Summary
في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من العضلات ضمور العضلات دوشين باستخدام MYOD1-تحويلالخلايا المشتقة من البول لتقييم استعادة mRNA dystrophin ومستويات البروتين بعد تخطي exon.
Abstract
يحدث ضمور العضلات دوشين (DMD)، وهو مرض العضلات التدريجي والقاتل، بسبب الطفرات في جين DMD التي تؤدي إلى عدم وجود بروتين dystrophin. حتى الآن، أكملنا دراسة أول في الإنسان بدأها المحقق في المركز الوطني لطب الأعصاب والطب النفسي على أساس الحقن الجهازي للأوليغونوكليوتيدات مورفولينو التي هي عرضة لتخطي exon-53. من أجل العلاج الفعال DMD ، في الاختبار المختبري مع myoblasts المشتقة من مرضى DMD لفحص الأدوية وتقييم أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية ويعتقد أن تكون ضرورية. في الآونة الأخيرة، أبلغنا عن خلية جديدة مشتقة من البول من طراز MYOD1تم تحويلها (UDC) عولجت بمثبط ميثيل ترانسياز الهستون (3-deazaneplanocin A hydrochloride)، كنموذج خلوي لـ DMD. قد يظهر UDC autologous الجديد تنظيرًا للأنماط الظاهرية الخاصة بالأمراض في DMD ، مما يؤدي إلى تطبيق الطب الدقيق في مجموعة متنوعة من الأمراض المتعلقة بالعضلات. في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من خلايا العضلات DMD باستخدام MYOD1-تحويلUDCs جنبا إلى جنب مع عكس transcriptase البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-PCR)، النشاف الغربي، والمناعيالكيمياء لتقييم استعادة mRNA dystrophin ومستويات البروتين بعد تخطي إكسون.
Introduction
يحدث ضمور العضلات دوشين (DMD), وهو مرض العضلات التدريجي, قاتلة, بسبب الطفرات الإطار التحول في الجين DMD التي تؤدي إلى عدم وجود بروتين dystrophin1. Antisense oligonucleotide القائم على exon تخطي العلاج ويعتقد أن تكون واعدة لDMD. ويستند هذا العلاج على تحويل النمط الظاهري DMD أكثر شدة إلى أكثر اعتدالا بيكر ضمور العضلات مثل النمط الظاهري عن طريق تغيير ما قبل mRNA الربط لاستعادة إطار القراءة DMD 2. لقد أكملنا مؤخرًا دراسة أولى في الإنسان تستند إلى الإدارة الوريدية المتكررة لـ phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) viltolarsen ، والتي يمكن أن تحفز exon 53 تخطي في DMD ، وأظهرت ملف أمان ممتاز ، وفعالية واعدة ، ومعلمات3الدوائية المقبولة (مسجلة باسم UMIN: 000010964 ClinicalTrials.gov: NCT02081625)
ومع ذلك ، لتطوير علاجات فعالة من حيث التكلفة وفعالة للمرض ، في المختبر باستخدام خلايا العضلات الأولية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD ضرورية لفحص الدواء والتحقق من أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية ، وكذلك المؤشرات الحيوية التي تعكس فعالية العلاجات تخطي الطاردة البرية خلال التجارب البشرية4. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن تقنية جديدة لتطوير خلايا MYOD1- محولة للبول (UDCs)5،6 كنموذج أولي للـ DMD7. وهكذا ، لتوليد myoblasts ، مطلوب فقط جمع البول من المرضى وليس هناك حاجة إلى إجراء الغازية. في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من العضلات DMD باستخدام MYOD1-تحويلUDCs تعامل مع 3-deazaneplanocin هيدروكلوريد لتقييم mRNA dystrophin المستعادة والبروتين بعد تخطي exon.
Protocol
وافقت لجنة الأخلاقيات بالمركز الوطني لطب الأعصاب والطب النفسي على هذه الدراسة (معرف الموافقة: A2017-018، A2018-029). وأعطى جميع الأفراد الموافقة المستنيرة قبل تقديم البول. وأجريت جميع التجارب في إطار المبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
1- عزلة البلدان النامية وثقافةها الأساسية
ملاحظة: تم عزل UDCs وفقًا لبروتوكول تم نشره مسبقًا8،9،10 مع بعض التعديلات.
- جمع عينات البول أثناء التكتوريات التلقائية في زجاجات بلاستيكية معقمة.
ملاحظة: لا حاجة إلى تعقيم فتحة مجرى البول الخارجية. البول في منتصف المجرى هو مرغوب فيه للحد من خطر التلوث الفيروسي. إذا كان وقت المخزون قبل الإجراء التالي هو > 1 ساعة ، يجب نقل عينات البول إلى 4 درجة مئوية للحفاظ على صلاحية الخلية. ومع ذلك، يجب تجنب درجة حرارة < 4 درجة مئوية لأن الرواسب غير القابلة للذوبان قد تظهر. - طرد عينة البول بالكامل عند 400 × غرام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق supernatant ، وترك 1 مل في الأنبوب.
- إعادة تعليق الكريات بشكل فردي في 1 مل المتبقية من البول ومن ثم جمع تلك في أنبوب 50 مل واحد.
- إضافة 10 مل من الغسيل المخزن المؤقت تتكون من 99 مل من PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم، 1٪ البنسلين / العقديات (P / S)، 0.5 ميكروغرام / مل amphotericin B، والطرد المركزي العينات في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق supernatant ، وترك 0.2 مل في الأنبوب.
- إعادة تعليق الكريات الخلية في 4.5 مل من المتوسط الأساسي تتكون من خليط 1:1 من جلوكوز عالية جلول جلوكوز المعدلة جلجل المتوسطة (DMEM) دون بيروفات الصوديوم ومزيج لحم الخنزير F-12 الغذائية المكملة مع عامل نمو البشرة البشرية المؤتلفة (EGF), الأنسولين, الهيدروكورتيزون، الإبينفرين، T3، المنقول، 10٪ خالية من التتراسيكلين مصل البقر الجنين (FBS)، 1٪ P/S، و 0.5 ميكروغرام/مل أمبوشوتيريسين B.
- البذور الخلايا في ثلاثة آبار من ستة لوحات بئر المغلفة الجيلاتين (الحجم الإجمالي لكل بئر، 1.5 مل). الترطيب الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- أضف 1.5 مل من المتوسط الأساسي يوميًا لمدة 3 أيام قادمة.
- في اليوم 4، استبدال المتوسطة مع 1.5 مل من النمو المتوسطة تكملها EGF الإنسان المؤتلف، الأنسولين, الهيدروكورتيزون, ادرينالين, T3, المنقولين, 15% خالية من التتراسيكلين FBS, 0.5% L-ألانين-L-الجلوتامين, 0.5% الأحماض الأمينية غير الضرورية, و 2.5 نانوغرام/ مل نمو الخلايا الليفية عامل أساسي (bFGF), المؤتلف عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية البشرية (PDGF), EGF, و 1% P/S.
- تغيير متوسط النمو كل يومين.
ملاحظة: تظهر مستعمرات UDC في غضون أسبوع. - عندما تصبح ثقافة UDC 80-90٪ متجانسة، وإزالة الخلايا المتوسطة وغسل مع برنامج تلفزيوني، وتقسيم جميع الخلايا باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA والبذور في 3،000-5،000 خلايا /سم2 على طبق جديد الجيلاتين المغلفة 60 ملم (الممر 1).
ملاحظة: يمكن تخزين UDCs في النيتروجين السائل. وعادة ما تقسم البلدان النامية على 60-70٪ التقاء في طبق ثقافة 60 ملم في ثلاثة أنابيب الأسهم.
2- بناء الرجعية
- تضخيم منطقة الترميز من MYOD1 (NM_002478.4) البلازميد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
ملاحظة: يتم عرض خليط لتضخيم MYOD1 وشروط الدراجات الحرارية في الجدول 1 والجدول 2، على التوالي. - الكشف عن نطاق واحد من حوالي 1000 حجم bp بنسبة 0.7٪ agarose هلام electrophoresis باستخدام 1 μL من منتج PCR تضخيم للتأكد من أن يتم تضخيم تسلسل MYOD1 بنجاح.
- قم بتنظيف منتج PCR باستخدام مجموعة التنظيف وحدد تركيزه باستخدام مقياس مطياف.
- احتضان الخليط كما هو مبين في الجدول 3 عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهضم ناقل الفيروس الرجعي مع نظام تيت على وجين مقاومة البوثمين في المناطق المستهدفة إنزيم تقييد في موقع الاستنساخ متعددة.
- اكتشف نطاقًا واحدًا بنسبة 0.7٪ من الجيل الأجاروز باستخدام 1 ميكرولتر من المنتج المهضوم للتأكد من أن متجه الفيروس الرجعي تم هضمه بنجاح.
- تنظيف المنتج المهضوم باستخدام مجموعة التنظيف وتحديد تركيزه عن طريق الطيف.
- واستنساخ شظية MYOD1 المضخمة (الناتجة عن الخطوات 2.1-2.3) في الناقل الرجعي المهضوم (الناتج عن الخطوات 2.4−2.6)، قم بإجراء تفاعل استنساخ داخل الانصهار. إعداد رد الفعل كما هو مبين في الجدول 4، واحتضان رد الفعل لمدة 15 دقيقة في 50 درجة مئوية ، ومن ثم وضع ها على الجليد.
- إجراء التحويل باستخدام الخلايا المختصة E. coli وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(جدول المواد).
- حدد الخلايا المختصة المحولة عن طريق زراعة على لوحة الثقافة LB تتكون من 10 غرام / لتر bacto التربتون، 5 ز / لتر استخراج الخميرة bacto، 5 ز / لتر NaCl، 15 ز / لتر bacto أجار، و 50 ملغ / لتر أمبيسيلين.
- التقط المستعمرة والثقافة المختارة في LB الثقافة المتوسطة دون bacto agar في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تنقية ناقلات MYOD1- إدراج الرجعية باستخدام طقم تنقية البلازميد(جدول المواد)وقياس باستخدام مطياف.
- تأكد من أن MYOD1 يتم إدراجها بشكل صحيح في ناقل الفيروس الرجعي عن طريق التسلسل المباشر لمنتج PCR الذي يتم تضخيمه بواسطة الالتمهيديات الأمامية والعكسية المستهدفة على التوالي على كلا الجانبين عبر تسلسل MYOD1 المدرج.
ملاحظة: يمكن الكشف عن تسلسل MYOD1 تقع بين تسلسل ناقلات الفيروسية الرجعية عندما الاستنساخ في الانصهار ناجحة. - لإنتاج الفيروسات الرجعية، بذور خلايا التعبئة والتغليف في 50،000 خلايا / سم2 على لوحات مغلفة بالكولاجين 10 سم والثقافة في DMEM مع 10٪ FBS رطوبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- عندما تتكاثر خلايا التعبئة والتغليف إلى 80٪ التقاء، مزيج 30 ميكروغرام من ناقلات فيروس الرجعية MYOD1-إدراج،30 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف، وكاشف الحلويات التي تحتوي على الببتيد اختراقالخلايا (جدول المواد)عن طريق الدوامة، واحتضانها لمدة 10 دقيقة.
- إضافة الخليط المحتضن إلى وسط خلايا التعبئة والتغليف والثقافة المبللة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: طلاء الكولاجين ضروري. قد يكون التقّاح أفضل في 24 ساعة أو أكثر بعد البذر لأن خلايا التعبئة والتغليف تنفصل بسهولة عن لوحة الثقافة. - بعد 4 ساعات أو بين عشية وضحاها، تغيير المتوسطة إلى جديدة المتوسطة النمو.
- جمع supernatant الفيروسية واستبدال مع المتوسطة الطازجة في 24 و 48 ساعة بعد cotransfection والجمع بين supernatant.
- لتركيز supernatant الفيروسية، ومزجها مع كاشف المكثف واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تصفية supernatant الفيروس الرجعي من خلال مرشح PVDF مع مسام 0.45 ميكرون.
- تحقق من titer من ناقلات الرجعية باستخدام مجموعة PCR الكمية ونظام cycler الحرارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تقسيم supernatant الفيروسية إلى aliquots الصغيرة والأسهم لهم في -80 درجة مئوية.
3. العدوى مع MYOD1- ناقلات الفيروسية في UDCs
- البذور UDCs في 3،000-5،000 الخلايا / سم2 على طبق 60 ملم المغلفة الجيلاتين.
- بعد 24 ساعة من البذر، تصيب الفيروس الرجعي ذاب (الخطوة 2.21) في تعدد العدوى من 200 عن طريق إضافة بروميد سداسي ديميثرين بتركيز 8 ميكروغرام/مل.
- بعد 24 ساعة من الترطيب في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،استبدال المتوسطة الثقافة مع المتوسطة النمو الطازجة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل puromycin لتحديد الخلايا المُسْحثة MYOD1. تغيير المتوسطة كل يومين.
ملاحظة: عند تحديد لخلايا MYOD1-إيجابية،يتم استخدام 1 ميكروغرام/مل puromycin عادة للاختيار. وينبغي تحديد الجرعة المناسبة. استخدم لوحة تحتوي على خلايا غير مصابة واختر الجرعة التي تقتل جميع الخلايا في 3-5 أيام. MYOD1- ينبغي اختيار الخلايا الإيجابية في غضون 7-10 أيام بعد إضافة puromycin. يمكن تخزين الـ MYOD1-UDCsالمستحثة في النيتروجين السائل.
4- التمايز الميوجيني لـ MYOD1- UDCs المستحثة المعالجة بـ 3-deazaneplanocin A هيدروكلوريد (DZNep)
ملاحظة: في الآونة الأخيرة، وقد أفيد أن DZNep، وهو مثبط الميثيل ترانسهاشين، يمكن أن تعزز بشكل كبير التعبير عن MYOGENIN،واحدة من العوامل التنظيمية العضلات في وقت متأخر، ويؤدي أيضا إلى التمايز myotube7.
- لوحة MYOD1-UDCs المستحثة في الآبار المغلفة بالكولاجين بكثافة 3.5 × 104 خلايا /سم2. الترطيب الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة, تغيير المتوسطة النمو إلى التمايز المتوسطة تتألف من ارتفاع الجلوكوز DMEM مع L-ألانين-L-الجلوتامين, 5% مصل الحصان, ITS الملحق, 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين, و 5 ميكرون DZNep.
ملاحظة: يمكن تخزين محلول DZNep 10 mM عند -80 درجة مئوية لمدة 3 أشهر. استخدم يتجمد الفريزر وتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. كل من MYOD1 تنشيط هاكدوسسيكلين وDZNep قمع انتشار وتعزيز التمايز myogenic من UDCs. لذلك ، يوصى بإضافة الدوكسيسيكلين وDZNep بعد تحريض التمايز الميوجيني. DZNep يعزز التمايز myogenic من MYOD1- UDCs بطريقة تعتمد على الجرعة. من ناحية أخرى ، فإنه يظهر السمية الخلايا في تركيز عال. ولذلك، حدد التركيز المناسب للDZNep، الذي يتراوح بين 1-10 ميكرومتر اعتماداً على آثاره على التمايز الميجيني والتوافر البيولوجي الخلوي. - بعد 3 أيام، تغيير وسيلة التمايز إلى وسيلة التمايز الطازجة دون DZNep. ثم قم بتغيير الوسط كل 3 أيام.
ملاحظة: الصمامات UDCs إلى بعضها البعض وتشكيل أنابيب الأنابيب في غضون 1-2 أسابيع بعد التمايز.
5. Exon تخطي في MYOD1- تحويل UDCs
ملاحظة: هنا، يتم وصف ثلاثة بروتوكولات لتقييم تخطي exon في الخلايا المشتقة من المريض: 1) عكس تفاعل البوليميراز البوليميراز (RT-PCR) من dystrophin mRNA; 2) semiquantification من استعادة إشارة بروتين dystrophin من قبل لطخة الغربية؛ و 3) semiquantification من استعادة إشارة الفلورالنسية الضموري بواسطة الكيمياء المناعية. جميع الطرق يمكن الكشف عن تخطي exon بطريقة تعتمد على الجرعة.
- تقييم كفاءة تخطي exon بواسطة RT-PCR
- لترجمة antisense oligonucleotide (ASO) إلى MYOD1- تحويل UDCs التي تم الحصول عليها من مرضى DMD في اليوم 7 بعد التمايز ، مزيج ASO ، التغوط الغطاس(جدول المواد)، والتمايز المتوسطة إلى تركيز نهائي من 1-10 μM. الثقافة رطوبة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2.
- بعد 72 ساعة من الحضانة مع ASO ، قم بتغيير متوسط التمايز المتوسط إلى الجديد بدون ASO.
- من 3-7 أيام بعد التطفل ASO، إزالة المتوسط التمايز وغسل 1x مع برنامج تلفزيوني. إضافة خلية الزنال المخزن المؤقت، lyse UDCs وحصاد الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع مطياف.
- الجمع بين الكواشف المطلوبة لخطوة واحدة RT-PCR التفاعل في أنابيب PCR وفقا للجدول 5.
- ضع أنابيب PCR مع الخليط في دراجة حرارية. تشغيل thermocycler، وفقا للجدول 6.
- إجراء الكهربية رقاقة وحساب كفاءة تخطي exon باستخدام تركيز المولي على النحو التالي.
Exon تخطي الكفاءة (٪ = تخطي الفرقة / (تخطي الفرقة + غير تخطي الفرقة) × 100
ملاحظة: قم بتخزين منتج PCR في ثلاجة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- الكشف عن dystrophin بعد exon تخطي النشاف الغربي
- الترانزستور ASO والثقافة MYOD1-UDCs وفقا للخطوات 5.1.1 و 5.1.2.
- تغيير المتوسطة كل 3 أيام.
- بعد أسبوعين من التمايز، استخراج البروتين الكلي من الخلايا المستزرعة باستخدام قياس المناعة الإشعاعية (RIPA) العازلة التي تحتوي على مثبطات البروتياز.
- سونيكات الليسات على الجليد والطرد المركزي في 14،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- جمع supernatant وتحديد تركيزات البروتين باستخدام مجموعة تحليل البروتين BCA.
- إضافة 15 ميكروغرام من البروتين الكلي في أنبوب 0.5 مل وتمييع عن طريق إضافة العازلة RIPA التي تحتوي على مثبطات البروتياز إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرون. تشغيل 15 ميكروغرام من إجمالي البروتين لكل حارة.
- إضافة نموذج المخزن المؤقت، والحد من عامل، والمياه اللامؤنة كما هو موضح في الجدول 7. تشويه التحلل الخلية في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إعداد ثلاثيخلات تشغيل المخزن المؤقت التي تحتوي على 8.95 غرام / لتر tricine، 6.06 ز / لتر تريس قاعدة، 1.0 غرام / لتر كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS).
- قم بتحميل العينة (20 ميكرولتر) على الجل ثلاثي خلات 3-8% وقم بالكهرباء عند 150 فولت لمدة 75 دقيقة.
- إعداد المخزن المؤقت النشاف دون الميثانول.
- نقع غشاء PVDF لمدة 20 ق في الميثانول ومن ثم في المخزن المؤقت النشاف حتى الاستخدام (على الأقل 10 دقيقة). قطع غشاء PVDF إلى حجم 6 × 8 سم باستخدام المواد الهلامية المصغرة و 8 × 12 سم باستخدام المواد الهلامية ميدي.
- قطع أوراق النشاف إلى نفس حجم ذلك من غشاء PVDF ونقع تلك الموجودة في المخزن المؤقت النشاف حتى الاستخدام.
- بعد الكهربية، وقطع هلام إلى نفس حجم ذلك من غشاء PVDF ونقع هلام في الماء المقطر.
- ضع أوراق النشاف ، غشاء PVDF ، وهلام على جهاز النقل شبه الجاف(الشكل 1). نقل في 4 mA/ سم2 لمدة 30 دقيقة.
- شطف الغشاء 2x بالماء المقطر.
- إعداد الأجسام المضادة المضادة للdystrophin (1:500) والمضادة α-tubulin (1:1,200) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الأولية.
- إعداد HRP-مترافق ة مضادة للفأرة الأجسام المضادة (1:100) كجسم مضاد ثانوي.
- احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل مع العازلة غسل، ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية باستخدام جهاز المعالجة الغربية الآلي(جدول المواد)في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: عادة ما يستخدم الأجسام المضادة المضادة لـ α-tubulin كتحكم في التحميل. تعمل حلول الأجسام المضادة الأولية المختلطة ، بما في ذلك 1:500 مضاد للdystrophin و 1:1200 الأجسام المضادة المضادة لα-tubulin بشكل جيد عندما يتم تنفيذ رد فعل الأجسام المضادة في وقت واحد. - شطف الغشاء في الماء المقطر.
- اكتشف البروتينات باستخدام كاشف الكشف عن الكاشف اتّصال اتّصال جهاز مُشّاّهب من الأدوات الموجهة إلى الكاميرا.
- تحليل البيانات باستخدام البرامج المناسبة.
- الكشف عن dystrophin بعد تخطي exon عن طريق الكيمياء المناعية
- إعادة برمجة UDCs مباشرة في الأنابيب الليفية في لوحة بئر 96 المغلفة بالكولاجين وفقًا للخطوات 4.1−4.3.
- تحويل ASO والثقافة MYOD1-UDCs وفقا للخطوات 5.1.2 و 5.1.3.
- بعد أسبوعين من التمايز، اغسل الخلايا بـ PBS وأصلحها في 4% من البارافوريد لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- Permeabilize MYOD1-UDCs في المنظفات غير الأيونية 0.1٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومنع تلك مع مصل الماعز 10٪ لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 °C.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان تلك مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هنا، يستخدم الماوس المضاد ة dystrophin (1:30) كجسم مضاد أساسي، ويستخدم IgG المضادة للفأرة كجسم مضاد ثانوي، ويستخدم هويشت (1:10،000) لتلطيخ النوى. - صورة لوحات باستخدام المجهر الفلورسنت واستخدام محلل لsemiquantify إشارة الفلورسينس تلقائيا في كل بئر تحت نفس الحالة.
Representative Results
يمكننا جمع UDCs بسهولة وغير الغازية. شكلت UDCs مستعمرات في غضون أسبوع بعد بدء ثقافة الخلايا الأولية لاحظنا قدرة تكاثرملحوظ. كانت ثقافة UDCs واضحة ، وكان التلوث البكتيري أو الفطري نادرًا عندما تم إجراء الإجراء بشكل صحيح.
ويبين الشكل 2 صور تباين المرحلة التمثيلية لمستعمرة UDC بعد أسبوع من الثقافة الأولية(الشكل 2A)و MYOD1-UDCsبعد أسبوع من التمايز(الشكل 2B). ويبين الشكل 3 الكشف الناجح عن تخطي الأجسام الطاردة في البلدان النامية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة RT-PCR. الشكل 3A يظهر تحليل RT-PCR من dystrophin بعد العلاج oligonucleotide antisense في DZNep معالجة MYOD1-UDCs المستمدة من ذكر يبلغ من العمر 6 سنوات مع حذف exon 45-54 في الجين DMD. تم استعادة إطار القراءة المفتوحة بواسطة exon 44 تخطي. في اليوم 14 بعد التمايز، أكدنا تحريض تخطي exon بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 3B). تشير النطاقات العليا إلى المنتجات الأصلية، وتشير النطاقات السفلية إلى المنتجات التي تم تخطيها من exon 44 التي استعادت إطار القراءة المفتوح.
ويبين الشكل 4 الكشف الناجح عن الديستروفين بعد تخطي الإكسون في البلدان النامية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة النشاف الغربي بطريقة تعتمد على الجرعة. كما اكتشفنا التعبير dystrophin المستعادة باستخدام الكيمياء المناعية(الشكل 5). قمنا بقياس شدة dystrophin مع المجهر الفلورسنت 1 أسبوع بعد التضد oligonucleotide (ASO) التطفل على لوحة بئر 96(الشكل 5A). لوحظت إشارات فلورية أعلى بشكل ملحوظ في MYOD1-UDCs تعامل مع ASO مما كانت عليه في MYOD1-UDCs تعامل مع التحكم ASO(الشكل 5B).
تشير هذه النتائج إلى أن لدينا فحص جديد يمكن تقييم exon تخطي بكفاءة في MYOD1-UDCs التي تم الحصول عليها من المرضى DMD على مستوى مرنا والبروتين.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لكومة النقل لللطخة الغربية شبه الجافة. تم وضع ورقتين غارقتين في المخزن المؤقت النشاف في المحطة السلبية ، وتم تكديس ورقتين غارقتين في المخزن المؤقت فوق هذا. تم وضع الجل ، الذي تم نقعه في المخزن المؤقت ، بلطف فوق غشاء PVDF. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية للبلدان الأمريكية الموحدة. (أ)صورة تباين المرحلة من UDCs بعد أسبوع من الثقافة الأولية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. Inset: صورة مكبرة للمنطقة في المستطيل الأبيض. (ب)صورة تباين المرحلة من MYOD1-UDCs بعد أسبوع من التمايز. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التقييم الناجح لتخطي الإكسون في الخلايا المشتقة من البول (UDCs) التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة RT-PCR. (A)تحليل RT-PCR من dystrophin بعد علاج oligonucleotide المضاد للمعنى في 3-deazaneplanocin A هيدروكلوريد (DZNep) معالجة MYOD1-UDCsالمستمدة من ضمور العضلات دوشين (DMD) المريض مع حذف exon 45-54. كما عولجت MYOD1-UDCs المعالجة بـ DZNep بمعنى التحكم بتركيز 1-10 ميكرومتر كعناصر تحكم. وكانت النطاقات العليا المنتجات غير تخطي (السابقين 45-54 الحذف) التي ظلت خارج إطار القراءة. وكانت النطاقات السفلى المنتجات exon 44 تخطي (السابقين 44-54 حذف والسابق 44 تخطي) التي استعادت إطار القراءة المفتوحة. (ب)تم حساب تخطي الكفاءة على النحو (exon 44 تخطي نص molarity)/(الأصلي + exon 44 تخطي نص molarity [ملحوظ مع الأسهم]) × 100٪ باستخدام نظام الكهربوفوريس رقاقة. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبار Bonferroni المخصص لمقارنة كفاءات تخطي (n = 3 لكل مجموعة ، ****P < 0.0001). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التقييم الناجح للتخطي exon في الخلايا المشتقة من البول (UDCs) من مرضى DMD بواسطة لطخة الغربية. (A)لطخة الغربية التمثيلية لdystrophin في DZNep معالجة MYOD1-UDCs من مريض DMD مع حذف exon 45-54 بعد exon 44 تخطي. للكشف عن dystrophin، تم استخدام مكافحة dystrophin (ضد محطة C). (ب)تمت مقارنة الكثافة النسبية للعصابات التي تم تطبيعها إلى تعبير α-tubulin في الخلايا المشتقة من المريض مع وبدون علاج oligonucleotide المضادة للمعنى من خلال إجراء ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبار بونفيروني للمخصص (n = 3 لكل مجموعة، ** P < 0.01، **P < 0.001، HI = فرد صحي). وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: خرائط الحرارة من الكيمياء المناعية لdystrophin بعد العلاج oligonucleotide antisense في DZNep معالجة MYOD1- UDCs التي تم الحصول عليها من مريض DMD مع حذف exon 45-54. (أ)حذف exon 45-54 استعادة إطار القراءة المفتوحة على أساس تخطي exon من exon 44. (ب)تم قياس شدة الإشارة باستخدام مجهر الفلورسنت بعد أسبوع واحد من الانحاء المناوئ الأوليغونوكليوتيد اتلافيعلى لوحة بئر 96. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه تليها اختبار Bonferroni post hoc للمقارنة (n = 3-4 لكل مجموعة ، ****P < 0.0001). وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كاشف | حجم | التركيز النهائي |
| 2x PCR premix | 12.5 ميكرولتر | 1x |
| التمهيدي إلى الأمام | 5 pmol | 0.2 ميكرومتر |
| عكس التمهيدي | 5 pmol | 0.2 ميكرومتر |
| قالب | 80 نانوغرام | |
| الماء المقطر المعقم | ما يصل إلى 25 ميكرولتر | |
| إجمالي الحجم لكل رد فعل | 25 ميكرولتر |
الجدول 1: خليط لتضخيم MYOD1 بواسطة RT-PCR.
| 98 درجة مئوية | 10 s | |
| 55 درجة مئوية | 10 s | } 35 دورة |
| 72 درجة مئوية | 10 s |
الجدول 2: ظروف الدور الحراري لتضخيم MYOD1.
| كاشف | حجم |
| 10x K المخزن المؤقت | 2 ميكرولتر |
| ناقل مضاد للفيروسات الرجعية (500 نانوغرام/ميكرولتر) | 2 ميكرولتر |
| إنزيم تقييد 1 (2-15 U) | 1 ميكرولتر |
| إنزيم تقييد 2 (2-15 U) | 1 ميكرولتر |
| الماء المقطر المعقم | 14 ميكرولتر |
| إجمالي الحجم | 20 ميكرولتر |
الجدول 3: خليط لأنبوب لهضم ناقلات الفيروس الرجعي.
| كاشف | حجم |
| جزء MYOD1 منقى | 100 نانوغرام |
| ناقل فيروس الرجعية المهضوم | 100 نانوغرام |
| 5x إنزيم premix | 4 ميكرولتر |
| الماء المقطر المعقم | ما يصل إلى 20 ميكرولتر |
| إجمالي الحجم | 20 ميكرولتر |
الجدول 4: خليط لتفاعل الاستنساخ في الانصهار.
| حل | حجم / رد فعل (μL) | التركيز النهائي |
| مياه خالية من RNase | متغير | - |
| المخزن المؤقت RT-PCR من خطوة واحدة | 4 | 1x |
| مزيج dNTP (يحتوي على 10 mM من كل dNTP) | 0.8 | 400 mM من كل dNTP |
| التمهيدي إلى الأمام (10 mM) | 1.2 | 0.6 متر متر |
| التمهيدي العكسي (10 mM) | 1.2 | 0.6 متر متر |
| مزيج إنزيم RT-PCR من خطوة واحدة | 0.8 | - |
| مثبط RNase (اختياري) | متغير | 5-10 وحدات/رد فعل |
| قالب الحمض النووي الريبي | 50-400 نانوغرام | |
| إجمالي الحجم | 20 |
الجدول 5: المركبات اللازمة لرد فعل واحد من RT-PCR من خطوة واحدة.
| دورة واحدة | النسخ العكسي | 30 دقيقة | 50 درجة مئوية |
| دورة واحدة | الخطوة الأولية لتنشيط PCR | 15 دقيقة | 95 درجة مئوية |
| دورة واحدة | التسخ | دقيقة واحدة | 94 درجة مئوية |
| الصلب | دقيقة واحدة | 60 درجة مئوية | |
| ملحق | دقيقة واحدة | 72 درجة مئوية | |
| دورة واحدة | التمديد النهائي | 7 دقيقة | 72 درجة مئوية |
| عقد | ∞ | 4 درجات مئوية |
الجدول 6: حالة الدراجات الحرارية لـ RT-PCR من خطوة واحدة.
| كاشف | حجم |
| البروتين (15 ميكروغرام) | 10 ميكرون لتر |
| نموذج المخزن المؤقت (4x) | 5 ميكرولتر |
| تقليل عامل (10x) | 2 ميكرولتر |
| المياه المنزوعة المؤنة | 3 ميكرولتر |
| إجمالي الحجم | 20 ميكرولتر |
الجدول 7: إعداد عينات لكبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE).
Discussion
هنا ، ونحن نصف بروتوكول مفصل من تخطي exon في MYOD1تحويلUDCs التي تم الحصول عليها من مرضى DMD. باستخدام نظام الفحص ، قمنا بفحص تسلسلات antisense المثلى بكفاءة. نفترض أن MYOD1-تحويل UDCs يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.
لا غنى عن تقييم تخطي الطاردة الخاصة باستخدام الخلايا المشتقة من المريض على مستوى مرنا لفحص الأدوية الجديدة وتقييم أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية. يمكن تقييم حساب كفاءة تخطي exon فقط على مستوى مرنا.
تقييم تخطي exon على مستوى البروتين مهم أيضا لأن استعادة dystrophin مهم كعلامة بيولوجية بديلة للتنبؤ بفوائد تخطي exon. حتى الآن، يتم إجراء فحص تسلسل القلة antisense غالباباستخدام خطوط الخلايا العضلية الأولية أو خلدت خطوط الخلية myoblast بما في ذلك خلايا rhabdomyosarcoma البشرية (RD)، ولكن لا يمكننا قياس انتعاش مستويات dystrophin باستخدام خطوط الخلايا العضلية أو خطوط الخلايا RD لأنها تعبر عن هذا البروتين داخليا. يمكننا الكشف بوضوح عن استعادة dystrophin في DMD المشتقة من MYOD1- UDCs بطريقة تعتمد على الجرعة. في المقالدينا الجديد، نعتبر أن تقييم البروتين المستعاد من قبل النشاف الغربي يتفوق في قابلية القياس الكمي. من ناحية أخرى ، يعد التقييم عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام 96 لوحة بئر مثاليًا لفحص العديد من المركبات المرشحة في وقت واحد.
في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل لكفاءة النمذجة DMD العضلات باستخدام MYOD1-تحويلUDCs جنبا إلى جنب مع RT-PCR، النشاف الغربي، والكيمياء المناعية لتقييم dystrophin المستعادة في mRNA ومستويات البروتين بعد تخطي exon. يمكن جمع UDCs بشكل غير جراحي وبسهولة. لذلك ، نفترض أنه يمكن تطبيق الإمكانية المختبرية الجديدة على مجموعة واسعة من الدراسات الأساسية والانتقالية بغض النظر عن نوع الاضطرابات العضلية.
Disclosures
المركز الوطني لعلم الأعصاب والطب النفسي الآن تطوير NS-065/NCNP-01، وهو exon 53 تخطي المخدرات لDMD، مع نيبون شينياكو المحدودة.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز المنح العلمية في مجال البحث العلمي [المنحة رقم 18K07544 إلى Y.A.] منح في المعونة للبحوث المتعلقة بالاضطرابات العصبية والعقلية [منحة رقم 28-6 إلى Y.A.] ، والوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية [منح Nos. 18ek0109239h0002، 18lm03066h0001، و 18lm0203069h0001 إلى Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
