resulterade i optimal färgning av histoner i atomkärnor och dekondenserad kromatin19. Vi fann dock att färgning intensiteten av myeloperoxidase, ett granulat protein som finns i neutrofiler och UNGATs, var låg under de föreslagna villkoren. Den dåliga immunoreactivityen av myeloperoxidas var konsekvent trots användning av en felint-specifik antikropp (Tillägg figur 1). Därför uppmuntrar vi utredare att ändra varaktighet och förhållanden (t.ex. pH, temperatur) av antigen hämtningsprocessen för att ge en tillfredsställande signal baserat på antigen av intresse.
En av utmaningarna med att identifiera unga som varken arbetar eller studerar hos veterinärmedicinska arter är bristen på artspecifika antikroppar. För att förhindra störningar som uppstår vid användning av primära antikroppar som härrör från samma art, inkluderade vi ett ytterligare blockerande steg med hjälp av en hög koncentration av kaninimmunglobuliner för att mätta eventuella återstående bindningsställen på getens antikanin sekundära antikroppar. En stor nackdel med denna teknik är att det är tidskrävande, eftersom det kräver flera inkubation steg. Utredarna bör inkludera två olika kontroller som utesluter antingen primär antikropp i det andra immunomärkningssteget för att säkerställa att den sekundära antikroppen från antingen immunomärkningssteget binder specifikt till dess primära antikropp. De identifierade NET-strukturernas specificitet kan kontrolleras ytterligare genom DNase-rötning eller införande av biologiska kontroller som består av aortabifurkationer från katter utan CATE (figur 5). Dessutom bör negativa kontroller bestående av samma koncentration av antikroppar mot isotypkontroll som de primära antikropparna inkluderas för att utesluta ospecifika antikroppsinteraktioner, ospecificerad bindning till Fc-receptorer och cellulär autofluorescens. Utredare rekommenderas att ändra detta protokoll baserat på tillgången på artspecifika antikroppar. Om det inte finns några artspecifika antikroppar rekommenderar vi att först utvärdera immunoreaktiviteten hos antikroppar med hjälp av immunocytokemi eller utvärdera proteinavskriften från de arter av intresse för homologi till de refererade transkriptionerna.
Faktorer som provfixering, otillräcklig deparaffinering och förekomsten av specifika vävnadskomponenter kan leda till autofluorescens i trombi. Under aldehyd fixering, aminer kan kombinera med aldehyder för att bilda Schiff bas komplex, som avger fluorescens22. Ofullständig deparaffinering kan också kemiskt ändra proteinerna i vävnaden, vilket skapar autofluorescens23. Extracellulära komponenter i kärlprover som kollagen, elastin och röda blodkroppar rapporteras naturligt fluorescera hos däggdjur24,25. Eftersom naturlig eller iatrogen autofluorescens är mest märkbar i de gröna våglängderna (excitation = 488 nm, emission = 500–550 nm), kan användningen av långröda fluorofores minimera vissa autofluorescens26. I det nuvarande protokollet använde vi en kommersiellt tillgänglig autofluorescens släckning kit utformad för att elektrostatiskt binda till autofluorescent vävnadselement. Vi rekommenderar att utredarna optimera varaktigheten av autofluorescens kylning, eftersom tillverkarens rekommendation på 5 min kan minska immunoreaktivitet av mindre rikliga proteiner. Alternativt kan utredare också dämpa autofluorescens med Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine eller trypan blå27.
Eftersom unga som varken arbetar eller studerar distribueras i en trombos rekommenderas en grundlig kartläggning av hela aorta- och höftartärerna. Regioner positiva för cfDNA, citH3 och NE förstoras sedan. Colocalization av cfDNA, citH3 och NE har använts i stor utsträckning för att identifiera NET-bildning och för att skilja NET-bildning från andra former av celldöd. Till skillnad från en nyligen mänsklig studie som fann ATT unga som varken kunde koncentreras till koronaltrombi, var de flesta av de unga i felint arteriell trombi grupperade vid kraniala aspekten av proppen28. Även om vi använde ett standardiserat protokoll för att identifiera unga som varken arbetar eller studerar, förblir mikroskopisk utvärdering och kvantifiering av unga som varken arbetar eller studerar subjektivt. Här använde vi en förblindad och systematisk metod för att minimera observatör bias under mikroskopisk analys. Eftersom antalet unga som varken arbetar eller studerar i ett prov kan påverkas av antalet neutrofiler kan utredarna kvantifiera unga unga och unga i förhållande till antalet neutrofiler genom att identifiera neutrofiler baserat på kärnmorfologi, celldiameter och uttryck för neutrofila proteiner. En annan utmaning med NET identifiering med hjälp av mikroskopi är att unga som varken arbetar eller studerar har dåligt definierade marginaler och de tenderar att gå samman och bilda oklara strukturer. Detta kan leda till under- eller överskattning av antalet unga som varken arbetar eller studerar i ett visst prov. Därför, i stället för DAPI, nets kan färgas med Sytox Green för tydligare identifiering och denotation av cell-appendant DNA från UNGAS bildas.
Vi har utvecklat en dubbel immunmärkning protokoll för att identifiera NETs i paraffin-inbäddade feline kranskärlens trombi. Deparaffinisering, rehydrering och antigen hämtning måste ske före immunomärkning av citH3 och NE. Denna analys kan vara ett värdefullt verktyg för studier av NET-bildning hos katter och ge en bättre förståelse av patofysiologiska cate hos katter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av medel från University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Författarna vill erkänna Dr Kevin Woolard för användning av fluorescens mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
