Summary
Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la modélisation efficace du muscle de dystrophie musculaire de Duchenne utilisant les cellules d’urine-dérivées myOD1-convertiespour évaluer la restauration de l’ARNm de dystrophine et des niveaux de protéine après saut d’exon.
Abstract
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie musculaire progressive et mortelle, est provoquée par des mutations dans le gène DMD qui ont comme conséquence l’absence de protéine de dystrophine. À ce jour, nous avons terminé une étude initiée par l’enquêteur à l’intention du Centre national de neurologie et de psychiatrie sur la base de l’injection systémique des oligonucléotides morpholino qui sont sujettes à l’exon-53 sauter. Pour le traitement efficace de DMD, l’essai in vitro avec des myoblastes dérivés des patients de DMD pour dépister des drogues et évaluer l’admissibilité des patients avant d’entreprendre des essais cliniques est considéré comme essentiel. Très récemment, nous avons rapporté une nouvelle cellule d’urine convertie myOD1(UDC) traitée avec l’inhibiteur de l’histone methyltransferase (3-deazaneplanocin A hydrochlorure), comme modèle cellulaire de DMD. Le nouvel UDC autologue pourrait montrer le phénocopy des phénotypes spécifiques à la maladie de DMD, menant à l’application de la médecine de précision dans une série de maladies liées aux muscles. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la modélisation efficace des cellules musculaires DMD utilisant myOD1-convertiUDCs avec la réaction inverse de la chaîne de polymérase de transcriptase (RT-PCR), le ballonnement occidental, et l’immunocytochemistry pour évaluer la restauration de l’ARN de mRNA de dystrophine et des niveaux de protéine après saut d’exon.
Introduction
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie musculaire progressive et mortelle, est causée par des mutations de trame-changement dans le gène DMD qui résultent de l’absence de protéine de dystrophine1. Antisense oligonucleotide-basé la thérapie de saut d’exon est pensé pour être prometteur pour DMD. Cette thérapie est basée sur la conversion du phénotype DMD plus sévère au phénotype doux de dystrophie musculaire de Becker en modifiant l’épissage pré-mRNA pour reconstituer le cadre de lecture de DMD 2. Nous avons récemment terminé une première étude en nature basée sur l’administration intraveineuse répétée de l’oligomère morpholinmer morpholino phosphorodiamidate (PMO), qui peut induire l’exon 53 sauter dans DMD, et a démontré un excellent profil d’innocuité,3l’efficacité prometteuse, et les paramètres pharmacocinétiques acceptables (enregistrés comme UMIN: 000010964 et ClinicalTrials.gov: NCT02081623 .
Cependant, pour développer des traitements rentables et efficaces pour la maladie, les tests in vitro à l’aide de cellules musculaires primaires obtenues auprès de patients atteints de DMD sont essentiels pour le dépistage des médicaments et la vérification de l’admissibilité des patients avant d’entreprendre des essais cliniques, ainsi que des biomarqueurs qui reflètent l’efficacité des thérapies de saut d’exon au cours des essais humains4. Très récemment, nous avons rapporté une nouvelle technologie pour développer des cellules spécifiques à l’urine (UDCs) converties par lepatient1 5, MYOD16 comme modèle de myoblaste primaire de DMD7. Ainsi, pour générer les myoblastes, seule la collecte d’urine des patients est nécessaire et aucune procédure invasive n’est nécessaire. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la modélisation efficace du muscle DMD utilisant myOD1-convertiUDCs traités avec 3-deazaneplanocin Un hydrochlorure pour évaluer l’ARNm de dystrophine restaurée et la protéine après saut exon.
Protocol
Le Comité d’éthique du Centre national de neurologie et de psychiatrie a approuvé cette étude (ID d’approbation : A2017-018, A2018-029). Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé avant de fournir de l’urine. Toutes les expériences ont été effectuées en vertu des lignes directrices et règlements pertinents.
1. Isolement et culture primaire des PDJ
REMARQUE : Les DUD ont été isolés selon un protocole précédemment publié8,9,10 avec quelques modifications.
- Recueillir des échantillons d’urine lors d’une micturition spontanée dans des bouteilles en plastique stérilisées.
REMARQUE : La stérilisation de l’orifice urétral externe n’est pas nécessaire. L’urine en plein air est souhaitable pour réduire le risque de contamination virale. Si le temps de stock avant la prochaine procédure est de 1 h, les échantillons d’urine doivent être transférés à 4 oC pour préserver la viabilité de la cellule. Cependant, une température de 'lt;4 'C devrait être évitée parce que des précipités insolubles peuvent apparaître. - Centrifuge l’échantillon d’urine entier à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer le supernatant, en laissant 1 ml dans le tube.
- Réutilisez les granulés individuellement dans les 1 ml d’urine restants, puis collectez-les dans un seul tube de 50 ml.
- Ajouter 10 ml de tampon de lavage composé de 99 ml de PBS sans calcium et magnésium, 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), 0,5 g/mL amphotericine B, et centrifugeuse les échantillons à 200 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer le supernatant, en laissant 0,2 ml dans le tube.
- Résuspendez les granulés cellulaires dans 4,5 ml du milieu primaire composé d’un mélange de 1:1 de glucose élevé Dulbecco modifié Eagle moyen (DMEM) sans pyruvate de sodium et jambon F-12 mélange d’éléments nutritifs complétés avec le facteur de croissance épidermique humaine recombinante (EGF), l’insuline, hydrocortisone, épinéphrine, T3, transferrine, sérum bovin foetal (FBS) sans tétracycline, 1 % P/S et 0,5 g/amphotericine B.
- Ensemencer les cellules dans trois puits de gélatine enduit de six plaques de puits (volume total de chaque puits, 1,5 ml). Culture humidifiée à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h.
- Ajouter 1,5 ml du milieu primaire par jour pendant les 3 prochains jours.
- Le jour 4, remplacer le milieu par 1,5 ml de milieu de croissance complété par un EGF humain recombinant, de l’insuline, hydrocortisone, épinéphrine, T3, transferrine, 15% FBS sans tétracycline, 0,5% L-alanine-L-glutamine, 0,5% d’acides aminés non essentiels, et 2,5 ng/mL fibroblast factor-basic (bFGF), recombinant facteur de croissance dérivée des plaquettes humaines (PDGF), EGF, et 1%/S.
- Changer le milieu de croissance tous les deux jours.
REMARQUE : Les colonies de l’UDC apparaissent en moins d’une semaine. - Lorsque la culture UDC devient confluente de 80 à 90 %, retirez les cellules moyennes et lavées avec PBS, divisez toutes les cellules à l’aide d’un plat de 60 mm recouvert de 0,25 % de trypsine et de graines à 3 000 à 5 000 cellules/cm2 sur un nouveau plat de 60 mm recouvert de gélatine (1 passage).
REMARQUE : Les DUD peuvent être stockés dans de l’azote liquide. Les PDPR sont généralement divisés à 60 à 70 % de confluence dans un plat de culture de 60 mm en trois tubes de stock.
2. Construction rétrovirale
- Amplifier la région de codage de MYOD1 (NM_002478.4) plasmide par réaction en chaîne de polymérase (PCR).
REMARQUE : Le mélange pour l’amplification et les conditions de MYOD1 pour le cycleur thermique sont indiqués dans le tableau 1 et le tableau 2,respectivement. - Détecter une seule bande d’environ 1 000 bp de taille par 0,7% d’électrophoresis gel agarose à l’aide de 1 'L du produit amplifié DE PCR pour confirmer que la séquence MYOD1 est amplifiée avec succès.
- Nettoyez le produit PCR à l’aide du kit de nettoyage et déterminez sa concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Incuber le mélange tel que indiqué dans le tableau 3 à 37 oC pendant la nuit pour digérer le vecteur rétroviral avec un système Tet-on et un gène résistant à la puromycine dans les régions de restriction enzymatiques dans le site de clonage multiple.
- Détecter une seule bande par 0,7% d’électrophoresis gel agarose à l’aide de 1 l de l’on digéré du produit pour confirmer que le vecteur rétroviral a été digéré avec succès.
- Nettoyez le produit digéré à l’aide d’un kit de nettoyage et déterminez sa concentration par spectrophotomètre.
- Pour cloner le fragment MYOD1 amplifié (produit par étapes 2,1 à 2,3) dans le vecteur rétroviral digéré (produit par étapes 2,4 à 2,6), effectuer une réaction de clonage en fusion. Configurez la réaction comme indiqué dans le tableau 4,incuber la réaction pendant 15 min à 50 oC, puis placez-les sur la glace.
- Effectuer la transformation à l’aide de cellules compétentes E. coli selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
- Sélectionnez les cellules compétentes transformées en se culturant sur une plaque de culture LB composée de 10 g/L bacto tryptone, 5 g/L d’extrait de levure bacto, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar et 50 mg/L ampicilline.
- Ramassez la colonie et la culture sélectionnées dans la culture LB moyen sans bacto agar à 200 tr/min à 37 oC du jour au lendemain.
- Purifier les vecteurs rétroviraux insérés par MYOD1à l’aide d’un kit de purification plasmide(tableau des matériaux)et quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Confirmez que MYOD1 est correctement inséré dans le vecteur rétroviral par séquençage direct du produit PCR amplifié par les amorces avant et inversées ciblées respectivement des deux côtés à travers la séquence MYOD1 insérée.
REMARQUE : La séquence MYOD1 peut être détectée en sandwich entre les séquences de vecteurs rétroviraux lorsque le clonage en fusion est réussi. - Pour la production rétrovirale, ensemencez les cellules d’emballage à 50 000 cellules/cm2 sur les plaques et la culture enduites de collagène de 10 cm dans le DMEM, avec 10 % de FBS humidifié à 37 oC et 5 % de CO2 pour 24 h.
- Lorsque les cellules d’emballage prolifèrent à 80 % de confluence, mélangez 30 g de vecteurs rétroviraux insérés MYOD1,30 g de vecteurs d’emballage et réagent transfection contenant du peptide(tableau des matériaux)par le vortexing et incuber pendant 10 min.
- Ajouter le mélange incubé au milieu des cellules d’emballage et de la culture humidifiée à 37 oC et 5% de CO2.
REMARQUE : Un revêtement de collagène est nécessaire. La transfection peut être meilleure à 24 h ou plus après l’ensemencement parce que les cellules d’emballage se détachent facilement de la plaque de culture. - Après 4 h ou du jour au lendemain, changez le milieu à la croissance fraîche.
- Recueillir le supernatant viral et remplacer par un milieu frais à 24 et 48 h après la cotransfection et combiner le supernatant.
- Pour concentrer le supernatant viral, mélangez-le avec le réactif du concentrateur et incuber à 37 oC pendant la nuit, puis centrifugeuse à 1 500 x g pendant 45 minutes à 4 oC.
- Filtrer le rétrovirus supernatant à travers un filtre PVDF avec des pores de 0,45 m.
- Vérifiez le titer du vecteur rétroviral à l’aide d’un kit PCR quantitatif et d’un système de cycle thermique selon les instructions du fabricant.
- Divisez le supernatant viral en petits aliquots et stockez-les à -80 oC.
3. Infection par MYOD1-vecteur rétroviral dans les DUD
- Ensemencer les PDH à 3 000 à 5 000 cellules/cm2 sur un plat de 60 mm enduit de gélatine.
- Après 24 h d’ensemencement, infectez le rétrovirus décongelé (étape 2.21) à une multiplicité d’infection de 200 en ajoutant du bromure d’héradadiméthrine à une concentration de 8 g/mL.
- Après une incubation de 24 h humidifiée à 37 oC et 5 % de CO2,remplacez le milieu de culture par un milieu de croissance frais contenant 1 g/mL puromycine pour sélectionner les cellules TRANSductées MYOD1. Changez le support tous les deux jours.
REMARQUE : Lors de la sélection pour les cellules MYOD1-positives,la puromycine de 1 g/mL est habituellement utilisée pour la sélection. La dose appropriée doit être déterminée. Utilisez une plaque contenant des cellules non infectées et choisissez la dose qui tue toutes les cellules en 3 à 5 jours. Les cellules MYOD1-positives doivent être sélectionnées dans les 7 à 10 jours suivant l’ajout de puromycine. Les DUD MYOD1-transduitspeuvent être stockés dans de l’azote liquide.
4. Différenciation myogénique des PDR MYOD1-transduiretraités avec 3-deazaneplanocin A hydrochlorure (DZNep)
REMARQUE: Récemment, il a été rapporté que DZNep, un inhibiteur de l’histone méthyltransferase, pourrait promouvoir de manière significative l’expression de MYOGENIN, l’un des facteurs régulateurs musculaires tardifs, et aussi conduire à la différenciation myotube7.
- Plaque MYOD1-UDCs transduits dans les puits enduits de collagène à une densité de 3,5 x 104 cellules/cm2. Culture humidifiée à 37 oC et 5% de CO2.
- Après 24 h, changez le milieu de croissance au milieu de différenciation composé de DMEM de glucose élevé avec L-alanine-L-glutamine, 5% de sérum de cheval, supplément DE ITS, doxycycline de 1 g/mL, et de DZNep de 5 M.
REMARQUE : La solution DZNep de 10 mM peut être stockée à -80 oC pendant 3 mois. Utilisez un congélateur de dégivrage et évitez les cycles répétés de gel-dégel. MYOD1 activé par la doxycycline et DZNep supprimer la prolifération et de promouvoir la différenciation myogénique des DUDC. Par conséquent, il est recommandé que la doxycycline et DZNep soient ajoutés après l’induction de la différenciation myogénique. DZNep favorise la différenciation myogénique des MYOD1-UDCsd’une manière dépendante de la dose. D’autre part, il montre la cytotoxicité à une forte concentration. Par conséquent, déterminer la concentration appropriée de DZNep, allant de 1 à 10 M en fonction de ses effets sur la différenciation myogénique et la biodisponibilité cellulaire. - Après 3 jours, changer le milieu de différenciation à un milieu de différenciation frais sans DZNep. Ensuite, changez le support tous les 3 jours.
REMARQUE : Les PDA fusionnent les uns aux autres et forment des myotubes dans les 1 à 2 semaines suivant la différenciation.
5. Exon sauter dans MYOD1-convertiUDCs
REMARQUE : Ici, trois protocoles sont décrits pour évaluer le saut d’exon dans les cellules patient-dérivées : 1) la réaction inverse de la chaîne de polymérase de transcriptase (RT-PCR) de l’ARNm de dystrophine ; 2) semiquantification du signal restauré de protéine de dystrophine par la tache occidentale ; et 3) semiquantification du signal restauré de fluorescence de dystrophine par immunocytochemistry. Toutes les méthodes peuvent détecter le saut exon d’une manière dose-dépendante.
- Évaluation de l’efficacité de saut d’exon par RT-PCR
- Pour transfecter l’oligoucléotide antisens (ASO) en UDCs convertis MYOD1obtenus auprès de patients DMD le jour 7 après la différenciation, mélanger ASO, réactif transfection(Tableau des matériaux), et le milieu de différenciation à une concentration finale de 1 à 10 M. Culture humidifiée à 37 oC et 5% CO2.
- Après 72 h d’incubation avec ASO, changez le milieu au milieu de différenciation frais sans ASO.
- De 3 à 7 jours après la transfection ASO, retirez le support de différenciation et lavez 1x avec PBS. Ajouter le tampon de lyse cellulaire, lyser les DUD et récolter l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.
- Mesurer la concentration d’ARN à l’égard d’un spectrophotomètre.
- Combinez les réactifs requis pour une réaction RT-PCR en une seule étape dans les tubes PCR selon le tableau 5.
- Placer les tubes PCR avec le mélange dans un thermocycler. Exécutez le thermocycler, selon le tableau 6.
- Effectuez l’électrophoresis de micropuce et calculez l’efficacité de saut d’exon utilisant la concentration de molaire comme ci-dessous.
Exon rater l’efficacité (%) - bande sautée / (bande sautée - bande non-sautée) x 100
REMARQUE : Conservez le produit PCR dans un réfrigérateur à 4 oC pour un stockage à court terme ou à -20 oC pour un stockage à long terme.
- Détection de la dystrophine après saut d’exon par le ballonnement occidental
- Transfect ASO et culture MYOD1-UDCs selon les étapes 5.1.1 et 5.1.2.
- Changez le support tous les 3 jours.
- Après 2 semaines de différenciation, extraire la protéine totale des cellules cultivées à l’aide de l’essai d’essai radioimmunoprecipitation (RIPA) tampon contenant des inhibiteurs de la protéase.
- Sonicate les lysates sur glace et centrifugeuse à 14.000 x g pendant 15 min à 4 oC.
- Recueillir le supernatant et déterminer les concentrations de protéines à l’aide d’un kit d’analyse de protéines BCA.
- Ajouter 15 g de protéines totales dans un tube de 0,5 mL et diluer en ajoutant le tampon RIPA contenant des inhibiteurs de la protéase à un volume total de 10 lL. Exécuter 15 g de protéines totales par voie.
- Ajouter l’échantillon tampon, l’agent de réduction, et l’eau déionisée comme indiqué dans le tableau 7. Denature la cellule lysates à 70 oC pendant 10 min.
- Préparer le tampon en cours d’exécution de tris-acétate contenant 8,95 g/L tricine, 6,06 g/L tris base, 1,0 g/L de sulfate de dodécaline de sodium (SDS).
- Chargez l’échantillon (20 lL) sur le gel tris-acétate de 3 à 8 % et effectuez l’électrophoresis à 150 V pendant 75 min.
- Préparer le tampon de ballonnement sans méthanol.
- Faire tremper la membrane PVDF pendant 20 s dans le méthanol, puis dans le tampon de ballonnement jusqu’à l’utilisation (au moins 10 min). Couper la membrane PVDF à une taille de 6 x 8 cm à l’aide de mini gels et de 8 x 12 cm à l’aide de gels midi.
- Couper les papiers buvards de la même taille que celui de la membrane PVDF et les faire tremper dans le tampon de ballonnement jusqu’à l’utilisation.
- Après l’électrophorèse, couper le gel à la même taille que celle de la membrane PVDF et tremper le gel dans de l’eau distillée.
- Placez les papiers buvards, la membrane PVDF et le gel sur l’appareil de transfert semi-remorque(figure 1). Transférer à 4 mA/cm2 pendant 30 min.
- Rincer la membrane 2x avec de l’eau distillée.
- Préparer l’anticorps anti-dystrophine (1:500) et l’anticorps anti-tubulin (1:1 200) comme anticorps primaires.
- Préparer l’anticorps anti-souris HRP-conjugué (1:100) comme anticorps secondaire.
- Incuber les membranes avec les anticorps primaires, laver avec tampon de lavage, puis incuber avec l’anticorps secondaire à l’aide d’un dispositif automatisé de traitement del’Ouest( tableau des matériaux ) à température ambiante.
REMARQUE : L’anticorps anti-tubulin est habituellement utilisé comme contrôle de chargement. Les solutions mixtes d’anticorps primaires, y compris 1:500 anti-dystrophine et 1:1,200 anticorps anti-tubulin fonctionnent bien lorsque la réaction des anticorps est effectuée simultanément. - Rincer la membrane dans de l’eau distillée.
- Détectez les protéines à l’aide d’un réactif de détection chemiluminescent et d’un imageur à base d’appareil couplé à la charge (CCD).
- Analyser les données à l’aide d’un logiciel approprié.
- Détection de la dystrophine après saut d’exon par immunocytochemistry
- Reprogrammez directement les DUD dans les myotubes dans la plaque de puits 96 recouverte de collagène selon les étapes 4.1-4.3.
- Transfect l’ASO et la culture MYOD1-UDCs selon les étapes 5.1.2 et 5.1.3.
- Après 2 semaines de différenciation, laver les cellules avec PBS et les fixer dans 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min à 4 oC.
- Permeabilize MYOD1-UDCs dans 0,1% de détergent non ionique pendant 10 minutes à température ambiante et bloquer ceux avec 10% de sérum de chèvre pendant 15 min à 37 oC.
- Incuber les cellules avec un anticorps primaire pendant la nuit à 4 oC.
- Laver les cellules avec PBS et incuber ceux avec l’anticorps secondaire pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE : Ici, l’anti-dystrophine de souris (1:30) est utilisé comme anticorps primaire, l’anti-souris IgG est utilisé comme anticorps secondaire, et Hoechst (1:10,000) est employé pour la coloration des noyaux. - Imagez les plaques à l’aide d’un microscope fluorescent et utilisez un analyseur pour semiquantifier automatiquement le signal de fluorescence dans tous les puits dans la même condition.
Representative Results
Nous pourrions recueillir les PDJ facilement et non-invasivement. Les PDJ ont formé des colonies dans la semaine qui a suivi le début de la culture cellulaire primaire, nous avons observé une capacité de prolifération marquée. La culture des DUD était simple, et la contamination bactérienne ou fongique était rare lorsque la procédure a été effectuée correctement.
La figure 2 montre des images représentatives de la colonie de l’UDC une semaine après la culture primaire(figure 2A) et MYOD1-UDCs une semaine après la différenciation(figure 2B). La figure 3 montre la détection réussie du saut d’exon dans les DUDC obtenues des patients DMD par RT-PCR. La figure 3A montre l’analyse RT-PCR de la dystrophine après traitement antisense oligonucléotide dans le MYOD1-UDCs traitépar DZNep dérivé d’un mâle de 6 ans avec une suppression exon 45-54 dans le gène DMD. Le cadre de lecture ouverte a été restauré par exon 44 sauter. Le jour 14 suivant la différenciation, nous avons confirmé l’induction de l’exon en sautant d’une manière dose-dépendante (figure 3B). Les bandes supérieures dénotent les produits indigènes, et les bandes inférieures dénotent exon 44 produits sautés qui ont restauré le cadre de lecture ouverte.
La figure 4 montre la détection réussie de la dystrophine après saut d’exon dans les DUDCs obtenues des patients de DMD par l’occidental buvage d’une manière dose-dépendante. Nous avons également détecté l’expression de dystrophine restaurée à l’aide de l’immunocytochemistry(figure 5). Nous avons mesuré les intensités de la dystrophine avec un microscope fluorescent 1 semaine après la transfection antisense oligonucleotide (ASO) sur une plaque de puits 96(figure 5A). Des signaux fluorescents nettement plus élevés ont été observés dans MYOD1-UDCs traités avec ASO que dans MYOD1-UDCs traités avec un ASO de contrôle (figure 5B).
Ces résultats suggèrent que notre nouvel essai peut évaluer le saut d’exon efficacement dans MYOD1-UDCsobtenus des patients DMD au niveau de l’ARNm et de la protéine.
Figure 1 : Représentation schématique de la pile de transfert pour la tache occidentale semi-humide. Deux papiers imbibés dans le tampon de ballonnement ont été déposés au terminal négatif, et deux papiers imbibés dans le tampon ont été empilés sur ce. Le gel, qui a été trempé dans le tampon, a été posé doucement sur la membrane PVDF. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives des PDJ. ( A )Imagede contraste de phase des DPC une semaine après la culture primaire. Barre d’échelle de 200 m. Inset : Une image agrandie de la zone dans le rectangle blanc. (B) Image de contraste de phase de MYOD1-UDCs une semaine après la différenciation. Barre d’échelle à 50 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Takizawa et al.7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Évaluation réussie du saut d’exon dans les cellules d’urine-dérivées (UDCs) obtenues des patients de DMD par RT-PCR. (A) ANALYSE RT-PCR de la dystrophine après traitement antisense oligonucleotide dans 3-deazaneplanocin Un hydrochlorure (DZNep)-traité MYOD1-UDCs dérivés de du patient de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) patient avec une suppression exon 45-54. MYOD1-UDCstraités par DZNep ont également été traités avec l’antiense de contrôle à la concentration de 1-10 M en tant que contrôles. Les bandes supérieures étaient des produits non skiés (Ex 45-54 suppression) qui sont restés hors du cadre de lecture. Les bandes inférieures étaient les produits exon 44-skipped (Ex 44-54 suppression et Ex 44 sauté) qui a restauré le cadre de lecture ouverte. (B) L’efficacité de saut a été calculée comme (exon 44-skipped transcript molarity)/(native - exon 44-skipped transcript molarity [marqué avec des flèches]) x 100% à l’aide d’un système d’électrophorèse micropuce. L’ANOVA à sens unique suivi du test post hoc de Bonferroni a été utilisé pour comparer les gains d’efficacité des sauts (n 3 pour chaque groupe, 0,0001). Les données sont exprimées comme la moyenne et le SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de Takizawa et al.7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Évaluation réussie du saut d’exon dans les cellules d’urine-dérivées (UDCs) des patients de DMD par la tache occidentale. (A) Tache occidentale représentative pour la dystrophine dans le MYOD1-UDCs traitépar DZNep du patient de DMD avec une suppression exon 45-54 après exon 44 saut. Pour la détection de dystrophine, l’anti-dystrophine (contre C-terminal) a été employé. (B) Les intensités relatives des bandes normalisées à l’expression de la tubuline ont été comparées dans les cellules dérivées du patient avec et sans traitement antisense oligoucléotide en effectuant un ANOVA à sens unique suivi du test post hoc de Bonferroni (n - 3 pour chaque groupe, 'P 'lt; 0,01, 'P 'lt; 0.001, HI individuel). Ce chiffre a été modifié à partir de Takizawa et al.7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Heatmaps of immunocytochemistry for dystrophin after antisense oligonucleotide treatment in DZNep-treated MYOD1-UDCs obtained from DMD patient with exon 45-54 deletion. (A) Suppression de l’exon 45-54 restauré le cadre de lecture ouverte basé sur le saut exon de l’exon 44. (B) L’intensité du signal a été quantifiée à l’aide d’un microscope fluorescent après 1 semaine de transfection antisense oligoucléotide sur une plaque de puits 96. ANOVA à sens unique suivi du test post hoc de Bonferroni a été utilisé pour la comparaison (n 3-4 pour chaque groupe, 'P 'lt; 0.0001). Ce chiffre a été modifié à partir de Takizawa et al.7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réactif | Volume | Concentration finale |
| 2x prémélange PCR | 12,5 l | 1x |
| Apprêt avant | 17h00 | 0,2 M |
| Apprêt inversé | 17h00 | 0,2 M |
| Modèle | 80 ng | |
| Eau distillée stérilisée | jusqu’à 25 l | |
| Volume total par réaction | 25 ll |
Tableau 1 : Mélange pour l’amplification MYOD1 par RT-PCR.
| 98 oC | 10 s | |
| 55 oC | 10 s | 35 cycles |
| 72 oC | 10 s |
Tableau 2 : Conditions pour le cycle thermique pour l’amplification MYOD1.
| Réactif | Volume |
| Tampon 10x K | 2 l |
| Vecteur rétroviral (500 ng/L) | 2 l |
| Enzyme de restriction 1 (2-15 U) | 1 l |
| Enzyme de restriction 2 (2-15 U) | 1 l |
| Eau distillée stérilisée | 14 l |
| Volume total | 20 l |
Tableau 3 : Mélange pour un tube pour digérer le vecteur rétroviral.
| Réactif | Volume |
| Fragment MYOD1 purifié | 100 ng |
| Vecteur rétroviral digéré | 100 ng |
| 5x Enzyme prémélange | 4 ll |
| Eau distillée stérilisée | jusqu’à 20 l |
| Volume total | 20 l |
Tableau 4 : Mélange pour la réaction de clonage en fusion.
| Solution | Volume/Réaction (L) | Concentration finale |
| Eau sans RNase | Variable | - |
| Tampon RT-PCR en une seule étape | 4 | 1x |
| mélange dNTP (contenant 10 mM de chaque dNTP) | 0.8 | 400 mM de chaque dNTP |
| Apprêt avant (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Apprêt inversé (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Mélange d’enzymes RT-PCR en une seule étape | 0.8 | - |
| Inhibiteur de RNase (facultatif) | Variable | 5 à 10 unités/réaction |
| Modèle ARN | 50 à 400 ng | |
| Volume total | 20 |
Tableau 5 : Composés nécessaires pour une réaction du RT-PCR en une seule étape.
| 1 cycle | Transcription inversée | 30 min | 50 oC |
| 1 cycle | Étape initiale d’activation PCR | 15 min | 95 oC |
| 1 cycle | Dénaturation | 1 min | 94 oC |
| Recuit | 1 min | 60 oC | |
| Extension | 1 min | 72 oC | |
| 1 cycle | Extension finale | 7 min | 72 oC |
| Tenir | ∞ | 4 oC |
Tableau 6 : État de cycle thermique pour le RT-PCR en une seule étape.
| Réactif | Volume |
| Protéines (15 g) | 10 l |
| Mémoire tampon d’échantillon (4x) | 5 ll |
| Agent de réduction (10x) | 2 l |
| Désionisée | 3 l |
| Volume total | 20 l |
Tableau 7 : Préparation d’échantillons pour l’électrophoresis du gel en polyacrylamide de sulfate de dodéthyle de sodium (SDS-PAGE).
Discussion
Ici, nous décrivons un protocole détaillé de saut d’exon dans les DUDS myOD1-convertisobtenus des patients de DMD. À l’aide du système d’analyse, nous avons examiné efficacement les séquences optimales d’antisense. Nous supposons que les DUD convertis MYOD1peuvent être utiles pour l’étude de la pathophysiologie de la maladie.
L’évaluation du saut exon utilisant des cellules d’origine patiente au niveau de l’ARNm est indispensable pour le dépistage de nouveaux médicaments et évaluer l’admissibilité des patients avant d’entreprendre des essais cliniques. Le calcul de l’efficacité de saut d’exon ne peut être évalué qu’à un niveau d’ARNm.
L’évaluation du saut d’exon au niveau de protéine est également importante parce que la restauration de dystrophine est importante en tant que biomarqueur de substitution pour prévoir les avantages du saut d’exon. À ce jour, le criblage des séquences d’oligonucléotide d’antisense est souvent exécuté utilisant des lignes primaires de cellules de muscle ou des lignes immortalisées de cellules de myoblaste comprenant des cellules humaines de rhabdomyosarcome (RD), mais nous ne pouvons pas mesurer le rétablissement des niveaux de dystrophine utilisant des lignes de cellules de muscle ou des lignes de cellules de RD parce qu’elles expriment cette protéine endogènement. Nous pouvons clairement détecter la restauration de la dystrophine dans le MYOD1-UDCs DMDdérivé du patient DMD d’une manière dose-dépendante. Dans notre nouvel essai, nous considérons que l’évaluation des protéines restaurées par le ballonnement occidental est supérieure en quantifiabilité. D’autre part, l’évaluation par immunocytochemistry en utilisant 96 plaques de puits est idéale pour le dépistage simultané de nombreux composés candidats.
Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour un muscle DMD de modélisation efficace utilisant myOD1-convertiUDCs avec RT-PCR, ballonnement occidental, et immunocytochemistry pour évaluer la dystrophine restaurée aux niveaux d’ARNm et de protéine après saut d’exon. Les DUD peuvent être collectés de manière non invasive et facile. Par conséquent, nous supposons que le tout nouvel essai in vitro peut être appliqué à un large éventail d’études de base et translationnelles quel que soit le type de troubles musculaires.
Disclosures
Le National Center of Neurology and Psychiatry développe actuellement NS-065/NCNP-01, un médicament à sauter exon 53 pour DMD, avec Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [subvention no 18K07544 à Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [subvention no 28-6 à Y.A.], et l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux [subvention nos. 18ek0109239h002, 18lm020306h0001, et 18lm0203060001, et 18lm0203069h001 à Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
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