Summary
We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.
Abstract
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), samengesteld uit celvrij DNA (cfDNA) en eiwitten zoals histonen en neutrofiele elastase (NE), worden vrijgegeven door neutrofielen in reactie op systemische ontsteking of ziekteverwekkers. Hoewel eerder is aangetoond dat NETs de stolselvorming vergroten en fibrinolyse remmen bij mensen en honden, is de rol van NET's bij katten met cardiogene arterial trombo-embolie (CATE), een levensbedreigende complicatie secundair aan hypertrofische cardiomyopathie , is onbekend. Een gestandaardiseerde methode om NET's te identificeren en te kwantificeren bij cardiogene arteriële trombi bij katten zal ons begrip van hun pathologische rol in CATE bevorderen. Hier beschrijven we een techniek om NET's te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde trombi binnen de aortabifurcatie, geëxtraheerd tijdens obductie. Na deparaffinisatie met xyleen ondergingen aortasecties indirect warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning. Secties werden vervolgens geblokkeerd, permeabilized, en ex vivo NETs werden geïdentificeerd door colocalisatie van cel-vrij DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), en neutrophil elastase (NE) met behulp van immunofluorescentie microscopie. Om de immunodetectie van NET's in trombi te optimaliseren, werd autofluorescentie van weefselelementen beperkt door een autofluorescentieblusproces voorafgaand aan microscopie te gebruiken. Deze techniek kan een nuttig hulpmiddel zijn om NET's en trombose bij andere soorten te bestuderen en biedt nieuwe inzichten in de pathofysiologie van deze complexe aandoening.
Introduction
Katten met hypertrofische cardiomyopathie lopen het risico op levensbedreigende trombo-embolie complicaties1,2. Ondanks de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met katachtige cardiogene arteriële trombo-embolie (CATE), wordt de onderliggende pathofysiologie van CATE bij katten slecht begrepen. Er zijn ook beperkte diagnostische en therapeutische instrumenten om katten te behandelen en te identificeren die het risico lopen op deze verwoestende aandoening3.
Naast zijn rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen is aangetoond dat een rol spelen in trombose door het vrijgeven van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs), die web-achtige netwerken van cel-vrij DNA (cfDNA) ingelegd met histonen en korrelige eiwitten zoals neutrofiele elastase (NE) en myeloperoxidase. Neutrofielen ondergaan NETs vorming in reactie op systemische ontsteking, directe ontmoeting met ziekteverwekkers, en interactie met geactiveerde bloedplaatjes4,5,6,7. Bij honden is aangetoond dat neutrofie-afgeleid DNA stolsellyse remt, terwijl NET-eiwitten de stolselvorming versnellen. Het vermogen van NET's om circulerende cellen en stollingscomponenten te vangen is ook de sleutel tot hun trombogene eigenschappen8,9,10,11,12.
NET's worden gedetecteerd door colokalisatie van extracellulaire neutrofiele eiwitten, histonen en cfDNA. Hierdoor is de identificatie en kwantificering van NET's in vaste weefsels door immunofluorescentie van gedeparafeerde weefsels superieur aan traditionele hematoxyline en eosine (H&E) vlek met behulp van heldere veldmicroscopie4,5. Verschillende menselijke studies met behulp van immunofluorescentie microscopie geïdentificeerd NETs als structurele componenten van coronaire arteriële trombi, cerebrale beroerte trombi, atherothrombosis, en veneuze trombi13,14,15,16,17. Tot op heden is een gestandaardiseerde methode om NET's in katachtige trombi op te sporen en te kwantificeren niet beschreven. Omdat de identificatie van NET's in katachtige cardiogene arteriële trombi toekomstig translationeel onderzoek in NET's en trombose kan vergemakkelijken, beschrijven we technieken van NET-identificatie en -beoordeling in paraffine-ingebedde arteriële trombi bij katten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California, Davis. Necropsies en biopten van weefsels werden uitgevoerd met toestemming van de eigenaars.
1. Weefselfixatie, inbedding en doorsnede
- Ontleed de aortabifurcatie, met inbegrip van de dalende aorta, dijbeenslagader, en de gemeenschappelijke iliacale slagaders (Figuur 1A), kort na humane euthanasie of dood. Blunt ontleden de fascia (Figuur 1B) alvorens het volledig onder te dompelen in 10% neutraal gebufferde formaline voor een minimum van 24 uur en niet langer dan 48 uur.
- Om het monster uit te drogen, dompel je eerst onder in 10% neutraal gebufferd formaline verwarmd tot 37 °C gedurende 1 uur. Dompel vervolgens onder in toenemende concentraties ethanol verwarmd tot 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x voor 1 uur per stuk. Ten slotte, zonder spoelen, dompel 2x onder in 100% tolueen verwarmd tot 37 °C gedurende 1 uur per stuk.
- Voeg paraffine verwarmd tot 62 °C toe en laat de paraffine 's nachts volledig stollen.
- Sectie 2–3 μm van het paraffine-ingebedde weefsel met behulp van een microtoom en plaats op positief geladen glasplaten. Bewaar doordeelde weefsels bij -80 °C tot verdere analyse.
2. Deparaffinisatie, rehydratie en warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning
- Als u deparaffinisatie en rehydratie van secties op glazen platen wilt uitvoeren, plaatst u glazen dia's in rekken en verwerkt u het volgende:
- Dompel volledig onder in 100% xyleen voor 3 min. Herhaal deze stap 2x. Spoel niet tussen de stappen door.
- Volledig onderdompelen in dalende concentraties ethanol (100%, 95%, 70%) bij kamertemperatuur (RT), 3x voor 3 min per stuk. Spoel niet tussen de stappen door.
- Dompel volledig onder in gedeïoniseerd water gedurende 2 min. Herhaal.
- Plaats secties in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) voor 2-3 min.
- Vul het reservoir met gedeïoniseerd water verwarmd tot 100 °C. Laat de stoomkamer 20 min equilibreren.
OPMERKING: Warmte-geïnduceerde antigen retrieval kan het best worden uitgevoerd met indirecte verwarming gegenereerd door een stoomboot met een vooraf ingestelde temperatuurinstelling, zoals een voedselstoomboot. - Verwarm de commercieel verkrijgbare antigeenterugwinningsoplossing met Tris en EDTA (pH = 9) tot 95-97 °C op een temperatuurgecontroleerde kookplaat met constante roeren. Zorg ervoor dat het niet kookt.
LET OP: De oplossing moet bewolkt worden zodra deze is opgewarmd. - Giet de verwarmde antigeenterugwinningsoplossing in een schuifcontainer en plaats de container in de kamer van de stoomboot. Laat de antigeenterugwinningsoplossing 3-4 min afstellen met de temperatuur van de stoomboot. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kamer ~95 °C is.
- Dompel de dia's volledig onder in de verwarmde antigeenterugwinningsoplossing en zet de toepassing van externe verwarming gedurende 20 min voort.
- Haal de schuifcontainer uit de stoomboot en laat de dia's en de antigeenterugwinningsoplossing afkoelen tot RT. Bewaar de verdunde antigeenophaaloplossing op 4 °C en hergebruik tot 2x indien nodig.
- Was de dia's 3x met TBST voor 5 min.
3. Immunolabeling en autofluorescentie blussen
OPMERKING: Tabel 1 beschrijft de samenstelling van de blokkeringsbuffers die in de volgende stappen worden gebruikt.
- Incubeer secties in Blocking Buffer 1 voor 2 uur bij RT onder zacht schommelen (30-50 rpm). Verzegelmet paraffinefolie om uitdroging te voorkomen.
- Zonder wassen, onmiddellijk van toepassing 100 μL verdunde konijn polyklonale anti-menselijke citrullinated histon H3 (citH3) antilichaam (0,03 mg/mL verdund in blokkerenbuffer 1) direct op de dia.
- Plaats op elke sectie een uitglijder (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) zodat het antilichaammengsel gelijkmatig kan worden verdeeld.
- Incubeer voor 12-16 uur bij 4 °C met zacht schommelen (30-50 tpm). Verzegelmet parafilmfolie om uitdroging te voorkomen.
- Was 3x met TBST voor 5 min.
- Breng 100 μL geitenantikonijn antilichaam aan dat is geconjugeerd op Alexa Fluor 488 (verdund tot een eindconcentratie van 0,04 mg/mL of 1:50 in Blocking Buffer 1) zoals beschreven in stap 3.3. Incubeer gedurende 1 uur bij RT onder zacht schommelen (30-50 rpm). Bescherm dia's tegen licht.
- Was met TBST 3x voor 5 min.
- Incubeer secties in Blocking Buffer 2 's nachts bij 4 °C onder zacht schommelen (30-50 rpm). Beschermen tegen licht.
- Was met TBST 3x voor 5 min.
- Blok secties in Blocking Buffer 3 zoals beschreven in stap 3.3 bij RT voor 2 uur onder zachte schommelen (30-50 rpm).
- Incubeersecties met bioateuze polyklonale konijnenanti-menselijk NE-antilichaam (eindconcentratie = 0,2 μg/mL in blocking buffer 3) bij 4 °C voor 12-16 uur zoals beschreven in stappen 3.2–3.4.
- Was met TBST 3x voor 5 min.
- Incubeer met Alexa Fluor 594 streptavidin conjugaat (verdunnen tot 1:100 of 0,02 mg/mL in Blocking Buffer 3) zoals beschreven in stappen 3.2–3.3 gedurende 1 uur bij RT. Bescherm tegen licht en afdichting met paraffine om uitdroging te voorkomen.
- Was met TBST 1x voor 5 min.
- Breng 100 μL autofluorescentieblusoplossingmengsel direct aan op de secties gedurende 1 min, zoals geïnstrueerd door de fabrikant.
- Was de glijbanen met TBST 6x voor 10 min.
- Bedek elke dia met 100 μL van 300 nM DAPI gedurende 5 min in het donker.
- Was met TBST voor 3 min. Herhaal dit voor een totaal van 5x.
- Breng een druppel (~ 50 μL) antifade montagemedium, onderdeel van de autofluorescentiebluskit, rechtstreeks aan op de glazen schuif rond de sectie. Plaats een uitglijder (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) voorzichtig op de sectie zonder dat er bellen ontstaan.
- Laat monsters 's nachts in het donker bij 4 °C genezen totdat het montagemedium is uitgehard voor microscopische analyse met onderdompelingslenzen.
4. Identificatie van neutrofiele extracellulaire val
OPMERKING: Het volgende protocol maakt gebruik van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop met een 1.280 x 960 digitale CCD-camera (zie Tabel van materialen).
- Om trombi te lokaliseren, scant cranially om caudally langs de lengte van de aorta, aortabifurcatie, en elke femorale slagader met behulp van fase contrast microscopie met een 10x doelstelling. Een trombus is een conglomeraat van weefsel met rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes grenzend aan het endotheel op fasecontrast en heldere veldmicroscopie(figuur 2A, figuur 2B).
- Onderzoek eerst secties voor NET's met behulp van het DAPI-kanaal (excitatie = 357/44 nm) met 10x- en 20x-doelstellingen(figuur 2C). Merk op dat cfDNA verschijnt als gedecondenseerd DNA dat zich niet binnen de grenzen van het cytoplasma van een cel bevindt wanneer het wordt gezien op fasecontrast of heldere veldmicroscopie.
- Identificeer extracellular NE en citH3 op de Texas Red kanalen (excitatie = 585/29 nm, emissie = 628/32 nm) en groen fluorescerend eiwitkanaal (excitatie = 470/22 nm, emissie = 525/50 nm), respectievelijk met 10, 20 en 40x doelstellingen.
- Net's in een trombus evalueren en analyseren met behulp van beschikbare software, zoals Image J (NIH). NET-vorming wordt geïdentificeerd op basis van de colokalisatie van cfDNA, extracellulaire citH3 en NE zoals eerder beschreven18. Houd een consistente belichtingstijd en -winsten van elk kanaal behouden tijdens het verkrijgen van afbeeldingen om verzadiging in pixelintensiteit te voorkomen.
- Breng elke trombus in kaart op basis van de nabijheid van de dalende aorta door deze te verdelen in drie gelijke zones, met zone 1 die het dichtst bij de aorta ligt, zone 3 het verst van de aorta en zone 2 tussen zone 1 en 3). Met de operator verblind door de medische toestand van elk onderwerp, neem ten minste tien willekeurige velden in elke zone. Karakteriseren van de verdeling van NET's in trombi door het gemiddelde van het aantal velden met NET's in elke zone of het berekenen van de gemiddelde NET-bezettende gebied per zone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol voor deparaffinisatie, warmte-geïnduceerde antigen retrieval, en dubbele immunolabeling van paraffine-ingebedde trombi, identificeerden we NETs in katachtige CATE voor de eerste keer. Thrombi binnen de aortabifurcatie werden gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie en heldere veldmicroscopie met behulp van standaard H&E-kleuring en fasecontrastmicroscopie. Op heldere veldmicroscopie bestond katachtige arteriële trombi uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrine en bloedplaatjes (figuur 3A). Hoewel H&E specifieke NET-componenten niet kan bevlekken, verschenen NET's vaak als netwerken van diepe paarse draden van verschillende lengtes rond nabijgelegen erytrocyten en leukocyten (figuur 3A,gestippelde omtrek). Een trombus werd gekenmerkt als een goed afgebakende structuur binnen de vasculaire ruimte op fase contrast microscopie (Figuur 2A, Figuur 4B). We bevestigden verder de aanwezigheid van NET's binnen deze gebieden door immunofluorescentiemicroscopie (figuur 3B). Vergroting van deze gebieden bleek grote aggregaten van NETs, samengesteld uit cfDNA, extracellulaire citH3, en NE (Figuur 2C, Figuur 3B, witte stippellijn). Met behulp van dezelfde techniek om te zoeken naar trombi en NETs bij katten zonder CATE, vonden we dat vellen van lyzed neutrofielen af en toe konden worden gedetecteerd in de nabijheid van het endotheel. Hoewel deze neutrofielen enkele morfologische kenmerken van NET-vorming vertoonden, mogen ze niet geassocieerd worden met een georganiseerde trombus. We hebben geen trombi in een van de controlemonsters(figuur 4A)geïdentificeerd.
Figuur 5A toont diepgaande autofluorescentie van stolselelementen zoals erythrocyten en collageen wanneer afgebeeld op de groene (488 nm) golflengte, die ons vermogen om cfDNA en eiwitcolokalisatie te detecteren belemmerd. We vonden dat korte autofluorescentie blussen met behulp van een commercieel beschikbare kit na immunolabeling aanzienlijk verhoogde de gevoeligheid van eiwit coloklokalisatie en NET-detectie, zelfs in gebieden met een overvloed aan erythrocyten (Figuur 5B, pijlpunten).
Figuur 1: Representatieve obductiefoto's van een ontleedaortabifurcatie van een kat met cardiogene arterial trombo-embolie. (A) De dalende aorta werd ontleed 4-5 cm craniale (Cr) aan de aorta bifurcatie. (B) Fascia werd zorgvuldig ontleed tot de dalende aorta (1) en iliacale slagaders (2,3) waren duidelijk zichtbaar op het caudal aspect (Cd). Let op de trombus binnen de aortabifurcatie (*). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve fasecontrast en immunofluorescentiebeelden van NET's in een trombus gevonden in een katachtige aortabifurcatie. (A) Fase contrast microscopie bleek een trombus als een discrete en goed afgebakende structuur dicht bij de aorta. Gecombineerd fasecontrast en fluorescentiekleuring van DNA (blauw) toonden de aanwezigheid van leukocyten en celvrij DNA in de trombus. Het boxed gebied bestaat uit een grote concentratie celvrij DNA. Originele 10x vergroting; Schaalbalk = 400 μm. (B) Het boxed area in (A) werd verder vergroot met 20x. Celvrij DNA en intracellulair DNA bevlekt met DAPI (blauw), neutrofiel elastase (NE) en citrullinated histone H3 (citH3) verschenen respectievelijk groen en rood. (Originele 20x vergroting; Schaalbalk = 100 μm). (C) NET's, geïdentificeerd op basis van colokalisatie van celvrij DNA, extracellulaire NE en citH3, werden geschetst (stippellijn). Originele 40x vergroting; Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatief beeld van een katachtige arteriële trombus met behulp van H&E en immunofluorescentiekleuring. (A) Op H&E vlek, grote concentratie van neutrofielen en erythrocyten waren zichtbaar. Extracellulaire chromatines verschenen als diepe paarse draden van verschillende lengtes omgeven door erytrocyten en neutrofielen (gestippelde omtrek, zwarte pijl). (B) Neutrofiele extracellulaire vallen werden gemakkelijk gevisualiseerd met behulp van immunofluorescentie microscopie op dezelfde trombus (gestippelde omtrek, witte pijl). NET's werden geïdentificeerd als colokalisatie van cfDNA (blauw), NE (groen) en citH3 (rood). Originele 20x vergroting; Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve fasecontrast en immunofluorescentiebeelden van aortabifurcies. (A) Fasecontrast en immunofluorescentiebeelden van aortabifurcies bij een kat zonder arteriële trombose. Let op de afwezigheid van trombi of aggregaten van neutrofielen in het lumen van de aortabifurcatie van de kat zonder arteriële trombose. (B) Fase contrast en immunofluorescentie beelden van aortabifurcations bij een kat gediagnosticeerd met cardiogene arteriële trombo-embolie. De aortabifurcacaties werden gekleurd voor DNA (blauw), neutrofiel elastase (groen), en citrullinated histone H3 (rood). In dit geval werd een goed afgebakende trombus die uitpuilde in de vaatwand en het grootste deel van het aortalumen bezetten, opgemerkt bij de kat met cardiogeen arterial trombo-embolie. NETs, gekenmerkt door colokalisatie van cfDNA, NE, en citH3, werden geïdentificeerd binnen de trombus (gestippelde omtrek). Originele 10x vergroting; Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve fasecontrast (PC) en immunofluorescentiebeelden van arteriële trombi van twee katten. De dia's werden gekleurd voor citH3, NE, en DNA en afgebeeld op 488 nm (rood), 595 nm (groen), en 357 nm (blauwe) golflengten, respectievelijk, op 40x vergroting. Cardiogene arteriële trombi bij katten had een overvloed aan erythrocyten (*, stippellijn). (A) Autofluorescentie van erythrocyten was het meest prominent over de 488 nm golflengte, het verminderen van de detectie van colocalisatie signaal en identificatie van NETs. (B) Het blussen aanzienlijk verminderd autofluorescentie op de 488 nm golflengte, met name in gebieden met een hoge concentratie van erythrocyten (*, stippellijn). Het verbeterde de detectie van gecolocaliseerde eiwitten, citH3 en neutrofiele elastase (pijlpunt), in aanwezigheid van erythrocyten (Schaalbalk = 200 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Supplement Figuur 1: Representatieve immunofluorescentiebeelden van arteriële trombi van een kat. De secties werden gekleurd voor DNA (blauw), citH3 (rood), en ofwel myeloperoxidase (A) of neutrofiele elastase (B). (A) Ondanks het gebruik van een katachtige-specifieke myeloperoxidase antilichaam (MPO, 1:5), de kleurintensiteit van MPO bleef slecht. (B) Met behulp van een polyklonale neutrofiele elastase (NE) antilichaam, bekend om cross-react met meerdere soorten, de immunoreactiviteit en kleurintensiteit waren aanzienlijk hoger. Let op de karakteristieke gelobde kernen van neutrofielen omringd door NE (pijlen). Originele 40x vergroting; Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
| Buffer blokkeren | Samenstelling | |
| 1 | TBS met 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% geitenserum | |
| 2 | TBS met 0,1% Tween-20, 10% konijnenserum, 0,1%NP-40 | |
| 3 | TBS met 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabel 1: Samenstelling van de blokkerende buffers die worden gebruikt voor immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een protocol om NET's te identificeren in vaste katachtige cardiogene arteriële trombi met behulp van een dubbel immunolabelingprotocol en immunofluorescentiemicroscopie. Hoewel alleen cardiogene arteriële tromiale trombi werd gekleurd, in theorie dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten trombi en in andere diersoorten. Identificatie van NET's binnen katachtige arteriële trombi suggereert dat NET's een rol kunnen spelen bij trombose bij katten.
Detectie van NET's door immunofluorescentie in vast en paraffine-ingebed weefsel is superieur aan conventionele histologische vlekken zoals H&E, die vaak draden van chromatine toont omringd door neutrofielen13. Immunohistochemie en immunofluorescentie van vaste arteriële trombi maken het mogelijk om cfDNA en andere extracellulaire eiwitten zoals citH3, waarvan bekend is dat ze specifiek zijn voor NETs-vorming18,19. Omdat cryopreparaten suboptimaal zijn voor NET-detectie in weefsels en trombi, hebben we onze monsters bewaard in 10% neutraal gebufferd formaline, dat 4% formaldehyde en 10% methanol bevat. Celvrije nucleïnezuren worden niet direct gefixeerd door formaldehyde. In plaats daarvan worden ze geïmmobiliseerd in vaste eiwitstructuren, die worden gewijzigd door gedeeltelijk omkeerbare methyleenbrugcrosslinks veroorzaakt door formaldehyde20. Om artefacten en autofluorescentie veroorzaakt door mierenzuur en ketonen die worden gegenereerd door oxidatie van formaldehyde verder te beperken, kunnen onderzoekers ervoor kiezen om methanolvrije paraformaldehyde te gebruiken die in buffer wordt verdund voor fixatie. Omdat de duur van fixatie van invloed is op immunoreactiviteit, raden we fixatie aan voor niet langer dan 24 uur voorafgaand aan uitdroging en paraffineinbedding. Paraffine-ingebedde weefsels of stolsels kunnen dan worden opgeslagen voor deparaffine en kleuring.
Chemische fixatie door formaldehyde en paraformaldehyde verandert de tertiaire structuur van eiwitten, maskeert de antigenen van belang en voorkomt de binding van antilichamen aan specifieke epitopen21. Antigeen terugwinning, een proces dat de methyleenbrug crosslinks breekt, is essentieel voorafgaand aan het uitvoeren van immunodetectie in formaline-vaste weefsels. Op basis van de ervaring van de auteurs, warmte-geïnduceerde antigen retrieval met behulp van een alkalische retrieval oplossing (pH = 9 in Tris / EDTA buffer) met milde indirecte verwarming verbetert de detectie van eiwitten en NETs terwijl het minimaliseren van artefacten en autofluorescentie. De temperatuur van de antigeenterugwinningsoplossing mag het kookpunt (>100 °C) niet bereiken, omdat het denaturepen van eiwitten kan leiden tot niet-specifieke binding en achtergrondgeluid.
Een beperking van de NET-identificatie in vaste stolsels is dat immunofluorescentiekleuring zeer variabel kan zijn onder verschillende antigeenterugwinningsomstandigheden18. Vergelijkbaar met de resultaten van Brinkmann et al., vonden we dat hogere incubatietemperaturen (>55 °C) resulteerden in een optimale kleuring van zijntonen in de kernen en gedecondenseerde chromatine19. We ontdekten echter dat de kleurintensiteit van myeloperoxidase, een korrelig eiwit dat in neutrofielen en NET's werd gevonden, onder de voorgestelde omstandigheden laag was. De slechte immunoreactiviteit van myeloperoxidase was consistent ondanks het gebruik van een katachtige-specifieke antilichaam(Supplement Figuur 1). Daarom moedigen we onderzoekers aan om de duur en omstandigheden (bijvoorbeeld pH, temperatuur) van het antigeenterugwinningsproces te wijzigen om een bevredigend signaal op basis van het antigeen van belang te geven.
Een van de uitdagingen bij de identificatie van NET's in diersoorten is het ontbreken van soortenspecifieke antilichamen. Om te voorkomen dat de interferentie ondervonden bij het gebruik van primaire antilichamen afkomstig van dezelfde soort, hebben we een extra blokkeringsstap opgenomen die gebruik maakt van een hoge concentratie konijnenimmunoglobulinen om de resterende bindende plaatsen op de secundaire antilichamen van de geit-konijnen te verzadigen. Een groot nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend is, omdat het meerdere incubatiestappen vereist. Onderzoekers moeten twee verschillende controles opnemen die een van beide primaire antilichamen uitsluiten in de tweede immunolabelingsstap om ervoor te zorgen dat het secundaire antilichaam van een van beide immunolabellingsstappen specifiek bindt aan zijn primaire antilichaam. De specificiteit van de geïdentificeerde NET-structuren kan verder worden geverifieerd door de DNase-vertering of de opneming van biologische controles bestaande uit aortabifurcaties van katten zonder CATE (figuur 5). Bovendien moeten negatieve controles die bestaan uit dezelfde concentratie van isotypebestrijdingsantilichamen als de primaire antilichamen worden opgenomen om niet-specifieke antilichaaminteracties uit te sluiten, niet-specifieke binding met Fc-receptoren en cellulaire autofluorescentie. Onderzoekers wordt geadviseerd om dit protocol te wijzigen op basis van de beschikbaarheid van soortenspecifieke antilichamen. Als er geen soortenspecifieke antilichamen beschikbaar zijn, adviseren we om eerst de immunoreactiviteit van antilichamen te evalueren met behulp van immunocytochemie of het eiwittranscript te evalueren van de soorten die van belang zijn voor homologie naar de naar de verwijzing genoemde transcripties.
Factoren zoals monsterfixatie, onvoldoende deparaffinisatie en de aanwezigheid van specifieke weefselcomponenten kunnen leiden tot autofluorescentie in trombi. Tijdens aldehydefixatie kunnen amines worden gecombineerd met aldehyden om Schiff-basiscomplexen te vormen, die fluorescentie22uitstoten. Onvolledige deparaffinisatie kan ook chemisch wijzigen van de eiwitten in het weefsel, het creëren van autofluorescentie23. Extracellulaire componenten in vasculaire monsters zoals collageen, elastine en rode bloedcellen worden gemeld op natuurlijke wijze fluoresceren bij zoogdieren24,25. Omdat natuurlijke of iatrogene autofluorescentie het meest merkbaar is in de groene golflengten (excitatie = 488 nm, emissie = 500-550 nm), kan het gebruik van veelrode fluoropforen sommige autofluorescentie26minimaliseren. In het huidige protocol maakten we gebruik van een commercieel beschikbare autofluorescentie bluskit die is ontworpen om elektrostatisch te binden aan autofluorescerende weefselelementen. We raden onderzoekers aan de duur van autofluorescentiete te optimaliseren, omdat de aanbeveling van de fabrikant van 5 minuten immunoreactiviteit van minder overvloedige eiwitten kan verminderen. Als alternatief kunnen onderzoekers ook autofluorescentie dempen met Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine of trypan blauw27.
Omdat NET's heterogeen verdeeld zijn in een trombus, wordt een grondige mapping van de gehele aorta en iliacale slagaders aanbevolen. Regio's positief voor cfDNA, citH3 en NE worden vervolgens vergroot. De colokalisatie van cfDNA, citH3 en NE is op grote schaal gebruikt om NET-vorming te identificeren en de NET-vorming te onderscheiden van andere vormen van celdood. In tegenstelling tot een recente menselijke studie die vond NETs te worden geconcentreerd aan de periferie van coronaire trombi, de meeste van de NET's in katachtige arteriële trombi waren geclusterd op de schedel aspect van het stolsel28. Hoewel we een gestandaardiseerd protocol gebruikten om NET's te identificeren, blijft microscopische evaluatie en kwantificering van NET's subjectief. Hier gebruikten we een geblindeerde en systematische methode om de vooringenomenheid van waarnemers te minimaliseren tijdens microscopische analyse. Omdat het aantal NET's in een monster kan worden beïnvloed door het aantal neutrofielen, kunnen onderzoekers NET's kwantificeren ten opzichte van het aantal neutrofielen door neutrofielen te identificeren op basis van nucleaire morfologie, celdiameter en expressie van neutrofiel-specifieke eiwitten. Een andere uitdaging van NET-identificatie met behulp van microscopie is dat NET's slecht gedefinieerde marges hebben en ze hebben de neiging om samen te voegen, waardoor vage structuren worden gevormd. Dit kan leiden tot onder- of overschatting van het aantal NET's in een bepaald monster. Daarom kunnen NET's in plaats van DAPI's worden gekleurd met Sytox Green voor een duidelijkere identificatie en denotatie van celafhankelijk DNA van NETs-vorming.
We hebben een dubbel immunolabeling protocol ontwikkeld om NET's te identificeren in paraffine-ingebedde katachtige arteriële trombi. Deparaffinisatie, rehydratie en antigeenterugwinning moeten plaatsvinden vóór immunolabeling van citH3 en NE. Deze test kan een waardevol hulpmiddel zijn voor de studie van NET-vorming bij katten en een beter begrip bieden van de pathofysiologie van CATE bij katten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door fondsen van de University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). De auteurs willen Dr. Kevin Woolard erkennen voor het gebruik van de fluorescentiemicroscoop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
