Summary
I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af Duchenne muskelsvind muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeurin-afledte celler til at evaluere restaureringen af dystrophin mRNA og protein niveauer efter exon springe.
Abstract
Duchennemuskeldystrofi (DMD), en progressiv og dødelig muskelsygdom, er forårsaget af mutationer i DMD-genet, der resulterer i fravær af dystrophin protein. Til dato har vi gennemført en investigator-initieret første-i-human undersøgelse på National Center of Neurology and Psychiatry baseret på den systemiske injektion af morpholino oligonukleotider, som er tilbøjelige til exon-53 springe. Til effektiv behandling af DMD anses in vitro-test med myoblaster fra DMD-patienter for at screene lægemidler og vurdere patientens berettigelse, før de kliniske forsøg udføres, for at være afgørende. For ganske nylig rapporterede vi en ny MYOD1-konvertereturin-afledte celle (UDC) behandlet med histon methyltransferase hæmmer (3-deazaneplanocin A hydrochlorid), som en cellulær model af DMD. Den nye autologe UDC kan vise fænokopi af de sygdomsspecifikke fænotyper af DMD, hvilket fører til anvendelse af præcisionsmedicin i en række muskelrelaterede sygdomme. I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af DMD muskelceller ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs sammen med omvendt transkriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR), Vestlige blotting, og immuncytokemi at evaluere restaurering af dystrophin mRNA og protein niveauer efter exon springe.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv, dødelig muskelsygdom, er forårsaget af frame-shift mutationer i DMD genet, der resulterer i fravær af dystrophin protein1. Antisense oligonukleotid-baserede exon springe terapi menes at være lovende for DMD. Denne behandling er baseret på omdannelsen af severer DMD fænotype til mildere Becker muskelsvind-lignende fænotype ved at ændre pre-mRNA splejsning at genoprette DMD læsning ramme2. Vi har for nylig afsluttet en første-i-human undersøgelse baseret på gentagen intravenøs administration af fosforrodiamidat morfoolino oligomer (PMO) viltolarsen, som kan fremkalde exon 53 springer i DMD, og viste en fremragende sikkerhedsprofil, lovende effekt, og acceptable farmakokinetiske parametre (registreret som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Men for at udvikle omkostningseffektive og effektive behandlinger for sygdommen er in vitro-test ved hjælp af primære muskelceller fra DMD-patienter afgørende for lægemiddelscreening og kontrol af patientens berettigelse, før der udføres kliniske forsøg, samt biomarkører, der afspejler effekten af exon-overspringningsbehandlinger under forsøg4på mennesker. For ganske nylig, vi rapporterede en ny teknologi til at udvikle patient-specifikke MYOD1-konverteredeurin-afledte celler7(UDCs)5,,6 som en primær myoblast model af DMD 7 . Således, at generere myoblasts, kun indsamling af urin fra patienter er påkrævet, og ingen invasiv procedure er nødvendig. I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af DMD muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs behandlet med 3-deazaneplanocin En hydrochlorid til at evaluere den restaurerede dystrophin mRNA og protein efter exon spring.
Protocol
Den etiske komité under Det Nationale Center for Neurologi og Psykiatri godkendte denne undersøgelse (godkendelses-id: A2017-018, A2018-029). Alle personer gav informeret samtykke, før de leverer urin. Alle forsøg blev udført i henhold til de relevante retningslinjer og bestemmelser.
1. Isolation og primær kultur AF UDCs
BEMÆRK: UDCs blev isoleret i henhold til en tidligere offentliggjort protokol8,9,10 med nogle ændringer.
- Indsaml urinprøver under spontan micturition i steriliserede plastflasker.
BEMÆRK: Sterilisering af den eksterne urethral åbning er ikke nødvendig. Midstream urin er ønskeligt at reducere risikoen for viral forurening. Hvis lagertiden før næste procedure er >1 h, overføres urinprøver til 4 °C for at bevare cellens levedygtighed. En temperatur på <4 °C bør dog undgås, da der kan forekomme uopløselige udfælditter. - Hele urinprøven centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten, så der efterlades 1 ml i røret.
- Resuspender pillerne individuelt i de resterende 1 ml urin og opsamles derefter i et enkelt 50 ml rør.
- Der tilsættes 10 ml vaskebuffer bestående af 99 ml PBS uden calcium og magnesium, 1% penicillin/streptomycin (P/S), 0,5 μg/ml amphotericin B, og prøverne centrifugeres ved 200 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten, så der er 0,2 ml i røret.
- Resuspender cellepillerne i 4,5 ml primærmedium, der består af en 1:1 blanding af dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) uden natriumpyruvat og Hams F-12 næringsstofblanding suppleret med rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF), insulin, hydrocortison, adrenalin, T3, transferrin, 10% tetracyklinfrit fosterkvægserum (FBS), 1% P/S og 0,5 μg/ml amphotericin B.
- Frø cellerne i tre brønde af gelatine-belagt seks godt plader (samlede volumen af hver brønd, 1,5 ml). Dyrkning befugtet ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Tilføj 1,5 ml af det primære medie dagligt i de næste 3 dage.
- På dag 4 skal mediet udskiftes med et vækstmedium på 1,5 ml suppleret med rekombinant human EGF, insulin, hydrocortison, adrenalin, T3, transferrin, 15% tetracyclin-fri FBS, 0,5% L-alanin-L-glutamin, 0,5% ikke-essentielle aminosyrer, og 2,5 ng/ml fibroblast vækstfaktor-grundlæggende (bFGF), rekombinant human trombocyt-afledt vækstfaktor (PDGF), EGF, og 1% P / S.
- Skift vækstmediet hver anden dag.
BEMÆRK: UDC kolonier vises inden for en uge. - Når UDC-kulturen bliver 80−90% sammenflydende, fjernes medium- og vaskecellerne med PBS, opdeles alle cellerne ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA og frø ved 3.000-5.000 celler/cm2 på en ny gelatinebelagt 60 mm skål (passage 1).
BEMÆRK: UDC'erne kan opbevares i flydende nitrogen. UDC'er er normalt opdelt ved 60−70% sammenløb i 60 mm kulturskål i tre stamrør.
2. Retroviral konstruktion
- Forske i kodningsområdet MYOD1 (NM_002478.4) plasmid ved polymerasekædereaktion (PCR).
BEMÆRK: Blandingen til MYOD1-forstærkning og betingelserne for den termiske cycler er vist i henholdsvis tabel 1 og tabel 2. - Detekter er et enkelt bånd på ca. 1.000 bp-størrelse med 0,7% agarose gel elektroforese ved hjælp af 1 μL af det forstærkede PCR-produkt for at bekræfte, at MYOD1-sekvensen forstærkes med succes.
- Rengør PCR-produktet ved hjælp af oprydningssættet, og bestem dets koncentration med et spektrofotometer.
- Blandingen inkuberes som vist i tabel 3 ved 37 °C natten over for at fordøje retroviral vektor med et Tet-on-system og puromycinresistent gen på restriktionsenzymmålrettede regioner i multiplekloningsstedet.
- Detekterer et enkelt bånd med 0,7% agarose gel elektroforese ved hjælp af 1 μL af det fordøjede produkt for at bekræfte, at den retrovirale vektor blev fordøjet med succes.
- Rengør det fordøjede produkt ved hjælp af oprydningssæt, og bestem dets koncentration ved hjælp af spektrofotometer.
- At klone det forstærkede MYOD1-fragment (produceret ved trin 2.1-2.3) i den fordøjede retrovirale vektor (produceret ved trin 2.4−2.6) udføre en kloningsreaktion i fusion. Reaktionen opsættes som vist i tabel 4, og reaktionen inkuberes i 15 minutter ved 50 °C, og anbring den derefter på is.
- Udfør transformation ved hjælp af E. coli kompetente celler i henhold til producentens anvisninger (Tabel af materialer).
- De transformerede kompetente celler vælges ved dyrkning på en LB-kulturplade bestående af 10 g/L bacto tryptone, 5 g/L bacto gærekstrakt, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar og 50 mg/L ampicillin.
- Pick up den valgte koloni og kultur i LB kultur medium uden bacto agar ved 200 rpm ved 37 °C natten over.
- Rens myod1-indsatteretrovirale vektorer ved hjælp af et plasmidrensningssæt ( Materialetabel ) ogkvantificeresved hjælp af et spektrofotometer.
- Kontroller, at MYOD1 er korrekt indsat i den retrovirale vektor ved direkte sekvensering af PCR-produktet forstærket af henholdsvis fremad- og bakprimere på begge sider på tværs af den indsatte MYOD1-sekvens.
BEMÆRK: MYOD1-sekvensen kan detekteres klemt inde mellem retrovirale vektorsekvenser, når kloning i fusion er vellykket. - Til retroviral produktion ser esibiliteten ved 50.000 celler/cm2 på 10 cm kollagenbelagte plader og kultur i DMEM med 10% FBS befugtet ved 37 °C og 5% CO2 for 24 timer.
- Når emballagecellerne formeresig til 80% sammenblanding, blandes 30 μg MYOD1-indsatte retrovirale vektorer, 30 μg emballagevektorer og transfektionsreagens indeholdende cellegennemtrængende peptid ( Materialetabel ) ved vortexing oginkuberesi 10 min.
- Den inkuberede blanding til emballagens medium og dyrkningen lægges befugtet ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Kollagen belægning er nødvendig. Transfection kan være bedre ved 24 timer eller mere efter såning, fordi emballageceller let kan løsne sig fra dyrkningspladen. - Efter 4 timer eller natten over, ændre medium til frisk vækst medium.
- Opsaml den virale supernatant og erstatte med frisk medium på 24 og 48 h efter cotransfection og kombinere supernatant.
- For at koncentrere det virale supernatant blandes det med koncentratorreagensog inkuberes ved 37 °C natten over og derefter centrifugeres ved 1.500 x g i 45 min. ved 4 °C.
- Retrovirus supernatanten filtreres gennem et PVDF-filter med 0,45 μm porer.
- Kontroller titeren for den retrovirale vektor ved hjælp af et kvantitativt PCR-kit og termisk cyclersystem i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Opdel det virale supernatant i små aliquots og masser dem ved -80 °C.
3. Infektion med MYOD1-retroviralvektor i UDCs
- Seed UDC'erne ved 3.000-5.000 celler/cm2 på en gelatinebelagt 60 mm skål.
- Efter 24 timers såning inficeres optøet retrovirus (trin 2.21) ved en mangfoldighed af infektion på 200 ved tilsætning af hexadimethrinbromid i en koncentration på 8 μg/ml.
- Efter en 24 timers inkubation befugtet ved 37 °C og 5% CO2erstattes dyrkningsmediet med frisk vækstmedium, der indeholder 1 μg/ml puromycin, for at vælge myod1-transinduceredeceller. Skift mediet hver anden dag.
BEMÆRK: Ved valg af MYOD1-positiveceller anvendes 1 μg/ml puromycin normalt til valg. Den passende dosis skal bestemmes. Brug en plade, der indeholder uforsonlige celler, og vælg den dosis, der dræber alle cellerne på 3−5 dage. MYOD1-positiveceller skal vælges inden for 7−10 dage efter tilsætning af puromycin. MYOD1-transduceretUDCs kan opbevares i flydende nitrogen.
4. Myogen differentiering af MYOD1-transduceret UDCs behandlet med 3-deazaneplanocin A hydrochlorid (DZNep)
BEMÆRK: For nylig er det blevet rapporteret, at DZNep, en hisone methyltransferase hæmmer, kunne i væsentlig grad fremme udtrykket af MYOGENIN, en af de sene muskel regulerende faktorer, og også føre til myotube differentiering7.
- Plade MYOD1-transduceret UDCs i kollagen-belagt brønde ved en massefylde på 3,5 x 104 celler / cm2. Kultur befugtet ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter 24 timer ændres vækstmediet til differentieringsmediet, der består af dmem med høj glukose med L-alanin-L-glutamin, 5% hesteserum, ITS-supplement, 1 μg/ml doxycyclin og 5 μM DZNep.
BEMÆRK: 10 mM DZNep-opløsningen kan opbevares ved -80 °C i 3 måneder. Brug en afrimningsfryser, og undgå gentagne fryse-tø-cyklusser. Både MYOD1 aktiveret af doxycyklin og DZNep undertrykke spredning og fremme myogenic differentiering af UDCs. Det anbefales derfor, at doxycyklin og DZNep tilsættes efter induktion af myogen differentiering. DZNep fremmer myogenic differentiering af MYOD1-UDCsi en dosis-afhængig måde. På den anden side, det viser cytotoksicitet ved en høj koncentration. Derfor bestemmes den passende koncentration af DZNep, der spænder fra 1−10 μM afhængigt af dets virkninger på myogen differentiering og cellulær biotilgængelighed. - Efter 3 dage ændres differentieringsmediet til frisk differentieringsmedium uden DZNep. Derefter skal du skifte mediet hver 3.
BEMÆRK: UDCs smelter sammen og danner myorør inden for 1-2 uger efter differentiering.
5. Exon springer i MYOD1-konverteredeUDCs
BEMÆRK: Her er tre protokoller beskrevet for at evaluere exon spring i patient-afledte celler: 1) omvendt transkripase polymerase kædereaktion (RT-PCR) af dystrophin mRNA; 2) semikvantificering af restaureret dystrophin protein signal af vestlige blot; og 3) semikvantificering af restaureret dystrophin fluorescens signal ved immuncytokemi. Alle metoder kan opdage exon springe i en dosis-afhængig måde.
- Evaluering af exon springe effektivitet ved RT-PCR
- At transfect antisense oligonukleotid (ASO) i MYOD1-konverteretUDCs fremstillet af DMD patienter på dag 7 efter differentiering, bland ASO, transfektionreagens (Tabel af materialer), og differentiering medium til en endelig koncentration på 1−10 μM. Kultur befugtet ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter 72 timers inkubation med ASO ændres mediet til frisk differentieringsmedium uden ASO.
- Fra 3−7 dage efter ASO-transfektion fjernes differentieringsmediet og vaskes 1x med PBS. Tilføj celle lysis buffer, lyse UDCs og høste den samlede RNA ved hjælp af en RNA ekstraktion kit.
- RNA-koncentrationen måles med et spektrofotometer.
- Kombiner de nødvendige reagenser til et-trins RT-PCR-reaktion i PCR-rør i henhold til tabel 5.
- Placer PCR-rørene med blandingen i en termocycler. Kør termocycleren i henhold til tabel 6.
- Udfør mikrochip elektroforese og beregne exon springe effektivitet ved hjælp af molære koncentration som nedenfor.
Exon springer effektivitet (%) = sprunget band / (sprunget band + ikke-sprunget band) x 100
BEMÆRK: Opbevar PCR-produktet i køleskab ved 4 °C til kortvarig opbevaring eller -20 °C til langtidsopbevaring.
- Påvisning af dystrophin efter exon springe af vestlige blotting
- Transfect ASO og kultur MYOD1-UDCs i henhold til trin 5.1.1 og 5.1.2.
- Skift mediet hver 3.
- Efter 2 ugers differentiering udvindes det samlede protein fra de dyrkede celler ved hjælp af radioimmunonedbørsassay (RIPA) buffer indeholdende proteasehæmmere.
- Lysatet på is og centrifuge ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overvænningen indsamles, og proteinkoncentrationerne bestemmes ved hjælp af et BCA-proteinanalysesæt.
- Der tilsættes 15 μg samlet protein i et 0,5 ml rør og fortyndes ved tilsætning af RIPA-bufferen, der indeholder proteaser, til et samlet volumen på 10 μL. Kør 15 μg samlet protein pr. vognbane.
- Der tilsættes prøvebuffer, reduktionsmiddel og deioniseret vand som vist i tabel 7. Denaturere cellen lysater ved 70 °C i 10 min.
- Tris-acetatløbebufferen indeholdende 8,95 g/L tricin, 6,06 g/L tris base, 1,0 g/L natriumdodecylsulfat (SDS).
- Prøven (20 μL) anbringes på tris-acetat 3−8% gel, og elektroforese udføres ved 150 V i 75 min.
- Klargør blottingbufferen uden methanol.
- Iblødsætning PVDF membranen i 20 s i methanol og derefter i blotting buffer indtil brug (mindst 10 min). Skær PVDF membranen til en størrelse på 6 x 8 cm ved hjælp af mini geler og 8 x 12 cm ved hjælp af midi geler.
- Skær blotting papirer til samme størrelse som PVDF membran og sættetid dem i blotting buffer indtil brug.
- Efter elektroforese skæres gelen til samme størrelse som PVDF-membranen og suge gelen i destilleret vand.
- Placer blotting papir, PVDF membran, og gel på den halvtørre overførselsapparat (Figur 1). Overføres ved 4 mA/cm2 i 30 min.
- Skyl membranen 2x med destilleret vand.
- Der fremstilles anti-dystrophin (1:500) og anti-α-tubulin (1:1.200) antistof som de primære antistoffer.
- Forbered HRP-konjugeret antimuseantistof (1:100) som et sekundært antistof.
- Inkubermembranerne med de primære antistoffer, vaskes med vaskebuffer, og inkuber derefter med det sekundære antistof ved hjælp af en automatiseret vestligt behandlingsanordning (Materialetabel) ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Anti-α-tubulin antistof anvendes normalt som belastningskontrol. De blandede primære antistofopløsninger, herunder 1:500 anti-dystrophin og 1:1.200 anti-α-tubulinantistoffer fungerer godt, når antistofreaktionen udføres samtidigt. - Skyl membranen i destilleret vand.
- Detekter proteinerne ved hjælp af chemiluminescerende detektionsreagens og en ccd-kamerabaseret billedmaskine (charge-koblet enhed).
- Analysér dataene ved hjælp af passende software.
- Påvisning af dystrophin efter exon springer af immuncytokemi
- Direkte omprogrammere UDCs i myotubes i kollagen-belagt 96 godt plade i henhold til trin 4.1−4.3.
- Transfect ASO og kultur MYOD1-UDCs i henhold til trin 5.1.2 og 5.1.3.
- Efter 2 ugers differentiering vaskes cellerne med PBS og ihændeskrives i 4% paraformaldehyd i 10 min ved 4 °C.
- Permeabilize MYOD1-UDCs i 0,1% nonionic vaskemiddel i 10 min ved stuetemperatur og blokere dem med 10% gedeserum i 15 min ved 37 °C.
- Cellerne inkuberes med et primært antistof natten over ved 4 °C.
- Cellerne vaskes med PBS, og inkuber dem med det sekundære antistof i 30 min. ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Her anvendes museanti-dystrophin (1:30) som det primære antistof, antimuse-IgG anvendes som sekundært antistof, og Hoechst (1:10.000) anvendes til kerner. - Image pladerne ved hjælp af en fluorescerende mikroskop og bruge en analysator til semiquantify fluorescens signalet automatisk i hver brønd under samme tilstand.
Representative Results
Vi kunne indsamle UDCs nemt og ikke-invasivt. UDCs dannede kolonier inden for en uge efter start primær cellekultur vi observeret en markant proliferative evne. Kulturen i UDCs var ligetil, og bakteriel eller svampeforurening var sjælden, når proceduren blev udført korrekt.
Figur 2 viser repræsentative fasekontrastbilleder af UDC-kolonien en uge efter primærkulturen (figur 2A) og MYOD1-UDC'er en uge efter differentiering (Figur 2B). Figur 3 viser den vellykkede påvisning af exon spring i UDCs opnået fra DMD patienter ved RT-PCR. Figur 3A viser RT-PCR-analyse af dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i DZNep-behandlet MYOD1-UDCs stammer fra en 6-årig mand med en exon 45-54 sletning i DMD genet. Den åbne læseramme blev restaureret af exon 44 spring. På dag 14 efter differentiering, bekræftede vi induktion af exon springe i en dosis-afhængig måde (Figur 3B). De øverste bånd angiver oprindelige produkter, og de nederste bånd angiver exon 44-sprunget produkter, der restaurerede den åbne læseramme.
Figur 4 viser den vellykkede påvisning af dystrophin efter exon springer i UDCs opnået fra DMD patienter ved Western blotting i en dosis-afhængig måde. Vi har også opdaget den restaurerede dystrophin udtryk ved hjælp af immuncytokemi (Figur 5). Vi målte intensiteten af dystrophin med et fluorescerende mikroskop 1 uge efter antisense oligonukleotid (ASO) transfection på en 96 brøndplade (Figur 5A). Markant højere fluorescerende signaler blev observeret i MYOD1-UDCs behandlet med ASO end i MYOD1-UDCs behandlet med kontrol ASO (Figur 5B).
Disse resultater tyder på, at vores nye analyse kan evaluere exon springe effektivt i MYOD1-UDCsopnået fra DMD patienter på mRNA og protein niveau.
Figur 1: Skematisk repræsentation af overførselsstakken for halvtørt western blot. To papirer dyppet i blotting buffer blev fastsat på den negative terminal, og to papirer dyppet i bufferen blev stablet oven på dette. Gelen, som er blevet gennemblødt i bufferen, blev lagt forsigtigt over PVDF membranen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af UDC'erne. (A) Fasekontrastbillede af UDC'er en uge efter primærkulturen. Skalabjælke = 200 μm. Indsat: Et forstørret billede af området i det hvide rektangel. (B) Fase-kontrast billede af MYOD1-UDCsen uge efter differentiering. Skalabar = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Takizawa et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vellykket evaluering af exon spring i urin-afledte celler (UDCs) fremstillet af DMD patienter ved RT-PCR. (A) RT-PCR-analyse af dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i 3-deazaneplanocin A hydrochlorid (DZNep)-behandlet MYOD1-UDCs stammer fra Duchenne muskeldystrofi (DMD) patient med en exon 45-54 sletning. DZNep-behandlet MYOD1-UDCs blev også behandlet med kontrol antisense ved 1-10 μM koncentration som kontrol. De øverste bånd var ikke-sprunget produkter (Ex 45-54 sletning), der forblev ude af læserammen. De lavere bånd var exon 44-sprunget produkter (Ex 44-54 sletning og Ex 44 sprunget), der restaurerede den åbne læseramme. (B) Spring effektivitet blev beregnet som (exon 44-sprunget udskrift molaritet)/(native + exon 44-sprunget udskrift molaritet [markeret med pile]) x 100% ved hjælp af en mikrochip elektroforese system. Envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis post hoc-test blev anvendt til at sammenligne springeeffektiviteten (n = 3 for hver gruppe, ****P < 0,0001). Dataene udtrykkes som den gennemsnitlige ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Takizawa et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vellykket evaluering af exon spring i urin-afledte celler (UDCs) fra DMD patienter ved Western blot. (A) Repræsentant Vestlige blot for dystrophin i DZNep-behandlede MYOD1-UDCs fra DMD patient med en exon 45-54 sletning efter exon 44 springe. Til dystrophindetektion blev der anvendt anti-dystrophin (mod C-terminal). (B) De relative intensiteter af de bånd, der normaliseres til α-tubulinekspression, blev sammenlignet i patientafledte celler med og uden antisense oligonukleotid behandling ved at udføre envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis post hoc-test (n = 3 for hver gruppe, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI = sund person). Dette tal er blevet ændret fra Takizawa et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Heatmaps af immuncytokemi for dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i DZNep-behandlet MYOD1-UDCs fremstillet af DMD patient med exon 45-54 sletning. (A) Sletning af exon 45-54 restaureret den åbne læseramme baseret på exon springe af exon 44. (B) Signalintensiteten blev kvantificeret ved hjælp af et fluorescerende mikroskop efter 1 uges antisense oligonukleotid transfection på en 96 brøndplade. Envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis post hoc-test blev anvendt til sammenligning (n = 3-4 for hver gruppe, ****P < 0,0001). Dette tal er blevet ændret fra Takizawa et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Volumen | Endelig koncentration |
| 2x PCR forblanding | 12,5 μL | kr. |
| Fremad primer | 5 pmol | 0,2 μM |
| Omvendt primer | 5 pmol | 0,2 μM |
| Skabelon | 80 ng | |
| Steriliseret destilleret vand | op til 25 μL | |
| Samlet volumen pr. reaktion | 25 μL |
Tabel 1: Blanding til MYOD1-forstærkning efter RT-PCR.
| 98 °C | 10 s | |
| 55 °C | 10 s | } 35 cyklusser |
| 72 °C | 10 s |
Tabel 2: Betingelser for den termiske cycler til MYOD1-forstærkning.
| Reagens | Volumen |
| 10x K buffer | 2 μL |
| Retroviral vektor (500 ng/μL) | 2 μL |
| Restriktionsenzym 1 (2−15 U) | 1 μL |
| Restriktionsenzym 2 (2−15 U) | 1 μL |
| Steriliseret destilleret vand | 14 μL |
| Volumen i alt | 20 μL |
Tabel 3: Blanding af et rør til at fordøje retroviral vektor.
| Reagens | Volumen |
| Renset MYOD1 fragment | 100 ng |
| Fordøjet retroviral vektor | 100 ng |
| 5x Enzym forblanding | 4 μL |
| Steriliseret destilleret vand | op til 20 μL |
| Volumen i alt | 20 μL |
Tabel 4: Blanding af kloningsreaktionen i forbindelse med infusion.
| Løsning | Volumen/reaktion (μL) | Endelig koncentration |
| RNase-frit vand | Variabel | - |
| Et-trins RT-PCR-buffer | 4 | kr. |
| dNTP-blanding (indeholdende 10 mM af hver dNTP) | 0.8 | 400 mM af hver dNTP |
| Fremadprimer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Omvendt primer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Et-trins RT-PCR enzymmix | 0.8 | - |
| RNase-hæmmer (valgfrit) | Variabel | 5−10 enheder/reaktion |
| Skabelon RNA | 50−400 ng | |
| Volumen i alt | 20 |
Tabel 5: Nødvendige forbindelser til en reaktion af et-trins RT-PCR.
| 1 cyklus | Omvendt transskription | 30 min. | 50 °C |
| 1 cyklus | Første PCR-aktiveringstrin | 15 min. | 95 °C |
| 1 cyklus | Denaturering | 1 min. | 94 °C |
| Udglødning | 1 min. | 60 °C | |
| Udvidelse | 1 min. | 72 °C | |
| 1 cyklus | Endelig forlængelse | 7 min. | 72 °C |
| Holde | ∞ | 4 °C |
Tabel 6: Termisk cycler-tilstand for et-trins RT-PCR.
| Reagens | Volumen |
| Protein (15 μg) | 10 μL |
| Eksempelbuffer (4x) | 5 μL |
| Reduktionsmiddel (10x) | 2 μL |
| Deioniseret vand | 3 μL |
| Volumen i alt | 20 μL |
Tabel 7: Præparat af prøver til natriumdodetolkpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol af exon springe i MYOD1-konverteredeUDCs opnået fra DMD patienter. Ved hjælp af analysesystemet screenede vi optimale antisense-sekvenser effektivt. Vi antager, at MYOD1-konverteredeUDCs kan være nyttige for undersøgelsen af sygdomspatofiologi.
Evaluering af exon springer ved hjælp af patient-afledte celler på mRNA-niveau er uundværlig for screening af nye lægemidler og vurdering af patientens berettigelse, før der foretages kliniske forsøg. Beregning af exon springe effektivitet kan kun evalueres på et mRNA-niveau.
Evaluering af exon springe på protein-niveau er også vigtigt, fordi dystrophin restaurering er vigtigt som en surrogat biomarkør til at forudsige fordelene ved exon springe. Til dato, screening af antisense oligonukleotid sekvenser udføres ofte ved hjælp af primære muskel cellelinjer eller udødeliggjort myoblast cellelinjer, herunder menneskelige rhabdomyosarcoma (RD) celler, men vi kan ikke måle inddrivelse n af dystrophin niveauer ved hjælp af muskel cellelinjer eller RD cellelinjer, fordi de udtrykker dette protein endogent. Vi kan tydeligt opdage restaurering af dystrophin i DMD patient-afledt MYOD1-UDCsi en dosis-afhængig måde. I vores nye analyse mener vi, at evalueringen af genoprettet protein ved western blotting er overlegen i kvantificerbarhed. På den anden side, evaluering ved immuncytokemi ved hjælp af 96 godt plader er ideel til screening mange kandidat forbindelser samtidigt.
I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for en effektiv modellering DMD muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs sammen med RT-PCR, Western blotting, og immuncytochemistry at evaluere den restaurerede dystrophin på mRNA og protein niveauer efter exon springe. UDCs kan indsamles noninvasively og nemt. Derfor antager vi, at den helt nye in vitro-analyse kan anvendes på en bred vifte af grundlæggende og translationelle undersøgelser uanset typen af muskelforstyrrelser.
Disclosures
National Center of Neurology and Psychiatry er nu ved at udvikle NS-065/NCNP-01, en exon 53 springe stof til DMD, med Nippon Shinyaku Co, Ltd.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [grant no. 18K07544 til Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [grant no. 28-6 til Y.A.], og Japan Agency for Medical Research and Development [grant nos. 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 og 18lm0203069h0001 til Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
